In Situ Ca ²⁺ Imaging des enterischen Nervensystems

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in lebenden Ganzbettpräparaten des Darms unter Verwendung von fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zuerst ein Teil des Darms aus dem Tier herausgeschnitten und in ein vorgewärmtes Medium gelegt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Darm entlang der Mesenterialgrenze zu öffnen und unter leichtem Zug mit der Schleimhautoberfläche nach oben flach zu stecken.

Ganze Präparate des Plexus myentericus werden durch Mikrodissektion präpariert und in bildgebende Schalen gelegt. Als nächstes werden die gesamten Montierungspräparate mit einem fluoreszierenden Indikatorfarbstoff flu oh four in einen Inkubator geladen. In den letzten Schritten werden die geladenen Präparate mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet ist, die von einer Bildaufnahme- und Analysesoftware gesteuert wird, um die Basisaktivität aufzuzeichnen.

Dann werden die zu untersuchenden Medikamente zugegeben und Kalziumtransienten in Neuronen und Gliazellen aufgezeichnet. Letztlich vor Ort. Die Kalziumbildgebung des enterischen Nervensystems wird verwendet, um zu untersuchen, wie die zelluläre Aktivität in Neuronen und Gliazellen zur Regulierung der physiologischen Darmfunktionen und zur Dysfunktion des enterischen Nervensystems in der Darmpathophysiologie beiträgt.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Schaffung eines Verständnisses der Physiologie und Pathophysiologie von funktionellen Darmerkrankungen und entzündlichen Darmerkrankungen durch die Verwendung einer einfachen und robusten Methode zur Untersuchung des komplexen Zusammenspiels zwischen Neuronen und enterischen Gliazellen unter Verwendung von NC zwei Kalzium-Bildgebung, die dieses Verfahren demonstriert, wird den Wissenschaftlern aus meinem Labor David frei sein. Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Labortieren stimmen mit den A VMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 überein und wurden im Voraus von der Michigan State University I-A-C-U-C genehmigt. Nachdem Sie das Tier gemäß den zugelassenen Verfahren eingeschläfert haben, legen Sie das Tier in Rückenlage und reinigen Sie die Haut über dem Bauch mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchhaut in der Mittellinie einzuklemmen, und verwenden Sie dann eine chirurgische Schere, um einen sechs Zentimeter langen medialen Schnitt entlang des linearen Ellbogens zu machen, um die inneren Verdauungsorgane freizulegen.

Verwenden Sie als Nächstes eine stumpfe Pinzette, um den Dickdarm im Peritoneum zu lokalisieren und freizulegen. Schneiden Sie das ileale Dickdarmmesenterium mit einer Schere ab und beginnen Sie, den Darm zu entwirren. Sobald die Länge des Darms ausreichend entwirrt ist, schneiden Sie den Dickdarm distal zum Blinddarm und proximal zum Rektum für eine Dickdarmvorbereitung, die in diesem Video gezeigt wird.

Entfernen Sie dann schnell den Darmabschnitt und legen Sie ihn in ein Becherglas mit DM EMF 12 Media, ergänzt mit drei mikromolaren Nicardipinhydrochlorid und einem mikromolaren S Scopolaminhydrochlorid auf Eis. Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert die Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung, indem die glatte Darmmuskulatur gelähmt wird. Entnehmen Sie ein kleines vier bis sechs Zentimeter großes Segment des gewünschten Darmabschnitts und legen Sie es in eine mit gekühltem Ergänzungsmedium gefüllte, mit Sylguard beschichtete Petrischale.

Befestigen Sie dann die proximalen und distalen Enden des Darmsegments mit Insektennadeln und öffnen Sie den Darmschlauch, indem Sie einen geraden Längsschnitt entlang der mesenterialen Grenze machen. Stecken Sie nun das Gewebe unter leichtem Zug mit der Schleimhautseite nach oben flach und präparieren Sie vorsichtig die Schleimhautschicht, indem Sie die Schleimhaut mit der Nummer fünf feinen Pinzetten anheben und mit einer sehr feinen Federschere darunter schneiden. Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Präparate von etwa 0,5 Zentimetern im Quadrat und legen Sie jedes Stück in eine mit supplementierten Medien gefüllte Bildgebungsschale und legen Sie es auf Eis.

Stecken Sie jedes Präparat an vier Ecken mit einer kreisförmigen Muskelschicht nach oben. Sezieren Sie den kreisförmigen Muskel vorsichtig weg, indem Sie ihn mit einer feinen Pinzette auseinander ziehen. Um den Plexus myentericus freizulegen, vermeiden Sie übermäßige Dehnung, stellen Sie die Bildgebungsschalen wieder auf Eis und ersetzen Sie die Lösung in jeder Schale durch frisches ergänztes Medium.

Nehmen Sie dann die Schalen aus dem Eis und geben Sie zwei Milliliter Enzymmischung zu jeder Schale und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft. Zum Schluss waschen Sie die Gewebepräparate dreimal mit Medien und ziehen Sie die Ecken unter Bedingungen begrenzter Lichtverhältnisse zurück, um ein Photobleichen bei 1,5 Millilitern ergänztem Medium und 1,2 Mikrolitern eines 250 Millimolar Probit-Stoffes zu einem 1,5 Mikroliter Eloqua von vier Millimolaren Fluro vier Brühen bei etwa 1,5 Millilitern Grippe oh vier Ladelösung in die Bildgebungsschalen zu vermeiden und inkubieren Sie in einem dunklen Inkubator bei 37 Grad Celsius für 45 Protokoll. Nachdem Sie das Geschirr aus dem Inkubator genommen haben, waschen Sie die Präparate dreimal mit Medien.

