Name: 利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原，促进人类胚胎干细胞的浓缩和清除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解利用TG30和GCTM-2单克隆抗体通过流式细胞术分选人类胚胎干细胞的方法。该技术可实现多能性细胞的阳性富集与分化细胞的阴性清除，为干细胞生物学研究提供客观评估手段。

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我们感谢莫纳什大学干细胞中心提供人类胚胎干细胞系，以及莫纳什大学流式细胞分选中心提供的流式细胞分选（FACS）服务。本研究工作获得了澳大利亚干细胞中心、新南威尔士州和维多利亚州政府干细胞研究资助计划对 ALL 的研究资助支持。ALL 是澳大利亚研究理事会（ARC）干细胞科学特别研究计划“澳大利亚干细胞”（Stem Cells Australia）的合作伙伴研究员。

以下实验方案使用莫纳什大学（墨尔本）StemCore 实验室提供的 hESC-MEL111 标准大量培养细胞进行。该细胞系常规培养于经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层上，培养基为添加 bFGF 的 hESC/KOSR 培养基7，每 5–7 天通过酶解法（胶原酶）传代一次8。本方案以生长至约 80% 汇合度的 75 cm2（T75）培养瓶中的人胚胎干细胞（hESC）培养物作为起始细胞群体。下述所有细胞操作步骤均须在 HEPA 过滤的 II 级生物安全柜内无菌条件下进行。
在进行 TG30/GCTM-2 FACS 检测前两天，准备好将用于FACS后回收细胞重新培养的T75培养瓶（见第1节），具体操作见第4节。
1. MEF 的接种与 MEF 条件培养基的制备
1.1 第-2天：将MEF细胞接种至T75培养瓶中
<ol>
	<li>用移液器将 10 ml 的 0.1% w/v 明胶加入每个 T75 培养瓶中，倾斜培养瓶使表面均匀包被。</li>
	<li>在生物安全柜中室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除明胶溶液。</li>
	<li>向培养瓶中加入 20 ml MEF 培养基，并在细胞培养箱中预平衡 30 分钟，条件为 37 °C 和 5% CO2。</li>
	<li>将有丝分裂失活的 MEF 细胞以如下密度接种至已准备好的培养瓶中。对于 1/3 MEF 密度，接种 1.4 × 104 个细胞/cm2（T75 培养瓶 = 1 × 106 个 MEF 细胞）；对于全密度 MEF，接种 5.3 × 104 个细胞/cm2（T75 培养瓶 = 4 × 106 个 MEF 细胞）。</li>
</ol>
注意：我们常规使用经γ射线照射有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。γ射线照射MEFs的制备方案可参见Michalska12。
<ol start="6">
	<li>将照射后的MEF细胞培养物在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。1/3满的培养瓶可在不更换MEF培养基的情况下孵育1至4天。这些培养瓶用于FACS后细胞的重新接种（如方案&#160;4所述）。完全充满MEF细胞的培养瓶则需孵育过夜，以按以下步骤1.2制备条件培养基（CM）。</li>
</ol>
1.2 第 -1 天：制备小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（CM）
<ol>
	<li>从长满细胞的MEF培养瓶（T75）中吸除MEF培养基。</li>
	<li>每瓶T75加入预先平衡的25 ml hESC/KOSR培养基，并添加5 ng/ml人FGF-2。于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>将MEF条件培养基（CM）收集至无菌组织培养管中，新鲜补充10 ng/ml人FGF-2，并使用0.22 μm聚醚砜滤器过滤。</li>
	<li>为制备更多条件培养基，可在同一MEF培养物上每日重复步骤1.2.2和1.2.3，持续一周。</li>
</ol>
在进行TG30/GCTM-2检测当天，将1/3 MEF T75培养瓶中的MEF培养基更换为CM，并在接种任何经下述方法回收的hESC或hESC衍生细胞前，预先平衡至少30分钟。CM可新鲜使用，或在4 °C保存最多2周。本方案中使用CM，因为据我们经验，与未条件化培养基相比，CM可提高细胞经FACS分选后的存活率（结果未显示）。
2. 进行 TG30/GCTM-2 FACS 检测：将 hESC 大量培养物解离为单细胞
注意：将 20% FBS/DMEM-F12 培养基在 4 °C 预冷。
<ol>
	<li>从两个培养有人胚胎干细胞系的 T75 培养瓶中吸除 hESC/KOSR 培养基。</li>
	<li>用 10 ml DPBS 清洗每个 T75 培养瓶中的细胞，随后吸除液体。</li>
	<li>向每个 T75 培养瓶中加入 3 ml TrypLE Express 消化液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。</li>
	<li>轻敲培养瓶侧面以使细胞完全脱落，显微镜下观察。若细胞不易脱落，继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>向每个 T75 培养瓶中加入 10 ml 20% FBS/DMEM-F12（4 °C 预冷）。使用无菌 10 ml 移液管，将消化后的细胞悬液沿瓶壁反复吹打数次，以获得以单细胞为主的细胞悬液。</li>
	<li>将一个 70 μm 细胞筛置于一个 50 ml 无菌聚丙烯管上。使用无菌 10 ml 移液管，将来自两个 T75 培养瓶的 hESC 单细胞悬液合并后通过细胞筛过滤。</li>
