Name: Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Proteomik-Protokollierung von FFPE-Geweben mittels Laser-Mikrodissektion, FASP und SAX-Fraktionierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von bis zu 10.000 Proteinen aus minimalen klinischen Proben.

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Der Autor dankt Dr. Matthias Mann für die kontinuierliche Unterstützung und Frau Katharina Zettl zur Demonstration der Methode. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften unterstützt.

1. Besetzung Pflicht <ol><li> Herstellung von Gewebeschnitten für die Mikrodissektion und Proben Lyse <ol><li> Thermoblock auf 99 ° C oder ein Bad mit kochendem Wasser gesetzt. </li><li> Laser Betriebs Microdissector (zB PALM, Zeiss, Göttingen, Deutschland). </li><li> Temperiert Tischzentrifuge, Temperatur auf 20 ° C eingestellt </li><li> Wet Kammer (Box) mit einem Rack für Eppendorf-Röhrchen Typ Verfügung. </li><li> Brutschrank auf 37 ° C eingestellt </li><li> Spectrofluorometer ermöglicht Messung der Fluoreszenz in der Nähe von UV-Licht angeregt mit Mikro-Skala Quarzküvetten (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Lösungen <ol><li> &quot;Tissue Lysis Buffer (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w / v) Polyethylenglykol 20.000 und 4% SDS. </li><li> UA-Lösung: 8 M Harnstoff in 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Bereiten 1 ml pro 1 Probe. UA und IAA-Lösungen müssen frisch zubereitet und innerhalb eines Tages verwendet werden. </li><li> IAA-Lösung: 0.05 M iodoacetamide in UA. Bereiten Sie 0,1 ml pro 1 Probe. </li><li> Endoproteinase Lys-C-, Lager-Lösung. </li><li> Trypsin-Stammlösung. </li><li> &quot;Aufschlusspuffer &#39;(DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Bereiten 0,25 ml pro 1 Probe. </li><li> &quot;Tryptophan-Standardlösung &#39;: 0,1 ug Tryptophan in 1 ml VE-Wasser. </li><li> &quot;Assay Puffer B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Stammlösung von Britton &amp; Robinson Universal-Buffer (BRUB). Eine Lösung, die 0,1 M CH &amp;sub3; COOH, 0,1 MH 3 PO 4, und 0,1 MH 3 BO 3, und stellen mit 1 M NaOH auf den gewünschten pH-Wert (2, 4, 5, 6 und 11). Vor Gebrauch verdünnen 5-fach mit VE-Wasser. </li><li> Puffer A: 1% (v / v) CH 3 COOH in entionisiertem Wasser. </li><li> Puffer B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in entionisiertem Wasser. </li></ol> 3. Pipettenspitze und &#39;StageTip&#39; Spalten <ol><li> Bereiten Spitze SAX-Säule durch Stapeln 6 Lagen Empore-Anionen-Membran in einer Common 0,2 ml Pipettenspitze. Machen Sie zwei SAX-Spitze Spalten pro Probe. </li><li> Vorbereiten &quot;StageTip &#39;durch Stapeln 3 Schichten Empore-C 18 in einer 0,2 ml Pipettenspitze. Machen Stufe 6 Tipps für jede Probe. </li></ol> 4. Herstellung von Tissue-Scheiben für Microdissection Sample Lyse <ol><li> Zuschnitte mit einem Mikrotom (die Dicke der Schichten hängt von der Probe. Gewöhnlich Mikrodissektion funktioniert gut mit Scheiben von 7-10 &amp;mgr; m). </li><li> Bestrahlen Membran Objektträger (1,0 MembraneSlide PEN) mit UV-Licht für 45 min. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte über die Membran bestrahlen Rutschen und trocken bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Entparaffinieren montiert Abschnitte durch zwei aufeinanderfolgende Inkubation in Xylol für 2,5 min und 1,5 min. Rehydrieren die Abschnitte durch aufeinanderfolgende Inkubationen in absolutem Ethanol, 70% Ethanol und Wasser für jeweils 1 min. </li><li> Färben der Schnitte mit Mayers Hämatoxylin für 20 Sekunden gründlich mit Wasser für 1 min, und an der Luft trocknen. </li><li> Sammeln Sie die Zelle populatiüber Interessen mit Laser-Mikrodissektion System. Bei Verwendung der PALM Instrument (Zeiss) sammeln die Proben in den Haftkappen (Adhesive CAP 200). </li><li> Pipette einen aliquoten Teil der TLB über die mikrodissezierten Material in der Kappe. Schließen Sie das Rohr und sammeln die Suspension durch eine kurze Zentrifugation. Lyse der microdissected Gewebe bei 99 ° C in einem Heizblock unter Rühren (600 Upm) für 