Name: Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri come generare alleli murini con telomerasi inducibile per studiare degenerazione e rigenerazione tissutale e il cancro. Questo metodo utilizza tamoxifene per riattivare la telomerasi in vivo e in vitro.

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J.H. è supportato dal NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) e dal NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOTA: Tutti i passaggi di questo protocollo sono stati approvati da UT MD Anderson Cancer Center. 1. Generazione di mTERT-ER Allele <ol><li> Introdurre knock-targeting vettore contenente il ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) a monte e nel telaio con la sequenza genomica mTERT (esone 1 a introne 2) e un Lox - PGK - Neo - Lox frammento (Figura 1A) in cellule ES di topo con elettroporazione. </li><li> Coltivare le cellule ES in neomicina per 6-10 giorni. Scegli cloni neomicina-resistente ed espandere in 48 pozzetti. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit commerciale e confermare il knock-in allele dalla macchia del sud. </li><li> Iniettare due linee ES con oltre il 95% cariotipo normale in C57BL / 6 blastocisti con un kit di micromanipolazione sotto un microscopio invertito. Impiantare le blastocisti nell&#39;utero di madri surrogate 23. Mate le chimere maschili di alta qualità (70-90%) a C57BL / 6 femaschi. </li><li> Confermare la genotipizzazione di eterozigoti animali mTERT-ERneo blot sud. </li><li> Mate gli eterozigoti animali mTERT-ERneo e animali EIIA-Cre per eliminare la cassetta neor. Mate gli animali eterozigoti per C57BL / 6 animali per almeno tre volte, e ulteriori inter-razza eterozigoti animali mTERT-ER per generare omozigosi. </li></ol> 2. Generazione di LSL-mTERT Allele <ol><li> Introdurre il knock-in di targeting vettore contenente un loxP - tripla Stopper - Neo - frammento loxP e la sequenza genomica mTERT (tra esone 1 e introne 2, Figura 1B) in cellule staminali di topo con elettroporazione 23. </li><li> Coltivare le cellule ES in neomicina per 6-10 giorni. Scegli cloni neomicina-resistente ed espandere in 48 pozzetti. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit commerciale e confermare il knock-in allele dalla macchia del sud 23. </li><li> Inject due ES linee con oltre il 95% cariotipo normale in C57BL / 6 blastocisti con un kit di micromanipolazione sotto un microscopio invertito. Impiantare le blastocisti nell&#39;utero di madri surrogate 23. Mate le chimere maschili di alta qualità (70-90%) per C57BL / 6 femmine. </li><li> Confermare la genotipizzazione di eterozigoti animali LSL-mTERT blot sud. </li><li> Mate gli animali eterozigoti per C57BL / 6 animali per almeno tre volte, e in seguito inter-razza eterozigoti animali LSL-mTERT per generare omozigosi. </li></ol> 3. La riattivazione della telomerasi in mTERT-ER e Mice LSL-mTERT In Vivo Per mTERT-ER <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell&#39;iniezione. </li><li> Anestetizzare topi con camera di isoflurano (4% per l&#39;induzione, 2% per il mantenimento) in 50% (v / v) di ossigeno / 50% (v / v) miscela di monossido di diazoto. Oppure anestetizzare i topi da una miscela di ketamina-xylazina (100 mg / kg di peso corporeo + 10 mg / kg di peso corporeo). </li><li> Dopo aver raggiunto l&#39;anestesia profonda, rimuovere l&#39;animale anestetizzato dalla camera di induzione, e mantenere la testa all&#39;interno del tubo collegato alla camera isoflurano (2%). </li><li> Pizzicare poggia piedi dei topi per assicurare l&#39;animale è anestetizzato profondamente. Mettere unguento su entrambi gli occhi per evitare gli occhi secchi. Pulire la parte posteriore dei topi con la soluzione iodopovidone. </li><li> Iniettare il lento rilascio pellet 4-OHT con trochar precisione (10 G) sotto la pelle del dorso e spingere il pellet fino alla linea mediana tra le due spalle. </li><li> Sigillare l&#39;incisione