	<li>弃去细胞筛，盖上管盖，将合并的 hESC 细胞悬液在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用 10 ml 20% FBS/DMEM-F12（4 °C 预冷）轻轻重悬细胞沉淀以洗涤细胞。</li>
	<li>再次在 1,000 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入 10 ml 20% FBS/DMEM-F12（4 °C 预冷），轻轻吹打重悬细胞。将 50 ml 管置于冰上。该细胞悬液将用于下文所述的 Sort Sample 免疫染色步骤。</li>
	<li>取 20 μl hESC 单细胞悬液（步骤 2.10）进行血细胞计数板细胞计数。预期每瓶 T75 培养瓶可获得 1,000 万至 1,500 万个细胞。</li>
</ol>
注意：本实验方案的此步骤使用 FBS 以提高细胞在 FACS 分选后的存活率。
3. 细胞表面抗原TG30和GCTM-2的免疫荧光染色
<ol>
	<li>将150 μl（约100,000个细胞）的hESC单细胞悬液（来自步骤2.11）分装至六支1.5 ml的微量离心管中。这六份分装样品将用作FACS仪器检测所需的染色对照。剩余的约9 ml细胞悬液将作为分选样品，用于根据表1和表2对解离后的培养物进行TG30和GCTM-2的共染色。</li>
	<li>在20% FBS/DMEM-F12中进行一抗结合反应。分选样品的终体积应约为9 ml，对照样品为200 μl。将同型对照抗体作为一抗加入。将离心管水平放置于冰上，并在摇床上轻轻混匀反应30分钟。</li>
	<li>以1,000 x g离心一抗反应液2分钟。</li>
	<li>弃上清液，通过将沉淀重悬于20 ml预冷（4 °C）的20% FBS/DMEM-F12中（分选样品）或200 μl（对照样品）进行细胞洗涤。</li>
	<li>再次以1,000 x g离心2分钟。</li>
	<li>在20% FBS/DMEM-F12中进行二抗结合反应。分选样品的终体积应为2.5 ml，对照样品为200 μl。此时需制备PE-抗小鼠CD90.2反应管。将离心管水平放置于冰上，并在摇床上轻轻混匀反应30分钟。</li>
</ol>
注意：在孵育期间，可同时收集CM，并按照第1.2节的方法用CM准备1/3 MEF T75培养瓶。
<ol start="7">
	<li>将二抗反应液在1,000 × g离心2分钟。</li>
	<li>弃上清，用20 ml预冷（4 °C）的20% FBS/DMEM-F12重悬沉淀以洗涤细胞，分选样本洗两次，对照样本每次用200 μl。</li>
	<li>每次洗涤后均在1,000 × g离心2分钟，离心后将离心管置于冰上。</li>
	<li>弃上清，将细胞沉淀重悬于含碘化丙啶（PI）（终浓度0.3 μg/ml）的20% FBS/DMEM-F12中，分选样本使用2–3 ml，对照样本使用300 μl。</li>
</ol>
注意：切勿将 PI 加入未染色细胞的对照管中。
<ol start="11">
	<li>使用 P1000 微量移液器将每份单细胞悬液通过与 5 ml 聚苯乙烯圆底试管相连的 35 μm 滤盖细胞筛网。</li>
	<li>以 50 g/min 离心，使残余细胞悬液完全滤过筛网盖。</li>
	<li>通过轻敲试管壁重新混悬每份单细胞悬液，并置于冰上。您的细胞现在已准备好进行流式细胞分选（FACS），请立即进行下一步操作。</li>
</ol>
4. TG30/GCTM-2 亚群细胞在75 cm2（T75）培养瓶中的FACS后培养
<ol>
	<li>我们此前已报道过如何设置流式细胞仪（FACS）以进行TG30/GCTM-2免疫分析7。该操作可回收具有活性的单个hESC，去除MEF，并获得位于P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）、P5（TG30Low-GCTM-2Low）、P6（TG30Mid-GCTM-2Mid）和P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）门内的细胞群——见图1E。请按照我们先前报道的方法设置TG30/GCTM-2流式细胞仪，以回收接下来将使用的细胞亚群。</li>
	<li>在从流式细胞仪收集细胞前，向两个5 ml聚苯乙烯圆底试管中各加入1 ml按步骤1.2制备的CM，并置于冰上。</li>
	<li>利用TG30/GCTM-2流式细胞术，分别从已分化的P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）和多能性P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞亚群中各回收400,000个细胞。</li>
	<li>将收集管在1,000 × g下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液。使用P1000移液器加入1 ml预平衡至37 °C/5% CO2的CM，重悬每个细胞沉淀。将每种细胞群体分别接种至预先平衡的1/3 MEF T75培养瓶中（CM按步骤1.2制备）。</li>
	<li>在细胞培养箱中于37 °C/5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>每日吸除CM，并更换为新鲜制备的CM（同步骤1.2），持续约两周。多能性P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞培养约一周后可见人干细胞样克隆，9–11天时达到约80%融合度。P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞培养则主要呈成纤维细胞样单层生长，于11–13天达到融合。在此阶段，如需要，P4和P7细胞培养物可用于通过TG30/GCTM-2流式细胞术介导的连续传代，以进一步扩增P4或P7亚群（见图2和图3）。</li>
</ol>