1 Stunde. Verwenden Sie 3 ul Puffer für 10 nl der mikrodissezierten Gewebe. </li><li> Klärung des Rohextraktes durch Zentrifugation bei 16.000 × g bei 18 ° C für 10 min. Das Lysat kann eingefroren bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 5. Probenbearbeitung <ol><li> Mischen bis zu 50 &amp;mgr; l des geklärten Lysats mit 200 ul UA in den Ultrafiltrationseinheiten (Forensic 30k) und Zentrifugation bei 14.000 × g bis weniger als 10 &amp;mgr; l der Lösung in den Filter verbleiben. Normalerweise erfordert dieser Schritt 10-15 min Zentrifugieren. </li><li> Pipettieren Sie 200 ul UA auf der Ultrafiltrationseinheitund Zentrifuge nach 5.1. Leeren Sie den Sammelröhrchen. </li><li> Je 50 ul der IAA-Lösung und Mischen bei 600 Upm in einem Thermomischer für 1 min und Zentrifuge nach 5.1. </li><li> Je 100 ul der UA auf die Ultrafiltrationseinheit und Zentrifuge nach 5.1. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal </li><li> Je 100 ul der DB in der Ultrafiltrationseinheit und Zentrifuge bei 5.1. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Übertragen Sie die Filteranlagen, neue Sammelröhrchen. Pipette 40 ul DB mit Endoproteinase Lys-C (Proteinase zum Gesamtprotein-Verhältnis von 1:100) und mischen bei 600 rpm im Thermomixer für 1 min. Die Einheiten Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 18 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Filtereinheiten bei 14.000 xg wie in 5.1. </li><li> Pipette 160 ul entionisiertem Wasser und Zentrifuge die Filtereinheiten, wie in 5.1. Die gepoolte Flow-Through-(5.7 und 5.8 Schritte) enthält die Peptide durch Endoproteinase Lys C freigesetzt </li><li> Übertragen Sie die Ultrafiltrationseinheit zu einem neuen Sammelrohr. In 40 ulDB mit Trypsin (Enzym-Protein-Verhältnis 1:100) und mischen bei 600 rpm im Thermomixer für 1 min. Die Einheiten Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 4 Stunden. Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8, die tryptischen Peptide zu sammeln. </li></ol> 6. Quantifizierung der Peptide <ol><li> Die Messung der Peptidgehalt in der Proteinverdaus in verdünnter Puffer durchgeführt werden, da die Tryptophan-Reste auch für das Lösungsmittel zugänglich sind. </li><li> Pipettieren Sie 0,2 ml ABB in die Quarz-Küvette und Aufzeichnung der Emissionsspektrum für &#39;blank&#39;. </li><li> Bereiten Eichkurve mit 0,1 ug Schritte durch Zugabe von 1 ul Aliquots von TSS in die Küvette und sanfte Mischung mit der ABB. </li><li> Reinigen Sie die Küvette. </li><li> Pipettieren Sie die Probe und das Spektrum (Probe). </li><li> Berechnung der Protein-und Peptidkonzentration Da Tryptophan entspricht 0,1 ug bis etwa 9 &amp;mgr; g Protein (bezogen auf die durchschnittliche 1,1% der Tryptophangehalt in b erhaltenen Proteingemischeny Lyse menschlicher Zellen) der Proteingehalt der in der Probe oder Peptidgehalt in dem Digest entspricht: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> wo F (Standard1) ist die Fluoreszenz von 0,1 ug Tryptophan-Standard. Der Peptidgehalt ermöglicht die Berechnung der Ausbeute der Aufschlussverfahren und liefert wichtige Informationen für die folgende Peptid-Fraktionierung und die massenspektrometrische Analyse. </li></ol> 7. Fraktionierung der Lys-C und tryptischen Peptide <ol><li> Verdünne die durch Aufschluss mit Lys-C und Trypsin mit 0,2 ml BRUB pH 11 und pH 5 jeweils erhaltenen Peptidlösungen. </li><li> Montieren Sie den SAX-Spitze Spalte in der Zentrifugenrohr-Adapter Deckel. </li><li> Waschen und equilibrieren die Spitze SAX-Säule nacheinander mit 0,1 ml Methanol, 0,1 ml 1 M NaOH und 3-mal mit 0,1 ml BRUB, pH 11 für die Trennung von Lys-C Peptiund des mit BRUB, pH 5 für die tryptischen Peptide. Die Strömung der Lösungen durch die Säule Material wird durch Zentrifugation bei 4000 x g erleichtert. </li><li> Waschen und equilibrieren die C 18 - &#39;StageTips&#39; anschließend mit 0,05 ml Methanol, dann mit 0,05 ml Puffer B mit 0,05 ml Puffer A Vorbereiten sechs C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 für die Trennung des Lys- C-Peptide und zwei zur Trennung der