con clip ferita applicatore e controllare il mouse per il recupero dall&#39;anestesia. Rimuovere i clips 10 giorni più tardi. Di calore supplementare non è necessario perché la procedura è terminata breve. </li><li> Periodo di trattamento con 4-OHT pellet dovrebbe essere ottimizzato secondo lo scopo dello studio. </li></ol> Per LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifene (10 mg / ml, disciolto in olio di mais) viene iniettata per via intraperitoneale due giorni consecutivi (200 ul / 25 g / giorno). </li></ol> 4. Isolamento delle cellule staminali neurali e la riattivazione della telomerasi in vitro <ol><li> I topi vengono sacrificati con anidride carbonica e il cervello vengono rimossi. Seguire il protocollo di disponibile in commercio kit dissociazione tessuto neurale come per fabbricante. </li><li> Risospendere la polvere liofilizzata nel flaconcino etichettato Soluzione 4 con 1 ml di mezzo di coltura cellulare per Soluzione 4. Non vortex. Questa soluzione deve poi essere aliquotati e conservati a -20 ° C per un uso successivo. </li><li> Pre-Riscaldare la miscela a 37 ° C per 15 min prima dell&#39;uso. </li><li> Fai Enzyme Mix 1: Soluzione 1 (50 ml) e Soluzione 2 (1.900 ml). Fai Enzyme Mix 2: Soluzione 3 (20 microlitri) e Soluzione 4 (10 microlitri). </li><li> Preparare 1.950 ml mix enzima 1 fino a 400 mg di tessuto e vortex. Pre-riscaldare la miscela a 37 ° C per15 min prima dell&#39;uso. </li><li> Estrarre il cervello di topo di 1 giorno, e mantenere le forebrains rimuovendo i bulbi olfattivi e il cervelletto. Mantenere i tessuti prosencefalo in 1 ml di terreno di coltura freddo, in quanto la rimozione e conservare in 4 ° C. Assicurati di elaborare il tessuto neurale entro 1 ora. </li><li> Determinare il peso del tessuto per assicurarsi che il limite di 400 mg per digestione non venga superata. Posizionare il cervello sul coperchio di un piatto Petri del diametro di 35 mm, e schiacciare il cervello utilizzando un bisturi. </li><li> Usando una pipetta 1 ml, aggiungere 1 ml di HBSS (w / o Ca / Mg) e pezzi pipetta di nuovo in un tubo da 15 ml. Risciacquare con HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifugare a 300 xg per 2 minuti a temperatura ambiente ed aspirare accuratamente il surnatante. </li><li> Aggiungere 1.950 ml di miscela enzimatica pre-riscaldata (1 Soluzioni 1 e 2) per fino a 400 mg di tessuto. Incubare nel tubo 15 ml per 15 minuti a 37 ° C, miscelazione o agitazione invertendo il tubo ogni 5 min. </li><li> Preparare 30 microlitri enzima mix 2 per campione di tessuto con l&#39;aggiunta di 20 &amp; #956; l di Soluzione 3-10 ml di soluzione di 4. Poi aggiungi a campione. Capovolgere delicatamente per mescolare. Non fare vortex. </li><li> Dissociarsi tessuto meccanicamente un ampio a punta, incendio lucidato pipetta Pasteur pipettando su e giù per 10 volte lentamente. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Incubare a 37 ° C per 10 minuti, invertendo il tubo ogni 3 min. </li><li> Ripetere il passo 4.11 e passo 4.12 se i tessuti sono più grandi di 200 mg. </li><li> Applicare la sospensione cellulare ad un filtro cella di 70 micron, collocato su un tubo da 50 ml. Applicare 10 ml di PBS attraverso filtro cellulare. Eliminare filtro cellulare e sospensione cellulare centrifugare a 300 g per 20 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante completamente. </li><li> Risospendere le cellule con supporto di cellule staminali per il volume richiesto per ulteriori applicazioni. </li><li> Per attivare la telomerasi in LSL-mTERT NSC, trattare le cellule con 100 micron 4 OHT per due giorni. Per attivare la telomerasi in mTERT-ER NSC, mantenere le cellule in terreno di coltura con 100 micron 4-OHT. </li></ol> 5. telomeri FISH <ol><li> Preparare i cromosomi in metafase da cellule in coltura. </li><li> Per FFPE (formalina imbevuti di paraffina fissati) sezioni di tessuto, Deparaffinare in xilene e reidratare in serie