<ol><li>Pera, M. F., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+regulation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrinsic regulation of pluripotent stem cells.</a> Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).</li>
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</ol>

无任何利益冲突需要披露。

在临床背景下，分化的体细胞类型是移植和治疗应用所需的最终产物，而人多能干细胞（hPSC）是一种可自我更新且可扩增的来源，可用于在实验室中生成这些体细胞或其前体细胞。当考虑将人胚胎干细胞（hESC）来源的体细胞移植给患者时，残留未分化hESC所固有的致畸瘤潜能构成了安全风险。关于细胞治疗相关的此类及其他风险的综述，请参见Sharpe et al.16。因此，要实现上述应用，研究人员必须致力于获得不含多能干细胞的目标细胞群体。为实现这一目标，本文展示了利用我们的TG30/GCTM-2流式细胞分选（FACS）方法，可以检测正在分化细胞群体中多能细胞（TG30Hi-GCTM-2Hi）的存在，并获得具有活力的hESC分化衍生物，这些细胞可在FACS后进行富集和再培养。尽管通过本方案单次操作无法获得完全不含多能干细胞的样本，但富集后的hESC衍生物可重新培养，经过连续传代后可实现100%的体细胞纯度。FACS后体细胞仍具增殖活力，这一特性也为生产足量适用于潜在移植治疗的细胞提供了可能。
本项初步研究的积极结果促使我们开展了一项更为全面的研究，采用我们的 TG30/GCTM-2 方案，对多个人类诱导性多能干细胞（hiPSC）系进行比较研究15。在该研究中，我们发现，通过 TG30/GCTM-2 FACS 方案获得的无多能干细胞样品，在移植到免疫缺陷小鼠体内后不会形成畸胎瘤。因此，我们可以有把握地指出，利用该in vitro方案，经确认不含多能性 TG30Hi-GCTM-2Hi细胞的早期分化细胞培养物在in vivo条件下不会发育成畸胎瘤。这一结果有力地支持了我们检测方法的可靠性，为在临床应用中使用hPSC来源细胞之前消除畸胎瘤形成风险提供了一种潜在的策略。
相反，我们还证明TG30/GCTM-2 FACS检测可用于富集高表达这两种表面抗原（TG30和GCTM-2）的多能性细胞群体你好GCTM-2你好）。先前的研究表明，TG30你好GCTM-2你好 细胞 与OCT4表现出最高相关性你好 表达并形成最多数量的hESC样克隆5,6,13,15因此，我们推断多能性网络在TG30中被激活至其最高水平你好GCTM-2你好 表达细胞。我们认为，使用我们的TG30/GCTM-2 FACS方案并分离P7（TG30你好-GCTM-2你好细胞可用于大规模纯化富集的活体hESC培养物，作为分化检测的输入材料。
综上所述，我们在此展示了基于表面抗原 TG30 和 GCTM-2 联合表达的 FACS 检测方法在人胚胎干细胞（hESCs）去除非目标细胞和富集目标细胞方面的潜力。未来针对人多能干细胞（hPSCs）定向分化方案的研究也可能进一步阐明这种潜力。我们注意到，在某些检测中，分化后的人胚胎干细胞衍生物可能在特定时间点暂时表达 TG30（CD9）或 GCTM-2，因此在这类情况下，这两种抗体可能并不适合或不足以在特定时间点从分化细胞群体中彻底清除多能性细胞6。因此，仍需持续寻找能够特异性识别活体 hESCs 的新型抗体，以克服其与某些分化细胞类型发生交叉反应的潜在局限性。