tryptischen Peptide. </li><li> Montieren Sie den SAX Tip-Spalte in der C 18 - &#39;StageTip. Laden Sie die Musterlösungen in die äquilibriert SAX Tip-Säulen und die Spalten Zentrifuge bei 5000 g für 3 min. </li><li> Äquilibrieren die &quot;Pipette-Spitze&quot;-Säulen mit 0,1 ml der BRUB, pH 11 oder pH-Wert 5, die jeweils mit dem Lyc-C und Trypsin-Proben. Erleichterung der Strömung durch Zentrifugation bei 5000 x g. </li><li> Übertragen Sie die SAX-Tip-Spalte in die nächste C 18 - &#39;StageTip. </li><li> Weiterhin Eluieren der Peptide mit BRUB pH 6, 4 und 2 des Lys C-Probe und BRUB pH 2 für die Probe mit tryptischen Peptide. Für jeden Schritt der Elution eine separate C 18 - &#39;StageTip. </li><li> &#39;StageTips &quot;mit 0,05 ml Puffer A. - die C-18 waschen </li><li> Eluatfraktionen mit 0,05 ml Puffer B in Ampullen zur Injektion direkt von den Proben in LC-Systems mit einem Massenspektrometer verwendet montiert. </li></ol>

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</ol>

Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Die Fähigkeit, die FFPE Material von der Proteom-Technologie bis zu einer Tiefe vergleichbar mit Nukleinsäure-Sequenzierung und Microarray-Techniken zu studieren eröffnet neue Perspektiven in der Biomarker-und Target-Entdeckung. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung und Quantifizierung des Proteoms von Populationen von Zellen microdissected auf einer Skala von 10.000 Proteinen. Bei der Verwendung von weniger der mikrodissezierten Material eine kleinere Datenmengen erzeugt werden können, aber vielleicht in vielen Fällen die können auch wertvolle klinische Daten. So können entweder die Proben direkt nach der MED-FASP Verfahren analysiert werden oder kann in weniger Fraktionen getrennt werden. Da FASP Verfahren ist mit jeder Art von Protease-kompatibel ist, können andere Enzyme oder deren Kombination aus Protein-Verdauungen 6 verwendet werden. Die Qualität des Materials FFPE scheint die kritische Ausgabe der Analyse sein. Wir haben die Erfahrung, dass die feste Gewebe des gleichen Ursprungs, aber aus unterschiedlichHNO-Kliniken hatten unterschiedliche Eigenschaften. Mit Gewebe aus einer Hand konnten wir Peptide in hohen Ausbeuten zu erzeugen, während ähnlichem Material aus einer anderen Klinik war fast nutzlos. Es ist wahrscheinlich, daß die angelegte Fixierung und Einbettung Verfahren sowie Lagerbedingungen sind die wichtigsten Faktoren, die die Eigenschaften des klinischen Materials 12. Daher ist es ratsam, die Eigenschaften von wenigen Proben vor dem Start eines größeren Projekts zu testen. Viele Veröffentlichungen über die Verwendung der FFPE Material in der Vergangenheit. Jedoch ist die Anzahl von Proteinen in diesen Studien identifizierten niemals überschritten mehr als 1,000-2,000 Proteine ​​4. In Anbetracht der Größe der menschlichen Zelle spezifische Proteome mit mehr als 10.000 Proteine ​​waren solche Untersuchungen nur in der Lage, eine sehr oberflächliche Bild, fast zu hoch vorkommenden Proteine ​​in der Hauswirtschaft beteiligten Funktionen beschränkt ist. Unser Protokoll ermöglicht eine effiziente Isolierung des klinischen oder biologischen Material from erhalten Gewebe und ist für die Lyse-, Protein-und Peptid-Verarbeitungs Vorfraktionierung optimiert. Als Folge unserer Workflow-Probenvorbereitung, wenn sie auf die High-End-Massenspektrometrie gekoppelt sind, ermöglicht Einblicke in eine fast vollständige Proteome. Bemerkenswert ist in Minute Probenmenge Anforderungen das möglich. Der große Vorteil der Verwendung der konservierten Geweben ist ihre relativ breite Verfügbarkeit. FFPE-Proben für viele Jahre und Jahrzehnte archiviert und manchmal als so nutzlos, jetzt, dank Proteomics-Technologie, erscheinen als sehr wertvolles Material für die klinische Forschung. Während viele Krankheiten können mit frischem oder gefrorenem Material Untersuchung FFPE Material untersucht werden scheint besonders wichtig für die Untersuchung seltener Krankheiten 12 zu sein, waren eine Sammlung von repräsentativen Satz von Probe dauert in der Regel eine lange Zeit.