etanolo per 5 minuti ciascuno (100%, 90%, 70%, il 50% di etanolo) e PBS per 5 min. </li><li> Post-fix in metanolo: acido acetico (3: 1) per 1-2 ore. Disidratare in serie etanolo freddo per 5 minuti ciascuno (70%, 90%, 100% etanolo) e asciugare all&#39;aria. Lavare in 1x PBS a 37 ° C per 5 min. </li><li> Denaturare cromosomi in formaldeide al 4% a 37 ° C per 2 min. Disidratare in serie etanolo freddo 5 min ciascuna (70%, 90%, 100% di etanolo) e aria secca. </li><li> Applicare i 12 ei 25 microlitri della miscela di ibridazione PNA per ogni diapositiva. (Mix Ibridazione: 70% formammide, 0.06x SSC, 0,2% di BSA, / ul tRNA, 0,5 ng / ml o telomeri centromero sonde 0,5 ng) </li><li> Sigillare il vetrino con mastice. Post-denaturare preparazioni cromosomiche e sezioni di tessuto a 80 ° C per 4 min. ibridazione a temperatura ambiente oa 37 ° C per 2-4 ore in camera umida. </li><li> Lavare a temperatura ambiente con tampone di lavaggio 2 x 15 min. (Tampone di lavaggio: 70% formammide, 0.06x SSC, pH 7,2). Lavare a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con PBST. Scivoli Counter-macchia con DAPI o fluorescenza lontano rosso per l&#39;esame microscopico. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui riportiamo la generazione di due alleli inducibili telomerasi murino e come riattivare telomerasi in vivo e in vitro. Il passo fondamentale per riattivare l&#39;attività mTERT-ER è quello di mantenere una concentrazione continua di tamoxifene, così abbiamo scelto di usare 4-OHT pellets tempo a rilascio fabbricati da Ricerca Innovativa of America. Il pellet tenere rilasciando 4OHT ad un livello stabile di sangue di 1 ng / ml per un massimo di 60 giorni. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che riattivando l&#39;attività della telomerasi con questa strategia è stato in grado di migliorare i fenotipi degenerative come l&#39;esaurimento delle cellule staminali, compromissione delle risposte lesioni dei tessuti e insufficienza d&#39;organo in più organi che sono stati indotti da una disfunzione dei telomeri in G4 mTERT ER / ER topi 20. Altro che studiare la funzione della telomerasi nell&#39;invecchiamento, questi due alleli telomerasi inducibili possono anche essere usati per studiare il cancro. Studi precedenti hanno presovantaggio di questi alleli per esplorare il ruolo del telomero attrito e la riattivazione della telomerasi nel plasmare i genomi e impatto sulla biologia delle cellule T linfoma timica 21 e il cancro alla prostata 22. Questi due studi hanno dimostrato che la disfunzione dei telomeri in tarda generazione G4 Atm - / - mTERT ER / ER e G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L topi fornisce un meccanismo alimentando l&#39;acquisizione dei primi eventi mutageni per tumore iniziazione, ma prevenire la progressione dei tumori maligni completamente. Quando telomerasi è stata riattivata nel contesto di instabilità genomica telomero disfunzione indotta, di controllo del danno al DNA e rampante instabilità cromosomica sono stati soppressi, che ha permesso la piena progressione dei tumori maligni, con nuove proprietà biologiche, come metastasi ossee del cancro alla prostata 21 e infiltrazione cervello thymic linfoma 21. Fenomeni simili sono stati osservati anche in altri tipi di cancro, tra cui il cancro del colon e del pancreas (comunicazioni personali con Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin e Ronald DePinho). Poiché le proteine ​​TERT-ER può essere facilmente attivata tra on e off membri a seconda che gli animali sono trattati con tamoxifen o veicolo, i modelli tumorali generati da mTERT-ER allele possono essere utilizzati per testare una terapia anti-telomerasi. Nello studio precedente, i tumori generati in G4 Atm - / - mTERT ER animali / ER sono stati rilasciati dal 4-OHT; sulla telomerasi esaurimento, alla fine si è ridotto a causa di tumori al ripristino di telomeri disfunzione indotta checkpoint 