人多能干细胞（hPSC）包括人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hIPSC）。在适当的培养条件下，hPSC能够无限自我更新，同时保持其被称为多能性的分化潜能 &#34;多能性&#34;多能性是指细胞具有分化为几乎所有体细胞谱系的潜能，包括代表三个胚胎胚层的各类细胞。人类多能干细胞（hPSC）所具备的这种非凡潜能，为多种基于细胞的应用（包括治疗手段）提供了可能。例如，在心力衰竭、脊髓损伤、糖尿病、帕金森病、某些癌症及其他临床病理中，人体细胞的正常功能因细胞死亡和退化而受损。患有这些疾病的患者，未来有望通过移植在实验室中由hPSC分化而来的健康且具有功能的体细胞进行治疗。然而，目前的hPSC分化方案并非100%高效，所得细胞群体通常包含目标分化细胞、非目标细胞类型，以及未经历分化而持续自我更新的残留hPSC。1-3. 在拟用于患者移植的hPSC来源体细胞样本中，即使存在极少量hPSC，也会构成严重的临床风险，因为这些细胞本质上具有形成三个胚层组织的能力，可能因此形成 体内 一种称为畸胎瘤的肿瘤。因此，只有经确认不含多能干细胞的靶细胞群体才可被视为适合用于患者移植。已有若干报道的方法可能实现清除分化后残留的人多能干细胞（综述详见 Polanco 和 Laslett）4我们先前报道过，使用与荧光激活细胞分选（FACS）技术偶联的单克隆抗体TG30（CD9）和GCTM-2，可鉴定人胚胎干细胞系培养物中的多能性干细胞，并将其与处于早期分化阶段的细胞区分开来。5-7.
使用抗体检测细胞表面抗原的一个优势在于，靶细胞在抗体结合和/或标记后通常仍保持活性。因此，可在抗体标记后收集靶细胞，并重新培养以扩增和进一步应用，再进行移植。对于表达在人多能干细胞（hPSC）上的细胞表面抗原而言，需要注意的一点是，这些抗原并非仅存在于多能阶段，在许多情况下会在发育过程中暂时性地重新表达，因此也会在某些已分化细胞类型中被检测到。因此，如果目标是使用抗体来识别人类多能细胞并从hPSC来源的细胞样本中清除这些细胞，则所选抗体不应与拟用于移植的特定分化细胞类型上的抗原发生交叉反应。遗憾的是，能够识别活hPSC表面标志物的抗体种类有限4，这限制了可选方案。此外，已有少数研究表明，仅检测单一细胞表面标志物不足以完全清除所有hPSC，提示任何旨在彻底清除hPSC多能亚群的尝试都应依赖于使用两种或更多种针对hPSC表达的不同表位的抗体的方法9-10。如上所述，只有被确认为不含多能干细胞的hPSC来源细胞群体才适合用于人体移植。仅通过一次抗体介导的细胞分选技术可能难以达到如此严格的纯度要求，可能需要对富集后的分化靶细胞群体进行重新培养，并进行多轮细胞分选，才能最终获得不含多能干细胞的样本。
在我们的实验室中，我们已对两种人胚胎干细胞（hES）表面抗体 TG30（CD9）和 GCTM-2 进行了广泛表征，用于检测活的多能性细胞。研究表明，同时检测 TG30 和 GCTM-2 与人胚胎干细胞系中经典多能性相关基因的表达高度相关5-7。TG30/GCTM-2 荧光激活细胞分选（FACS）免疫分析 consistently 显示，人胚胎干细胞培养物在 TG30/GCTM-2 表达水平上呈现定量连续梯度5-7。我们在此梯度中人为划分出四类细胞群体（P）：P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）、P5（TG30Low-GCTM-2Low）、P6（TG30Mid-GCTM-2Mid）和 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）5-7。我们对这些 P4、P5、P6 和 P7 细胞群体的表征表明，P6 和 P7 亚群表达大量多能性相关基因，并在 FACS 分选后重新培养时能高效形成类干细胞克隆2-3。相反，P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞则表达大量分化标志物，代表在人胚胎干细胞系扩增培养过程中通常出现的自发分化细胞类型5-6。我们决定评估 TG30/GCTM-2 FACS 在早期分化后选择性清除残留人多能干细胞（hPSCs）方面的潜力，同时也用于富集多能干细胞群体。下述方案描述了如何在 FACS 分选后收集并重新培养已分化的 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞，以实现对多能性 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞的清除。此外，我们还说明了如何收集并重新培养多能性 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞，以获得富集的多能细胞培养物，该细胞群体可作为定义明确的起始输入群体，从而有望提高后续分化实验的效率与一致性。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td>全称：Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>全称：Knockout 血清替代物</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>全称：GlutaMAX 添加剂</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>全称：MEM 非必需氨基酸溶液</td></tr><tr><td>巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td>全称：2-巯基乙醇</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td>全称：Dulbecco 磷酸盐缓冲液，无钙、无镁</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604039</td><td>全称：TrypLE Express (1x)，无酚红</td></tr><tr><td>AF-488</td><td>Life Technologies</td><td>A21131</td><td>全称：Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2a</td></tr><tr><td>AF-647</td><td>Life Technologies</td><td>A21238</td><td>全称：Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgM</td></tr><tr><td>PE-anti IgG2a</td><td>Life Technologies</td><td>P21139</td><td>全称：R-藻红蛋白山羊抗小鼠 IgG2a (&amp;gamma;2a) 偶联物</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>全称：Dulbecco 改良 Eagle 培养基，高糖</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>全称：青霉素-链霉素溶液，液态</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089.</td><td>全称：无菌蒸馏水</td></tr><tr><td>PI</td><td>SIGMA</td><td>P4864</td><td>全称：碘化丙啶溶液</td></tr><tr><td>FBS</td><td>SIGMA</td><td>12203C</td><td>全称：胎牛血清</td></tr><tr><td>明胶</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>全称：猪皮来源明胶</td></tr><tr><td>人 FGF-2</td><td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>全称：碱性成纤维细胞生长因子，人重组型，无动物成分</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>全称：Stericup-GP，0.22 &amp;mu;m，聚醚砜，250 ml，辐射灭菌</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>全称：带 70 &amp;mu;m 尼龙网的细胞筛</td></tr><tr><td>带 35 &amp;mu;m 筛网盖的 5 ml 管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>全称：5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛盖（35 &amp;mu;m）</td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底试管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>全称：5 ml 聚苯乙烯圆底试管，无菌</td></tr><tr><td>IgG2a 同型对照</td><td>Becton Dickinson</td><td>554126</td><td>全称：纯化小鼠 IgG2a，&amp;kappa; 同型对照</td></tr><tr><td>IgM 同型对照</td><td>Becton Dickinson</td><td>553472</td><td>全称：纯化小鼠 IgM，&amp;kappa; 同型对照</td></tr><tr><td>PE-CD90.2</td><td>Becton Dickinson</td><td>553014</td><td>全称：PE 大鼠抗小鼠 CD90.2</td></tr><tr><td>8 峰校准微球</td><td>Becton Dickinson</td><td>559123</td><td>全称：彩虹校准微粒（8 峰）</td></tr><tr><td>50 ml 无菌聚丙烯管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>全称：50 ml 聚丙烯锥底管，无菌</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>全称：CELLSTAR 带滤膜盖细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>TG30</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4427</td><td>全称：TG30 抗体，克隆号 TG30</td></tr><tr><td>GCTM-2</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB4346</td><td>全称：GCTM-2 不再商业供应，但 TG343 及其等效单克隆抗体可获得</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 4.&lt;/strong&gt; 材料与试剂列表</td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>FACSVantage SE 配备 FACSDiva 选项</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 5.&lt;/strong&gt; 设备列表</td></tr></tbody></table>