Fixierung mit Para und Einbettung in Paraffin (FFPE) ist die Standardmethode für die Erhaltung und pathomorphologischen Untersuchung von klinischen Gewebematerial. Mikroskopie des konservierten Gewebes ermöglicht die Identifizierung der Krankheit verbundenen morphologische Veränderungen und die Detektion und Wertung des Auftretens der Krankheit verbundenen Antigenen. Da in der Regel nur ein kleiner Teil der Probe wird in FFPE diesen Analysen verwendet, große Mengen von klinischem Material bleiben archiviert und kann in anderen Typen von Untersuchungen genutzt werden. Während des letzten Jahrzehnts hat die Forschung in den Lebenswissenschaften wurde von der mächtigen Proteom-Technologie verstärkt. Diese Technologie ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von tausenden von Proteinen in komplexen Proteingemischen. Ein wichtiges Merkmal der Technologie ist, dass nur geringe Mengen an Material erforderlich sind, für die großtechnische Analysen. Jüngste Studien zeigten, dass Proteom-Proteine ​​können auf einer Skala von fast Layout untersucht werdenlete Proteome 1, 2. Untersuchungen dieser Art ermöglicht systemweite Einblicke in die Zusammensetzung der Zellen und zur Identifizierung von Gruppen von Proteinen bei anomalen Niveaus bei Erkrankungen auftritt. Diese Studien erforderlichen großen massenspektrometrischen Kapazitäten hat die jüngste Arbeit zeigte, dass ähnliche Ausdehnung Identifikation kann innerhalb eines Tages der Messung 3 erreicht werden. Das Erfordernis der relativ geringen Probenmenge und die breite Verfügbarkeit der erhaltenen klinischen Proben versucht, uns und anderen Methoden ermöglicht proteomische Erforschung der FFPE Material (für eine Übersicht siehe 4) zu entwickeln. Unter Ausnutzung der Reversibilität der Formalin-Fixierung unter einer Wärmebehandlung haben wir ein Protokoll, das quantitative Extraktion von Proteinen aus der fixierten Gewebe 5 entwickelt. Wir haben gezeigt, dass die Fixierung Verfahren schont nicht nur Proteine, sondern auch zumindest einige posttranslationale Modifikationen. Phosphorylation und N-Glykosylierung kann mit den FFPE-Proben 5, aber eine Voraussetzung dafür ist ein gut kontrolliertes Gewebe Erhebung, Speicherung und Fixierung Bedingungen untersucht werden. Als nächstes haben wir die Methode für die Laser Mikrodissektion der festen Gewebe und für die Proteom-Reaktor basierte Probenaufbereitung 6, 7 optimiert. Eine großangelegte Studie über Darmkrebs erlaubt die quantitative Analyse von 7.500 Proteinen aus aus klinischem Material 8 mikrodissektiert. Schließlich haben wir den Weg der Erforschung des mikrodissezierten Material, indem zwei aufeinander folgenden Schritt-Proteinverdauung Protokoll 9 verbessert. Im Vergleich zu den gemeinsamen Aufschluss Strategien durch einzelnes Enzym, ermöglicht dieses Verfahren Generation mehr Sequenzspezifische Peptide und damit zu einer höheren Tiefe der Proteinidentifikation. Analyse der mikrodissezierten menschlichen Dickdarm-Adenom erlaubt Proteomanalyse bis zu einer Tiefe von 9.500 Proteine ​​pro Probe 3. In diesem Gestütwir y abgebildet 55.000 Peptide pro Probe zur Identifizierung von 88-89% Proteine ​​mit mindestens 2 Peptiden. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Vorbereitung von Proben aus der FFPE Material für LC-MS/MS Analyse. Dieses Protokoll umfasst Herstellung von Gewebeschnitten zur Mikrodissektion Lysis der isolierten Zellen, und Probenverarbeitung in einem Reaktor Format (FASP) 6. Dann beschreiben wir eine spektrofluorometrischen Bestimmung der Peptidausbeuten; eine Aufgabe mit für optimale Peptididentifikation hohe Bedeutung, die die Massenspektrometrie. Schließlich zeigen wir einen starken Anionenaustauscher (SAX)-basierten Trenntechnik für Peptid-Fraktionierung. In diesem Verfahren sowohl die Peptidtrennung und endgültige Bereinigung werden mit Pipettenspitzen-Mikrosäulen 10, 11 durchgeführt. Dieser Schritt ist optional, wird jedoch in Untersuchungen, bei denen mehr als ein paar Mikrogramm Peptide können aus einer Probe erhalten werden empfohlen. Der SAX-Fraktionierung kann die Anzahl und die Dynamik von ident deutlich erhöhenkationen und verlängern die Proteinsequenzabdeckung 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Deutschland</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Klebekappe 200 opak</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Deutschland</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Mayersche Hämatoxylin-Lösung </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Deutschland</td><td>MRCF0R030</td><td>(Zuvor als Microcon YM-30 verkauft) </td></tr><tr><td>Empore Anion</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomik probenvorbereitung von formalin fixiert und in paraffin eingebetteten gewebe

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Konservierte klinischen Materials ist eine einzigartige Quelle für die proteomische Untersuchung der menschlichen Erkrankungen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das in großem Maßstab quantitative Analyse von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe. Das Verfahren umfasst vier verschiedene Schritte. Die erste ist die Herstellung von Teilen aus dem FFPE Material und Mikrodissektion von Zellen von Interesse. Im zweiten Schritt werden die isolierten Zellen werden lysiert und bearbeitet mit &#39;Filter gestützten Probenvorbereitung &quot;(FASP)-Technik. In diesem Schritt werden Proteine ​​von Reagenzien für die Lyse der Probe verwendet verarmt und in zwei Schritten mit Endoproteinase LysC und Trypsin verdaut. Nach jeder Verdauung werden die Peptide in getrennten Fraktionen gesammelt und deren Inhalte unter Verwendung eines hochempfindlichen Fluoreszenzmessung bestimmt. Schließlich werden die Peptide auf &#39;Pipettenspitze &quot;Mikrosäulen fraktioniert. Die LysC-Peptide sind in 4 Fraktionen getrennt wohingegen die tryptischen peptides in 2 Fraktionen getrennt. Auf diese Weise hergestellten Proben die eine Analyse der Proteome von Minute Mengen von Material bis zu einer Tiefe von 10.000 Proteinen. Somit ist der beschriebene Workflow eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung Krankheiten in einem System-Wide-Mode sowie für die Identifikation von potenziellen Biomarkern und Drug Targets.