21. Tuttavia, alcuni dei tumori resistenza acquisita in risposta a telomerasi estinzione attivando un allungamento dei telomeri alternativo (ALT) Meccanismo. Ulteriore caratterizzazione di questi tumori ALT + resistenti mostrato che they avere la trascrizione aberrante di geni coinvolti nella biologia mitocondriale e la difesa ossidativa tra cui il principale regolatore di mitocondriale sintesi e ossidativo difesa PGC-1β. Knockdown di PGC-1β o SOD2 (un altro regolatore di difesa ossidativo) elimina significativamente cellule ALT + tumorali mentre continuano le cellule telomerasi + tumorali rimangono relativamente intatte 21. Un limite di questi due alleli knock-in è che possono permettersi solo riattivazione della telomerasi a livello endogeno perché sono nel locus nativo del gene telomerasi. Nella maggior parte dei tumori umani, la telomerasi è in realtà iperespresso ad un livello molto più alto. Al fine di migliorare il livello di telomerasi, una modifica che possiamo considerare è quello di inserire il costrutto mTERT-ER con un promotore forte come PGK (fosfoglicerato chinasi) promotore in Rosa26 locus. In conclusione, questi due nuovi inducibile alleli telomerasi murini forniscono genet senza precedentistrumenti ic per studiare le funzioni di telomerasi nell&#39;invecchiamento e omeostasi tissutale e la progressione del tumore, specialmente sotto lo sfondo di pre-acquisito telomero disfunzione indotta instabilità genomica. L&#39;allele mTERT-ER può essere utilizzato anche per studiare la terapia anti-telomerasi attraversando in altri modelli murini di tumore-incline.

La telomerasi è un enzima responsabile del mantenimento dei telomeri. Si tratta di sequenze ripetitive alle estremità dei cromosomi che proteggono la loro integrità. I componenti principali della telomerasi holoenzyme sono una subunità trascrittasi inversa catalitica (TERT) ed una subunità RNA (TERC) che funge da modello per l&#39;aggiunta del telomeric ripete 1,2. Mentre generalmente soppressa nelle cellule somatiche differenziate, telomerasi mostra un&#39;attività solida e svolge un ruolo importante nelle cellule germinali, le cellule tumorali e cellule staminali. mTERC e mTERT topi knockout forniscono grande in sistemi modello vivo per studiare le funzioni della telomerasi nelle cellule staminali e il cancro. Il mTERC e mTERT topi knockout (G1) non hanno mostrato alcun fenotipi evidenti a causa della lunga riserva dei telomeri nei topi 3. Tuttavia, in serie incrociando mTERC e mTERT topi knockout a fine generazione (G5-G6) portato inprogressiva erosione dei telomeri e, infine, ha provocato una grave degenerazione dei tessuti altamente proliferative 4. Tardo generazione (G5-G6) mTERC - / - mice sono infertile a causa degli alti tassi di apoptosi in testicoli e germe deplezione delle cellule. G5-G6 mTERC - / - mice anche esporre fenotipi degenerative nei tessuti altamente proliferative, tra cui il midollo osseo, intestino e pelle a causa di alti tassi di apoptosi e difettosa capacità di auto-rinnovamento nel tessuto staminali / progenitrici compartimenti cellulari 4. Le cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo del tardo generazione mTERC - / - mice perdita mostra di potenziale proliferativo, compromessa capacità di auto-rinnovamento, maggiore apoptosi e, infine esaurimento funzionale 5,6. Allo stesso modo, progressivamente aumentato corpi apoptotici in cripte intestinali sono stati osservati in ogni successiva generazione di G1-G6 mTERC - / - mice 7,8. Tha effetto deleterio dei telomeri disfunzionali non sembra essere limitata ai tessuti di alta cifra di affari in quanto sia la proliferazione delle cellule staminali neurali adulte in vitro e la neurogenesi in vivo sono stati gravemente deteriorati a fine generazione (G4-G5) mTERC - / - mice 9 . Il ruolo della telomerasi nelle cellule staminali è ulteriormente confermata dai risultati di una rara malattia genetica umana dyskeratosis congenita (DKC), che per certi versi assomiglia a invecchiamento precoce 10,11. DKC è causata da mutazioni in TERC, TERT, e geni che codificano dyskerin, un nucleo telomerasi subunità, e altri dyskerin proteine ​​associate 12. In media, i telomeri nei pazienti DKC sono più brevi del 99% di controlli appaiati per età. Il principale morbilità della malattia è dovuta ad anemia aplastica, che è causato da manutenzione difettosa delle cellule staminali ematopoietiche. Altri aspetti della malattia, come leucoplachia orale, distrofia ungueale, retardati mentalisu, testicoli atrofia e complicanze polmonari tutti suggeriscono funzioni delle cellule dei tessuti staminali e cellule progenitrici 10, scoperte in stretto accordo con quelle deteriorate a fine generazione di topi knockout telomerasi. Pazienti DKC sono inclini alla sindrome mielodisplastica e hanno una maggiore prevalenza di neoplasie maligne della mucosa. Così, la carenza della telomerasi in pazienti umani ricapitola i difetti delle funzioni di cellule staminali tumorali e predisposizione che si osservano nella tarda generazione topi knockout telomerasi. Telomeri brevi e un&#39;elevata attività della telomerasi sono le caratteristiche distintive di cancro. Come le cellule normali o precancerose dividono, i risultati bassi o assenti di attività della telomerasi nella eventuale erosione dei telomeri e l&#39;attivazione di punti di controllo cellulari simili a quelle provocate da DNA a doppio-break non recuperabili (DSB) 13. Come DSBs classici, disfunzione telomerica ha mostrato di indurre p53 e associati risposte cellulari, quali la senescenza e / o apoptosis 14,15. Su inattivazione mutazionale di p53, ciclo cellulare e la sopravvivenza delle cellule sono stati migliorati in cellule con telomeri disfunzioni, che fornisce un meccanismo mutatore pro-cancerogeni caratterizzata da traslocazioni e amplificazioni e delezioni regionali 16,17. Allo stesso tempo, continua telomero disfunzione associata e instabilità cromosomica dilagante (anche in cellule nulle p53) sembrano vincolare piena progressione maligna di tali tumori. Ad esempio, in ritardo generazione G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - mice mostrava significativamente ridotta incidenza di linfoma rispetto ai Ink4a / Arf topi nullo a causa di logoramento dei telomeri. In un altro studio, le lesioni adenomatosi più avanzati in G4 mTERT - / - APC min topi sono stati notevolmente soppressi rispetto APC min topi a causa della notevole arresto della crescita ed apoptosi 18,19. Ilosservazione che telomero disfunzione indotta instabilità genomica inibisce la progressione del tumore richiede speculazione che l&#39;attivazione della telomerasi può consentire la progressione maligna in parte da reprimere instabilità genomica a un livello compatibile con la vitalità delle cellule del cancro e / o neutralizzazione p53-dipendente o meccanismi di checkpoint -indipendenti. Al fine di studiare se la riattivazione della telomerasi può fermare o addirittura invertire l&#39;invecchiamento delle cellule staminali, e se la riattivazione della telomerasi può promuovere la tumorigenesi sullo sfondo di instabilità genomica, abbiamo generato due inducibile alleli telomerasi murini. Il primo è a 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) fusion knock-in allele. In assenza di 4-OHT, topi omozigoti per mTERT-ER (designato mTERT ER / ER) sono l&#39;attività della telomerasi carenti e sostengono stessi fenotipi citogenetiche e cellulari come mTERT convenzionale o mModello di knockout TERC. Al 4-OHT trattamento, l&#39;attività della proteina TERT-ER può essere ripristinato a livelli paragonabili alla proteina TERT nativo 20, 21. Il secondo allele è un romanzo TERT inducibile knock-in allele contenente un intronico cassette loxP-Stopper-loxP (LSL- mTERT); su asportazione di LSL Cre-mediata, mTERT è nuovamente espresso in meccanismi di controllo di espressione endogena 22.