利用单克隆抗体tg30和gctm-2检测细胞表面抗原富集与清除人胚胎干细胞

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

人类胚胎干细胞（hESC）可无限自我更新 体外，并在适当信号诱导下可分化为几乎所有体细胞谱系。分化的hESC衍生物有望用于细胞退行性疾病的移植治疗。然而，hESC分化方案通常会产生混合细胞群体，包括目标分化细胞、非目标细胞类型以及残留的未分化细胞。为了将分化的hESC衍生物从实验室研究推进到临床应用，必须能够区分未分化（多能性）细胞与已分化细胞，并建立分离这些细胞群体的方法。只有在不含多能性干细胞的细胞群体中，才能安全地应用hESC来源的体细胞类型，因为残留的hESC在移植后可能引发畸胎瘤。为此，本文描述了一种利用单克隆抗体TG30（CD9）和GCTM-2，通过荧光激活细胞分选（FACS）检测与多能性相关的细胞表面抗原，以鉴定具有多能性的TG30你好-GCTM-2你好 通过阳性选择法使用hESCs。利用我们的TG30/GCTM-2 FACS负向筛选方法，我们能够在处于极早期分化阶段的细胞群体中检测并清除未分化的hESCs（TG30阴性-GCTM-2阴性）。在另一项研究中，TG30 分化的多能干细胞无样本阴性-GCTM-2阴性 使用我们TG30/GCTM-2 FACS方案筛选的细胞在移植至免疫缺陷小鼠后未形成畸胎瘤，表明该方案具有高度可靠性。另一方面，通过TG30/GCTM-2 FACS介导的连续传代可维持富集后的多能性TG30细胞你好-GCTM-2你好 hESCs 未影响其自我更新能力 体外 或其内在的多能性。因此，我们采用的TG30/GCTM-2 FACS方法具有高灵敏度，可用于在分化实验中富集获得高纯度的hPSC，同时清除衍生细胞群体中潜在致瘤性（或残留）的hESC。