Proteom-Analyse von FFPE Material erfordert robuste und reproduzierbare Methoden für die Probenvorbereitung. In dieser Veröffentlichung zeigen wir, ein Protokoll, eine effektive Isolierung von Zellpopulationen aus dem festen Material und ihre chemischen Verarbeitung, was zu hohen Reinheit Peptidfraktionen, die direkt für LC-MS/MS Analyse verwendet werden kann. Das Verfahren besteht aus vier Teilen: (1) Herstellung der Abschnitte der FFPE-Proben und deren Mikrodissektion, (2) Lyse der Probe und Verarbeitung der Proteine ​​unter Verwendung von MED FASP Ansatz, und (3) Quantifizierung und (4) Fraktionierung die Peptide (Abbildung 1). Im ersten Schritt des Verfahrens die FFPE-Proben werden mit einem Mikrotom geschnitten und auf Objektträger aufgebracht Membran bedeckt. Um die Adhäsion zwischen den Gewebeabschnitten und der Oberfläche des Schiebers Membran zu erhöhen, ist erforderlich, um die Gleitoberfläche mit UV-Licht zu bestrahlen. Zu diesem Zweck das Licht einer UV-Lampe verwenden wirin ein Zellkulturbank integriert. Nach diesem Schritt werden die Objektträger zu wäscht das Entfernen von Paraffin-und Rehydrierung der Proben unterzogen. Das Material wird mit rehydriert Hematoxilin für kurze Zeit gefärbt. Dies führt zu einer schwachen Färbung der Probe ist aber ausreichend für die Visualisierung der Probenräume für die Mikrodissektion. Die Färbung ist durch Spülen der Objektträger mit einem Überschuß an Wasser rasch gestoppt werden. Eine anhaltende Färbung der Probe führt zu einer schlechten Peptid Erträge. Im nächsten Schritt werden die getrockneten Abschnitte sind Mikrodissektion unterzogen. Die Auswahl der Gewebebereiche einzelner Zellen hängt von der Art der Untersuchung und erfordert immer besondere Kenntnisse in der Histologie oder Pathomorphologie. Der Laser-Material-Freigabe auf Klebeflächen der Probensammelröhrchen gesammelt. Da die Bindungskapazität des Klebermaterials begrenzt ist es notwendig, die microdissected Material von dem Deckel zu übertragen ter Röhre nach der Sektion jeder 3-5 mm 2 der Probe. Dies kann leicht durch Pipettieren von wenigen Mikrolitern des Gewebes Lysepuffer (LTB) auf dem Deckel und einer kurzen Spinn des Rohres in einer Zentrifuge durchgeführt werden. Nachdem die Probe in dem Boden des Rohres gesammelt, kann die Mikrodissektion und der Probensammlung auf dem Deckel fortgesetzt. Nachdem die gesamte Probe wird gesammelt, um die Rohre zusätzlich mit Parafilm unter ständigem Rühren 1 Stunde mit einem Stopfen verschlossen und bei etwa 99 ° C in einem Wasserbad inkubiert. Da während der Inkubation Wasser kondensiert auf dem Deckel, alle 15 min die Rohre zu kurz zentrifugiert, um in der Röhre Kegel sammeln das Wasser zurück werden. Um die Peptide zu erhalten Gewebelysaten werden mit dem MED-FASP Ansatz verarbeitet. In diesem Verfahren werden die lysierten Proteine ​​werden aus dem Reinigungsmittel und anderen niedermolekularen Substanzen, an Cysteinresten carboamidomethylated erschöpft ist, und dann nacheinander mit zwei unter Enzymen verdautstörendes in ihrer Spaltung Besonderheiten: Endoproteinase LysC und Trypsin. Nach jedem Schritt der Verdauung werden die Peptide in getrennten Fraktionen gesammelt. In diesem Teil der Probenvorbereitung ist es wichtig, jeden der Zentrifugationsschritte, bis mehr als 95% der Lösung zunächst in die Filtrationseinheit geladen bestanden die Membran weiter. Analyse Kolon und ihre Krebs beobachteten wir, dass dieses Verfahren Ausbeuten 3-6 ug Peptid pro 100 nl (100 &amp;mgr; g Gewebe oder 10 mm 2 von einer 10 &amp;mgr; m-Bereich) des microdissected Materials (Tabelle 1). Da die extrahierbaren Gesamtprotein aus Gewebe etwa 10% der Gewebegewicht die Extraktions-und Aufschlussverfahren zusammen