Fügen Sie dann frische Medien mit 200 mikromolaren Stützsäuren hinzu, um die neuronale Markierung zu verbessern, und inkubieren Sie wie zuvor 15 Minuten lang. Stellen Sie während der Inkubation einen modifizierten Krebspuffer gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls her und fügen Sie drei mikromolare Nicardipin und ein mikromolares Scopolamin hinzu, um die Muskelkontraktionen zu hemmen. Während der Calcium-Two-Plus-Bildgebung und der Dissektion der gesamten Montierung wird die Aufnahmekammer unter dem Fluoreszenzmikroskop und unter Verwendung eines Schwerkraftflussperfusionssystems mit mehreren beheizten Spritzenbehältern positioniert.

Stellen Sie eine kontinuierliche Perfusionsrate von zwei bis drei Millilitern pro Minute mit 37 Grad Celsius Krebspuffer her. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen sowohl im Eingang als auch in der Saugleitung bilden, die mit einer Vakuumfalle verbunden ist. Bringen Sie den gewünschten Plexus unter Hellfeldbeleuchtung in den Fokus.

Vermeiden Sie eine Überbelichtung des Gewebes, die zu Photobleaching führen kann. Untersuchen Sie die Grippe-Oh-Vier-Belastung in den Ganglien und wählen Sie gesunde Ganglien für die Bildgebung aus. Ungesunde geschädigte Ganglien weisen Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie auf und sollten nicht für die Bildgebung verwendet werden.

Sobald ein Ganglion ausgewählt ist, lenken Sie den Lichtweg zur Kamera und erhalten Sie ein Live-Bild. Stellen Sie mit einer Bilderfassungssoftware sicher, dass das Ganglion scharf ist, und stellen Sie die Bildaufnahmerate und die Belichtungszeiten ein. Die Bildaufnahmeraten und -zeiten variieren je nach den Ereignissen, die die Ermittler aufzeichnen möchten. Für die meisten Experimente werden Bilder traditionell bei 0,5 bis 1 Hertz für Gliazellen und bis zu zwei bis 10 Hertz aufgenommen.

Für Neuronen, da gliale Calcium-Transienten nicht so schnell sind wie Calcium-Transienten-Neuronen, Starten Sie die Aufzeichnung und ermitteln Sie die physiologische Grundaktivität des ausgewählten Ganglions in Abwesenheit von experimentellen Stimuli für 30 Sekunden. Wenden Sie dann vorwärmte Medikamente wie Rezeptoragonisten und Antagonisten mit dem Schwerkraft-Flow-Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von zwei bis drei Millilitern pro Minute gemäß einem für Ihr Medikament optimierten Protokoll an. Stoppen Sie die Aufzeichnung und sehen Sie sich den Zeitrafferfilm des Experiments an.

Wählen Sie die interessierenden Bereiche oder ROIs mit der entsprechenden Bildanalysesoftware sorgfältig aus. Verwenden Sie schließlich eine geeignete Bildgebungssoftware, um die Fluoreszenzintensität der interessierenden Regionen zu normalisieren und mit dem anfänglichen Ausgangswert zu vergleichen. Änderungen der normalisierten Fluoreszenz sind direkt proportional zu Änderungen des Kalziums. Die folgenden drei Bilder zeigen, dass enterische Gliazellen beim Meerschweinchen auf eine TP in situ ansprechen.

Unter basalen Bedingungen ist eine niedrige Fluoro-Vier-Fluoreszenz sichtbar, die durch die gestrichelte Linie umrissen wird. Die Pfeile zeigen auf dicke interganglionäre Faserbahnen bei Stimulation mit 100 Mikromo pro Liter A TP Gliazellen, aber nicht Neuronen erhöhen schnell die Fluoro-4-Fluoreszenz, was auf einen Anstieg des Kalziums hinweist. Beachten Sie, dass die reagierenden Zellen klein sind und die viel größeren Neuronen umgeben, die durch die durch Sternchen gekennzeichneten dunklen Räume gekennzeichnet sind.

Dieses Histogramm zeigt, dass enterische Gliazellen dosisabhängig auf eine TP reagieren, wobei ein Millimol pro Liter maximale Reaktionen hervorruft. Dieses Video zeigt ein myenterisches Ganglion aus dem distalen Dickdarm der Maus, das mit einem Kalzium-Zwei-Plus-Indikatorfarbstoff Flu Oh Four beladen ist. Der Gliazellagonist a DP wird dem Bad zugesetzt, wenn dies angezeigt ist.

Eine DP führt zu einem Anstieg des intrazellulären Calcium zwei plus in der enterischen Glia, wie bei der vorübergehenden Erhöhung der Fluoreszenz von Flu oh vier beobachtet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das komplexe Zusammenspiel zwischen Neuronen und empirisch mit Hilfe der Kalziumbildgebung genau untersuchen können. Die Charakterisierung der Mechanismen und möglichen funktionellen Konsequenzen von Kalziumreaktionen in Ganzpräparationen erfordert präzise Dissektionen für eine ideale Bildqualität.

Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung und pharmakologischen Stimuli innerhalb dieser mikroskopiebasierten Technik ermöglicht eine verbesserte Beurteilung dieser Zellen in ihrer nativen mehrzelligen Umgebung.