通过连续传代P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）亚组分的细胞，可获得不含多能干细胞的hESC衍生成分。
既往研究已证实，在人胚胎干细胞（hESC）的标准培养条件下，存在多种亚群共存的现象，这些亚群表现出与多能性相关基因的表达梯度5,6,13。联合检测细胞表面抗原（如 TG30（CD9）和 GCTM-2）可区分处于多能状态及早期分化不同阶段的多个细胞亚群，其依据为这些细胞表达干细胞标志物及谱系特异性转录因子的情况5,6,13。与既往报道一致，我们在本研究所使用的人胚胎干细胞系 MEL1 中成功区分出 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）、P5（TG30Low-GCTM-2Low）、P6（TG30Mid-GCTM-2Mid）和 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞亚群（图1）。基于该结果，我们进一步分离了已分化的 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞和多能性的 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞，并用于后续培养，相关研究如下所述。
我们研究了是否可以通过负向筛选的方法，从处于早期分化阶段的细胞群体中清除未分化的hESCs（TG30Neg-GCTM-2Neg）。我们取定了数量的P4代（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞，在流式分选后连续培养约两周（图2A），并在每次传代前通过TG30/GCTM-2流式细胞术重新分析。结果显示，经过连续传代后，P4亚群中富集了TG30Neg-GCTM-2Neg的分化细胞类型；而在初始传代时（图2A，第1代）少量存在的P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞，随着进一步传代最终消失，从而获得不含多能性干细胞的样本（图2A，第3代）。
通过收集 TG30Hi-GCTM-2Hi 细胞，可实现多能性 hESC 细胞的富集。
根据此前使用该检测方法的观察结果，我们预期通过收集P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞可富集多能性人胚胎干细胞（hESCs），这些细胞应能形成hESC克隆。因此，我们还研究了通过TG30/GCTM-2荧光激活细胞分选（FACS）介导的多能性P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞连续传代。在这些P7培养物中，每次传代前均对细胞进行TG30/GCTM-2 FACS免疫分析，并仅将P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞重新培养。通过该方法，我们观察到大多数细胞位于与多能性相关的亚群（P6和P7）中，表明多能性细胞得到了富集，同时仍保留了一定的分化能力，并可生成少量P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞（图3A）。此外，P7细胞在传代过程中表现出大量类似hESC的克隆（图3B），也进一步说明其多能性状态得以维持。
<img alt="流式细胞术分析；hESC-MEL1细胞的散点图；细胞活力和饲养层状态；活细胞门控。" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 获取TG30/GCTM-2 FACS亚群的代表性分选策略。（A）：将解离后的人胚胎干细胞（hES细胞）悬液以单细胞形式进行分选，并通过前向散射光高度与面积（FSC-H和FSC-A）排除可能的细胞团块或双联体。（B）：利用FSC-A和SSC-A去除潜在碎片，仅保留完整细胞进行后续分选。（C）：根据碘化丙啶（PI）荧光信号（FSC-A和FL3-A）排除非活细胞。（D）：通过小鼠CD90.2-PE（FL2-A和SSC-A）的表达情况，采用阴性选择法去除MEF饲养层细胞。（E）：最终将不含MEF饲养层细胞的活hESC组分进一步分为P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）、P5（TG30Low-GCTM-2Low）、P6（TG30Mid-GCTM-2Mid）和P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）四个亚群。阴性门控（TG30Neg-GCTM-2Neg，命名为P4）根据未染色细胞的背景自发荧光及同型对照设定。（F）：TG30/GCTM-2流式细胞术分析中各门控亚群的典型百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="hESC-MEL1 培养物及传代的流式细胞术分析；细胞形态的显微镜图像。" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. hESC-MEL1 细胞系中自发分化的 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞的代表性连续培养结果。（A）：代表性 TG30/GCTM-2 流式细胞术（FACS）图谱，显示通过检测 TG30 和 GCTM-2 细胞表面标志物表达水平所区分的细胞门控亚群（P4、P5、P6 和 P7）。从 hESC-MEL1 细胞系的大规模培养物中收集初始数量为 400,000 的具有 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）免疫表型的 hESC 衍生细胞。这些 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞在分选后连续传代于支持 hESC 自我更新的培养条件下，在 T75 培养瓶中培养至汇合状态（11–13 天）。每次传代前均进行 TG30/GCTM-2 流式细胞术分析，仅收集并重新培养 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）分化细胞类型。（B）：培养 14 天后 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞单层的典型形态。（C）：仅在第 1 代时，在 P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞单层中偶尔可见的类似 hESC 的克隆，很可能来源于污染的 P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞。比例尺 = 200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="流式细胞术分析、hESC-MEL1分化、TG30/CD9与GCTM-2、细胞传代阶段示意图" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 来自hESC系的P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞可在流式细胞分选（FACS）后连续传代，且不丧失其固有的多能性特征。 对连续传代过程中代表性细胞群体进行TG30/GCTM-2流式细胞术免疫分析，根据TG30和GCTM-2的表达水平区分出不同的细胞亚群（P4、P5、P6和P7）。