in einer 30-60% Ausbeute in Bezug auf die ursprüngliche Frischgewebe führen. Diese Werte beziehen sich auf Verluste des Proteins während der Dehydratisierung und der Färbung Mikrodissektion und Speicherung des Abschnitts der unverdaute Probe in der Ultrafiltrationseinheiten. Da Gewinnung und Verarbeitung von nichtn-microdissected FFPE Gewebe ergab Protein-zu-Peptid-Umwandlungsausbeute von 75% und 5 ist es wahrscheinlich, dass während der Schritte vor dem MED-FASP die kritischen Probenverluste auftreten. Ein wichtiges Merkmal der dabei erhaltenen Peptidgemische ist ihre hohe Reinheit, die weitere Fraktionierung Peptid-Fraktionierung Prozess und die Massenspektrometrie Identifizierung erleichtert. Dies wurde kürzlich durch eine Analyse von kolorektalem Adenom Proben 3 gezeigt. In dieser Studie über 40% der MS / MS-Ereignisse führten zu Identifizierung von Peptiden aus der FFPE Gewebe und führte zu Abbildung von bis zu 17.000 Peptide pro Einzellauf LC-MS/MS. Höhere Erkennungsraten sind nur in der Analyse von eingefrorenen in vitro kultivierten Zellen 3 erreicht. In den beiden letzten Teile des gesamten Verfahrens die isolierten Peptide quantifiziert und fraktionierte auf Pipettenspitze Mikrosäulen. Da die Peptidmengen aus dem Gewebe isoliert sind mikrodissezierten seinNieder 10 ug sie können nicht mit häufig verwendeten Farbstoff-Protein-Assays quantifiziert werden. Auch die A 280 UV-Spektral-Messungen bei diesen Konzentrationen nicht nützlich sind aufgrund der Lichtstreuungseffekt. Im Gegensatz Messungen der Fluoreszenz der Tryptophan bieten eine zuverlässige Methode für die Bestimmung der Peptidgehalt. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass bis zu 5.000 Proteine ​​aus kultivierten Zellen können in einem &quot;single shot&quot; 4 Stunden LC-MS/MS Analyse 7 identifiziert werden. Doch diese Art der Analyse zu nativen Geweben angewandt selten erlaubt die Identifizierung von mehr als 3.000 Tausend Proteinen. Um die Tiefe der Analyse in die MED FASP erzeugten Peptide vor, fraktioniert werden, bevor LC-MS/MS haben, zu erhöhen. Das SAX basierend Mikrotrennsäule ist eine einfache und effiziente Fraktionierungsverfahren 10. Es wurde bereits in verschiedenen proteomischen Untersuchungen einschließlich der Analyse von fixierten Gewebe 5, 8, 9 aufgebracht ist. Der SAX-&quot;Pipette-Spitze&quot; microcolumns, und der C 18 - &#39;StageTip&#39; Entsalzungssäulen 9 sind einfach zuzubereiten. Die Spalten werden durch Stapeln der Stecker zusammengebaut ist, von dem SAX geschnitten oder C 18-Membranen in einem 200 &amp;mgr; l-Pipettenspitze 11. Beispiele für die Analyse der SAX-fraktioniert FFPE-Proben sind in Tabelle 1 gezeigt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Übersicht über die Verfahren. Das Verfahren besteht aus vier Teilen: (1) Herstellung der Abschnitte der FFPE-Proben und deren Mikrodissektion, (2) Lyse der Probe und Verarbeitung der Proteine ​​unter Verwendung von MED FASP Ansatz, und (3) Quantifizierung und (4) Fraktionierung die Peptide. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Probe </td><td fo:width="1in"> Beispiel Vorfraktionierung / Verdauung </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Massenspektrometer </td><td fo:width="1.25in"> Peptid-Ausbeute ng / nL Probe (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Einzigartige Protein Identifikationen pro Einzelprobe </td><td fo:width=".75in"> Referenz </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal Darmschleimhaut </td><td> SAX / ein Enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Dickdarm-Adenom </td><td> SAX / zwei Enzyme </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse der Proteom-Analysen der FFPE mikrodissezierten Gewebe.