（A）： 从hESC-MEL1系的大规模培养物中分离出一个起始数量为400,000个、具有P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）特征的细胞群体。多能性P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞在支持hESC自我更新的条件下，在T75培养瓶中进行FACS后的连续传代，直至达到约80%融合度（9–11天）。每次传代前均进行TG30/GCTM-2流式细胞术免疫分析，仅将P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞重新接种培养。结果显示，P7（TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞在连续传代过程中保持其多能性特征，包括维持（TG30Hi-GCTM-2Hi）的表达、形成类似hESC的克隆集落（见B），以及保留分化潜能，这一点可通过每次FACS图谱中重现少量已分化的P4（TG30Neg-GCTM-2Neg）细胞亚群得以推断。比例尺 = 200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品（反应体积）</td>
			<td>一抗</td>
			<td>二抗</td>
			<td>PE 大鼠抗小鼠 CD90.2 b </td>
			<td>碘化丙啶 c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分选样品（一抗约 9 ml，二抗 2.5 ml）</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2)a</td>
			<td>AF 488 山羊抗小鼠 IgG2a + AF 647 山羊抗小鼠 IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-1：TG30（200 μl）</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 山羊抗小鼠 IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-2：GCTM-2（200 μl）</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 山羊抗小鼠 IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-3：抗小鼠 CD90.2（200 μl）</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-4：藻红蛋白（PE）（200 μl）</td>
			<td>小鼠 IgG2a 同型对照</td>
			<td>R-藻红蛋白山羊抗小鼠 IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-5：小鼠免疫球蛋白同型对照（200 μl）</td>
			<td>小鼠 IgG2a 同型对照 + IgM 同型对照</td>
			<td>AF 488 山羊抗小鼠 IgG2a + AF 647 山羊抗小鼠 IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照-6：未染色细胞（200 μl）</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. FACS分选中的分选样本与对照。 a分选样本同时使用TG30和GCTM-2抗体进行免疫染色。b使用PE-anti-mouse CD90.2识别小鼠细胞，并在FACS过程中从人胚胎干细胞（hESCs）中去除MEFs14。c通过碘化丙啶排除非活细胞，终浓度为0.3 μg/ml。试剂已添加（+），未添加（-）至反应管中。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体 </td>
			<td>宿主</td>
			<td>同种型</td>
			<td>工作稀释度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG30 (1.4 mg/ml)</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTM-2 (杂交瘤上清液)</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>IgM</td>
			<td>1:5 ~ 1:10 a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF 488 山羊抗小鼠 IgG2a</td>
			<td>Goat</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF 647 山羊抗小鼠 IgM</td>
			<td>Goat</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-藻红蛋白 (PE) 山羊抗小鼠 IgG2a</td>
			<td>Goat</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗小鼠 CD90.2</td>
			<td>Rat</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化小鼠 IgG2a, κ 同种型对照</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纯化小鼠 IgM, κ 同种型对照</td>
			<td>Mouse</td>
			<td>IgM</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 用于FACS分选的抗体详细信息及稀释比例。 a 由于GCTM-2在hESC细胞表面表达水平极高，无法通过该抗体达到饱和。每批GCTM-2杂交瘤上清液必须相对于标准对照或前一批次进行滴定，以在hESC上获得一致的分选规模结果，并避免过度染色。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养基名称</td>
			<td>成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC/KOSR 培养基</td>
			<td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12 (DMEM/F-12)，添加 20% Knockout 血清替代物 (KOSR)、2 mM GlutaMAX、1% MEM 非必需氨基酸、0.1 mM 2-巯基乙醇、10 ng/ml 人成纤维细胞生长因子 2 (FGF-2) 以及 1× 青霉素-链霉素 (Pen/Strep)。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEF 培养基</td>
			<td>高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，添加 10% 胎牛血清 (FBS)、2 mM GlutaMAX 以及 1× 青霉素-链霉素 (Pen/Strep)。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 培养基的组成。

我们介绍了单克隆抗体 TG30（CD9）和 GCTM-2 在联合检测细胞表面抗原中的应用，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术对活体人胚胎干细胞（hESC）进行鉴定和富集，采用阳性筛选&#160;，同时也利用阴性筛选从混合细胞群体中清除 hESC。

利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原富集与清除人胚胎干细胞

人类胚胎干细胞（hESC）可在体外无限自我更新，并在适当信号诱导下分化为几乎所有类型的细胞……

本实验的总体目标是通过 TG30 和 GCTM-2 两种单克隆抗体对细胞表面抗原的结合特性，对人类胚胎干细胞亚群进行分选。首先将人类胚胎干细胞（hESC）培养物解离为单细胞悬液；第二步，使用单克隆抗体 TG30 和 GCTM-2 对 hESC 进行染色。最后，通过荧光激活细胞分选法将细胞分离，并重新进行培养。最终，可通过流式细胞术和相差显微镜评估分选后细胞的集落形成能力。该技术相较于现有方法（如肉眼观察）的主要优势在于，它能够对大量细胞在单细胞水平上提供关于多能性的一个客观衡量指标，从而有助于将胚胎干细胞与已分化细胞分离开来。该方法有助于回答多能性研究领域中的关键问题，例如培养条件的变化如何定量影响不同的人胚胎干细胞系和人诱导性多能干细胞系。今天演示该实验步骤的是我实验室的研究人员 George Zoe Hun Chi 和 Bay Wang。要制备Hess单细胞悬液，首先从两个含有培养的Hess细胞系的T75培养瓶中吸除Hess培养基。每个培养瓶用10毫升DPBS洗涤一次，然后在37摄氏度、5%CO2条件下，每个培养瓶加入3毫升三重E表达解离溶液进行孵育。五分钟后，轻敲培养瓶侧面以使细胞脱落，然后在显微镜下确认细胞是否已完全脱离。接着，使用无菌的10毫升移液管向每个培养瓶中加入10毫升冷培养基。轻轻反复吹打贴壁的解离细胞数次，以获得以单细胞为主的悬液。现在将单细胞悬液通过70微米细胞滤网收集到无菌的50毫升聚丙烯管中，用于染色Hes细胞表面抗原。首先，将约100,000个细胞用150微升培养基分装至六个对照用1.5毫升微量离心管中。接着，将对照管及剩余分选样品分别与目标一抗在终体积为200微升和约9毫升的培养基中孵育，培养基中需包含同型对照抗体。将离心管水平放置在冰上，并在摇动平台上轻轻混匀30分钟。离心沉淀细胞后，弃去上清液，然后用20毫升冷培养基洗涤分选样品，对照样品则用200微升相同培养基洗涤。现在将分选样品在2.5毫升终体积的冷培养基中与适当的二抗孵育，对照样品则在200微升终体积的相同培养基中孵育；同时向相应的对照管中加入新配制的PE抗-US CD 90.2抗体。再次将离心管置于摇床上，在冰上水平轻柔混匀30分钟。离心沉淀细胞后，将分选样品重悬于20毫升冷培养基中，对照组则重悬于200微升中，并用培养基洗涤细胞两次。将分选样品重悬于2至3毫升含碘化丙啶的冷培养基中，除未染色细胞外，各对照组均重悬于300微升相同培养基中。然后将每份单个细胞悬液通过与5毫升聚苯乙烯圆底试管相连的35微米孔径滤网盖过滤，并离心试管，使滤网盖上残留的任何细胞悬液进入试管中。随后轻敲试管壁，重新悬浮每份单细胞悬液，并将细胞置于冰上。设置流式细胞仪进行TG30和GCTM-2的荧光激活细胞分选，使解离的Hess细胞悬液被设门为单细胞，以排除可能的细胞团块和双联体。接下来，利用前向散射和侧向散射门去除可能存在的碎片，仅保留完整的细胞进行分选。然后根据碘化丙啶的表达情况排除非活细胞。通过阴性筛选，根据小鼠CD 90.2 pe的表达情况去除小鼠胚胎成纤维细胞或甲醇饲养细胞。根据未染色细胞和同型对照的背景自发荧光，设定TG 30 G CTM双阴性门。随后，最终可将不含饲养层细胞的活体HESC组分进一步分选为TG 30阴性GCT M双阴性、TG 30低表达GCT M双低表达、TG 30中等表达GCT M双中等表达以及TG 30高表达GCTM双高表达亚群。设置流式细胞仪后，向两个5 mL聚苯乙烯圆底试管中各加入1 mL甲醇条件培养基，并置于冰上。然后，分别从已分化的 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞亚群和多能性 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞亚群中各回收 400,000 个细胞。将收集管离心后，将每个细胞沉淀重悬于 1 毫升预先平衡的 MEF 条件培养基中。随后，将来自每个细胞亚群的 hESC 接种至预先平衡、MEF 密度为三分之一的 T75 培养瓶中，使用甲醇处理的条件培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下培养细胞，每日更换培养基，持续约两周。多能性 TG30 高表达、GCTM-2 高表达细胞的培养物在培养一周后呈现类似人类干细胞的克隆形态，并在 9 至 11 天时达到约 80% 的汇合度。而 TG30 阴性、GCTM-2 阴性细胞的培养物则主要以类似成纤维细胞的单层细胞形式生长，并在 11 至 13 天时达到汇合状态。联合检测细胞表面抗原 TG30 与 GCTM-2 可以区分多能阶段以及早期人胚胎干细胞（hESC）不同分化阶段的多个细胞亚群，这一结果与既往报道一致，表现为这些亚群表达干细胞标志物及谱系特异性转录因子。如本研究所采用的人胚胎干细胞男性 1 号细胞系所示，TG30 阴性、GCTM-2 阴性、低表达、中表达及高表达的不同亚群可被有效区分。本实验展示了 TG30 与 GCTM-2 流式细胞术分析中典型的不同设门亚群所占百分比。分选后，将确定数量的TG30阴性GCTM2阴性细胞连续培养约两周，然后重新分选，仅收集TG30阴性GCTM2阴性细胞亚群，再进行传代培养。每次传代结果表明，初始的TG30阴性GCTM2阴性亚群在连续传代培养后富集了TG30阴性GCTM2阴性分化细胞。在初次传代时可检测到少量TG30高表达GCTM2高表达细胞，但随着进一步传代培养，这些细胞最终消失，仅留下无多能干细胞的样本。此处显示的是分化后的 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞在培养 14 天后的典型菌苔形态。请注意，在培养 14 天后，可见零星分布的类似人胚胎干细胞（HESC）的克隆，它们与 TG30 阴性 GCTM2 阴性细胞混合存在，这些克隆很可能来源于污染的 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞。但需注意，这种情况极为罕见；根据此前使用该检测方法的观察结果，在初次传代后，分离和培养 TG30 高表达 GCTM2 高表达细胞有望富集具有克隆形成能力的多能性 HSCs。因此，在这些代表性培养物中，也研究了通过流式细胞术分选后的多能性TG 30高表达、GCTM-2高表达细胞的连续传代情况；细胞使用TG 30和GCTM-2进行分选，每次传代仅保留TG 30高表达、GCTM-2高表达的细胞。通过这种方式观察到，大部分细胞位于与多能性相关的亚群中，表明获得了富集的多能性细胞群体，这些细胞仍具有分化能力，并可再生出少量TG 30阴性、GCTM-2阴性的细胞。此外，连续传代的TG 30高表达、GCTM-2高表达分选细胞在传代后表现出大量类似人胚胎干细胞（hESC）的克隆，也进一步说明其多能性状态得以维持。在进行该实验操作时，重要的是每次使用前均需校准传真机，以确保按照此实验流程获得结果的可重复性。在该技术建立后，还可采用其他方法（如微阵列、全基因组测序或畸胎瘤形成实验）来回答诸如“这些细胞是否真正具有多能性”等问题。该技术为诱导性多能干细胞领域的研究人员提供了基础，使其能够比较诱导性多能干细胞与人胚胎干细胞在安全性和稳定性方面的差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何仔细制备和染色人胚胎干细胞的混合培养物，以富集壁细胞。请务必注意，操作人源细胞可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须始终采取相应预防措施，例如佩戴手套并在二级生物安全柜内操作。

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了解利用TG30和GCTM-2单克隆抗体通过流式细胞术分选人类胚胎干细胞的方法。该技术可实现多能性细胞的阳性富集与分化细胞的阴性清除，为干细胞生物学研究提供客观评估手段。

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