Archiv Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) klinische Proben sind wertvolles Material für die Untersuchung von Krankheiten. Hier zeigen wir eine Probenvorbereitung Workflow ermöglicht eingehende Proteomanalyse mikrodissezierten FFPE Gewebe.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Peptide aus formalinfixierten und paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben zu gewinnen und vorab fraktionieren, um eine proteomische Analyse durchzuführen. Dies wird erreicht, indem das gewünschte Gewebe durch Mikrodissektion isoliert und anschließend die Zellen lysiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, durch Probenaufbereitung Peptide zu erzeugen.Unter Verwendung der multienzymatischen Verdau-gefilterten Probenvorbereitung. Die Peptide werden anschließend durch Messung ihrer Tryptophan-Fluoreszenz quantifiziert. Der letzte Schritt ist die Fraktionierung der Peptide mithilfe einer auf starken Anionenaustauschern basierenden Trenntechnik zur Peptidfraktionierung.Letztlich ermöglichen die hergestellten Proben die Analyse von Proteomen aus geringsten Materialmengen bis zu einer Tiefe von 10.000 Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Gelelektrophorese oder der Verdauung in Lösung, liegt darin, dass sie auf geringste Mengen klinischer Proben anwendbar ist, beispielsweise laser-mikrodissektierte Zellen. Die Methode liefert Proben, die vollständige und reine Peptide enthalten.Was ermöglicht die proteomische Erforschung menschlicher Gewebe und Krankheiten? Die gesamte Protokollabfolge besteht aus Techniken, die in der Vergangenheit entwickelt und veröffentlicht wurden. Dazu gehören die Hochausbeute-FASP, die Pipettenspitzen-basierte Extraktion sowie die Bestimmung des Peptidgehalts anhand der Tryptophan-Fluoreszenz, wodurch gezeigt wird, dass das Verfahren funktionstüchtig ist.Catina, eine Technikerin aus unserem Labor, bereitet Gewebeschnitte für die Mikrodissektion vor, indem sie Schnitte mit einem Mikrotom anfertigt. Die Dicke der Schnitte hängt von der Probe ab. Gewöhnlich eignen sich für die Mikrodissektion Schnitte mit einer Dicke von sieben bis zehn Mikrometern.Nach der Bestrahlung der Membranobjektträger mit UV-Licht für 45 Minuten die Schnitte aufbringen und vor dem Trocknen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden trocknen lassen. Die aufgebrachten Schnitte durch zwei aufeinanderfolgende Inkubationen in aufeinanderfolgenden Gefäßen mit Xylol für zweieinhalb Minuten und eineinhalb Minuten entparaffinieren. Anschließend die Schnitte durch aufeinanderfolgende Schritte rehydrieren.Einminütige Inkubationen in absolutem Ethanol, 70 % Ethanol und abschließend in Wasser. Nach der Färbung der Schnitte mit Meyer's Hämatoxylin für 20 Sekunden.Mit Wasser eine Minute lang spülen und an der Luft trocknen lassen. Sammeln Sie die gewünschte Zellpopulation mithilfe eines Laserschneide-Mikrodissektionsystems. Bei Verwendung des PALM-Instruments sammeln Sie die Proben in den Klebekappen unter Verwendung von drei Mikrolitern Puffer zur Gewebelyse für 10 Nanoliter des mikrodissekierten Gewebes.Tragen Sie das Puffermedium auf das mikrodissezierte Material im Deckel auf und schließen Sie das Röhrchen. Sammeln Sie die Suspension nach einer kurzen Zentrifugation. Danach inkubieren Sie das mikrodissezierte Gewebe eine Stunde lang bei 99 Grad Celsius in einem Heizblock mit Rühren. Klären Sie das rohe Extrakt durch Zentrifugation bei 16.000 G und 18 Grad Celsius für 10 Minuten. Geben Sie bis zu 50 Mikroliter des geklärten Lysats mit 200 Mikrolitern der UA-Lösung in eine Ultrafiltrationseinheit. Anschließend zentrifugieren Sie bei 14.000 G, bis weniger als 10 Mikroliter der Lösung im Filter verbleiben.In der Regel erfordert dieser Schritt 10 bis 15 Minuten Zentrifugation. Danach pipettieren Sie 200 Mikroliter der UA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit und zentrifugieren. Wie zuvor leeren Sie das Sammelröhrchen, bevor Sie 50 Mikroliter der IAA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit pipettieren.Mischen Sie 1 Minute lang bei 600 U/min in einem Thermomischer bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie. Wie zuvor beschrieben, führen Sie die Ultrafiltrations- und Zentrifugationsschritte gemäß der schriftlichen Anleitung durch, die diesem Video beiliegt. Danach überführen Sie die Filtrationseinheiten in neue Sammelgefäße. Pipettieren Sie 40 Mikroliter Digestionspuffer mit Endoproteinase Lys C, mischen Sie anschließend eine Minute lang bei 600 U/min im Thermomischer. Inkubieren Sie die Einheiten 18 Stunden lang in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren der Filtereinheiten wie zuvor durchgeführt, pipettieren Sie 160 Mikroliter des DB-Puffers und zentrifugieren erneut.Die Filtereinheiten, durch die der gepoolte Durchlauf strömt, enthalten die Peptide, die durch die Endoprotease Lic C freigesetzt wurden. Sammeln Sie danach die Triptich-Peptide gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung. Die Bestimmung des Peptidgehalts in den Proteinverdauungen kann in verdünntem Puffer durchgeführt werden, da die Tryptophan-Reste gut für das Lösungsmittel zugänglich sind. Um Peptide zu quantifizieren, pipettieren Sie zunächst 0,2 Milliliter Assay-Puffer DB in die Quarz-Küvette.Platzieren Sie anschließend die Q vet in den QVE-Halter des Instruments und nehmen Sie das Emissionsspektrum für die Blindprobe auf. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve in Schritten von 0,1 Mikrogramm, indem Sie Aliquote von je einem Mikroliter der Tryptophan-Standardlösung zur Q vet hinzufügen und vorsichtig mit dem Puffer db mischen. Nach der Reinigung der Q vet pipettieren Sie die Probe hinein und nehmen Sie das Spektrum der Probe auf.Fahren Sie mit der Berechnung der Protein- und Peptidkonzentration gemäß der schriftlichen Anleitung vor der Fraktionierung fort. Bereiten Sie die SAX-Tip-Säule vor, indem Sie sechs Schichten der EM.Import-Ionenaustauschmembran in eine übliche 0,2-Milliliter-Pipettenspitze stapeln. Stellen Sie zwei SAX-Tip-Säulen pro Probe her.Bereiten Sie als Nächstes die Stufenspitze vor, indem Sie drei Schichten von M vier C 18 stapeln. Stellen Sie in einer 0,2-Milliliter-Pipettenspitze sechs Stufenspitzen pro Probe her. Um zu beginnen.Fractionierung: Verdünnen Sie die durch die Verdauung mit Ly C erhaltenen Peptidlösungen mit 0,2 Milliliter BRI- und Robinson-Puffer, pH 11. Verdünnen Sie die durch die Verdauung mit Trypsin erhaltenen Peptidlösungen ebenfalls mit 0,2 Milliliter Britton- und Robinson-Puffer, pH 5. Bauen Sie die SAX-Tipp-Säule in den Zentrifugenröhrchen-Adapterdeckel ein, bevor Sie die SAX-Tipp-Säule und die C18-Stage-Tips gemäß dem schriftlichen Protokoll waschen und äquilibrieren.Als Nächstes die SAX-Spitzen-Säule in der C18-Stufen-Spitze zusammenbauen. Die Probelösungen in die äquilibrierten SAX-Spitzen-Säulen geben und die Säulen drei Minuten lang bei 5.000 G zentrifugieren. Die Pipettenspitzen-Säulen mit 0,1 Milliliter der verdünnten Proben waschen.Unterstützen Sie den Durchfluss durch Zentrifugation bei 5.000 G. Überführen Sie die SAX-Tip-Säule in die nächste C18-Stagetip-Säule und fahren Sie mit der Elution der Peptide gemäß der schriftlichen Protokollbeschreibung fort. Nach dem Waschen der C18-Stagetips mit 0,05 Milliliter Puffer A eluieren Sie die Fraktionen mit 0,05 Milliliter Puffer B in Vials, die später für die Injektion der Proben in ein mit einem repräsentativen Massenspektrometer ausgestattetes Flüssigkeitschromatographiesystem verwendet werden. Ergebnisse der Proteinextraktion und -verdauung werden hier gezeigt.Die Lyse von 250 Nanolitern Gewebe, was einem mikrodissekierten Bereich von 25 Quadratmillimetern aus einer 10-Mikrometer-Schnitt entspricht, führt nach der zweistufigen, aufeinanderfolgenden Verdauung im FAST-Format mit der Endoprotease Lys-C und Trypsin zu einer Ausbeute von mehr als 50 % des Gesamtproteins, was etwa 45 Mikrogramm entspricht. Dargestellt ist hier eine repräsentative Fluoreszenzmessung des Peptidgehalts; die Spektren des Tryptophan-Standards und der Probe zeigen Maxima bei 350 bis 360 Nanometern. Die Intensität der Fluoreszenz ist proportional zum Tryptophangehalt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben aus hochwertigem Gewebe für die proteomische Analyse mithilfe der Mikrodissektionstechnik, der Probenvorbereitung und der Peptidfraktionierung vorbereitet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden, zuzüglich der Zeit, die für die Proteinverdauung benötigt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets frisch präparierte Gewebeschnitte unmittelbar nach ihrer Herstellung zu verwenden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg, um die Proteome von Geweben und Zellen sowie deren Abnormalitäten beim Menschen anhand von formalinfixiertem und paraffineingebettetem Material zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Das folgende Video beschreibt, wie die Morphologie eines Gewebes durch Formalinfixierung und Paraffineinbettung erhalten werden kann.

Konservierung von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE): Eine Methode zur Untersuchung der Gewebemorphologie

Dieses modifizierte Extraktionsprotokoll verbessert RNA und DNA-Ausbeuten von gezieltere Regionen von Interesse in histopathologischen Gewebeblöcke.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Hybrid-Cut-Gewebeschnittmethode, die für widerspenstiges Pflanzengewebe nützlich ist. Gewebeschnitte von guter Qualität ermöglichen anatomische Studien und andere biologische Studien, einschließlich der In-situ-Hybridisierung (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) wird häufig in Kombination mit Histopathologie und molekulare Diagnostik für die Auswahl der Therapie in der personalisierten Medizin benötigt. Eine neuartige nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, mit dem hochwertigen morphologische, molekulare und Fisch Analysen aus der gleichen Probe durch Zugabe von einem Post-Fixierung Schritt bevor Fisch dargestellt wird.

Protokoll für HER2 Fischen mit nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, Vorteile der Kryokonservierung und Formalin Fixierung zu kombinieren

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.

Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Erfahren Sie die optimierte Proteomik-Protokollierung von FFPE-Geweben mittels Laser-Mikrodissektion, FASP und SAX-Fraktionierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von bis zu 10.000 Proteinen aus minimalen klinischen Proben.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

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