<table><tbody><tr><td>Kit di micromanipolazione Leica AM6000</td><td>Leica</td><td>Per preventivo</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Leica DMI6000 B</td><td>Leica</td><td>Per preventivo</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td></td> 21810031 <td></td></tr><tr><td>vaporizzatore di isoflurano</td><td>Sistemi di anestesia veterinaria</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Henry</td><td>Schein 1005796</td><td></td></tr><tr><td>miscela ketamina-xilazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Trochar di precisione personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>(calibro 10)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>clip per ferite applicatore</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione del tessuto neurale</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xilene</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formammide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA sonda telomero</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA sonda centromero</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>cemento di gomma</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando murine inducibile telomerasi alleli in studi di tissue degeneration / regeneration e il cancro

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Perdita di integrità del genoma e la sua segnalazione danni al DNA associate e risposte checkpoint telomero disfunzione-indotta sono driver affermati che causano la degenerazione dei tessuti durante l&#39;invecchiamento. Cancro, con tassi di incidenza aumentando notevolmente con l&#39;età, è caratterizzata da lunghezza dei telomeri corti ed elevata attività della telomerasi. Per studiare il ruolo di telomeri erettile e la riattivazione della telomerasi in invecchiamento e cancro, il protocollo indica come generare due murine telomerasi inducibile knock-in alleli 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) e Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Il protocollo descrive le procedure per indurre disfunzioni telomero e riattivare l&#39;attività della telomerasi in mTERT-ER e LSL-mTERT topi in vivo. I dati rappresentativi mostrano che la riattivazione di attività della telomerasi può migliorare il tessuto fenotipi degenerative indotte da una disfunzione dei telomeri. In order di stabilire l&#39;impatto della telomerasi riattivazione su tumorigenesi, abbiamo generato prostata modello di tumore G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L e timo cellule T linfoma modello G4 Atm - / - mTERT ER / ER . I dati rappresentativi mostrano che la riattivazione della telomerasi nel contesto di instabilità genomica indotta da una disfunzione del telomero può migliorare notevolmente tumorigenesi. Il protocollo descrive inoltre le procedure utilizzate per isolare le cellule staminali neurali (NSC) da topi mTERT-ER e LSL-mTERT e riattivare l&#39;attività della telomerasi in NSC in vitro. I dati mostrano che la riattivazione rappresentativi della telomerasi può migliorare la capacità di auto-rinnovamento e neurogenesi in vitro. Infine, il protocollo descrive le procedure per l&#39;esecuzione dei telomeri FISH (ibridazione fluorescente in situ) sia FFPE mouse (fissati in formalina e Paraffin embedded) tessuti cerebrali e cromosomi in metafase delle cellule in coltura.

Le strategie per generare murino mTERT-ER e LSL-mTERT knock-in alleli sono stati descritti in Figura 1A e 1B. In particolare, un loxP - Stopper triplo - Neo - frammento loxP è stato inserito tra esone 1 e esone 2 di mTERT locus per generare LSL-mTERT allele. Per generare mTERT-ER allele, dominio ERT2-LBD in cornice con il gene mTERT è stato inserito nel N-terminale dell&#39;esone 1. Abbiamo dimostrato che quando la telomerasi è stata transitoriamente riattivata nei topi disfunzione telomeri trattandoli con pellet 4 OHT per 4 settimane, il fenotipo degenerativo potrebbero essere migliorati in diversi organi quali cervello (Figura 2A) e testicoli (Figura 2B). Al fine di determinare l&#39;impatto della telomerasi riattivazione in cellule coltivate in vitro, abbiamo isolato cellule staminali neurali (NSC), dalla fine di generazione G4 LSL-mTERT e G4 mTERTTopi -ER. Abbiamo dimostrato che quando la telomerasi è stato riattivato in telomeri disfunzionali NSC, la capacità di auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali è stato notevolmente aumentato (figura 3A), in neurogenesi vitro è stato anche migliorato in modo significativo (Figura 3B). Per determinare gli effetti della telomerasi riattivazione sulla tumorigenesi nel contesto della disfunzione telomerica, abbiamo generato PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (modello di tumore della prostata) e Atm - / - mTERT ER / ER (timo cellule T modello linfoma) coorti ritardo generazione. Quando telomerasi è stato riattivato da un trattamento con tamoxifene in questi topi con l&#39;iniezione (figura 4A) o pellet 4 OHT per 8 settimane (Figura 4B), la tumorigenesi è stata notevolmente migliorata sia in modello di tumore della prostata (4A) e timo modello linfoma a cellule T ( <strong&gt; Figura 4B). Infine, abbiamo riportato i protocolli di esecuzione dei telomeri FISH su topo FFPE tessuti cerebrali (Figura 5) e cromosomi in metafase (Figura 5, nel riquadro). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figura 1: (A) mTERT-ER knock-in strategia. TV, il targeting vettoriale; WT, wild type allele; KI, knock-in allele; LA, braccio sinistro; RA, braccio destro; E1, esone 1; E2, esone 2; neo, PGK promoter-driven gene resistente neomicina; ER, recettore degli estrogeni modificato (ERT2) ligando dominio di legame; DT, dyphteria gene della tossina. (B) LSL-mTERT strategia knock-in. TV, il targeting vettoriale; WT, wild type allele; KI, knock-in allele; LA, braccio sinistro; RA, braccio destro; E1, esone 1; E2, esone 2; neo, PGK promoter-driven gene resistente neomicina; STOPPER, tre sequenze di arresto trascrizionali ripetitive; DT, dyphteria gene della tossina. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figura 2: i dati rappresentativi per mostrare telomerasi riattivazione migliora fenotipi degenerative degli organi Immagini rappresentative del cervello (a sinistra). e testicoli (a destra) del G0 e G4 mTERT-ER topi trattati con placebo o 4 OHT per 4 settimane. Barre di scala indicano 50 micron. Re-print con il permesso di 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figura 3:. Dati rappresentativi per mostrare telomerasi riattivazione aumenta self-renewal e neurogenesi delle cellule staminali neurali in vitro (A) Immagini rappresentative della cellule staminali neuralis isolato dal G4 LSL-mTERT (pannello superiore) e G4 mTERT-ER (pannello inferiore) che cresce in media di cellule staminali trattate con veicolo o 4-OHT. (B) Immagini rappresentative della neurogenesi in vitro (TUJ1 +) delle cellule staminali neurali isolate da G4 mTERT-ER coltivate in terreno di differenziamento (con 1% FBS) trattati con veicolo o 4-OHT. Barre di scala indicano 100 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figura 4:. Dati rappresentativi per mostrare telomerasi riattivazione aumenta tumorigenesi sullo sfondo di instabilità genomica (A) Immagini rappresentative di tumori della prostata sezionati da G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, E G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L trattato con tamoxifene. Re-stampa con il permesso di 22. (B) Immagini rappresentative della linfomi T-cellule del timo sezionati da G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER trattati con il veicolo, e G4 Atm - / - mTERT ER / ER trattato con 4- OHT per 8 settimane. Barre di scala indicano 1 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figura 5: Immagini rappresentative della telomerica e FISH centromeric sul mouse FFPE tessuto cerebrale e metafase (nel riquadro). Il rosso indica DNA, verde indica telomeri colorazione, e ciano indica centromere colorazione. Barre di scala indicano 1 mm.

Il telomero e la telomerasi svolgono un ruolo essenziale nell'invecchiamento e nella tumorigenesi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come generare due alleli knock-in della telomerasi inducibili murini e come utilizzarli negli studi di degenerazione/rigenerazione tissutale e cancro.

Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di manipolare due alleli murini inducibili da mase knocking in vivo e in vitro per studi di degenerazione e rigenerazione tissutale e studi sul cancro. Ciò si ottiene impiantando compresse di idrossitamoxifene negli animali per riattivare la mase in vivo. In una seconda fase, le cellule staminali neurali vengono isolate da animali che vengono poi trattati con idrossitamoxifene per riattivare la mase in vitro.Successivamente, la fluorescenza dei telomeri nell'ibridazione C 2 o fish viene eseguita sia su cellule coltivate che su tessuti cerebrali incorporati in paraffina formale e fissa, al fine di controllare l'attività della mase. I risultati hanno mostrato che i trattamenti con idrossitamoxifene possono riattivare in modo robusto l'attività della mase, che può alleviare i fenotipi dell'invecchiamento e promuovere la formazione di tumori sulla base dell'esame istopatologico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento e del cancro, ad esempio se possiamo rallentare o meno il processo di invecchiamento modulando l'attività del trauma TH, o come indirizzare specificamente Thomas per trattare il cancro.A dimostrare questa procedura saranno l'istruttore Dr.Takashi Shingu e un tecnico April Un del mio laboratorio. Iniziare questa procedura con la generazione del Turt ER e bloccare l'arresto blocca gli alleli di Turt come descritto nel protocollo di testo, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'iniezione procedere all'anestesia dei topi come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver raggiunto l'anestesia profonda, rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera di induzione e tenere la testa all'interno del tubo collegato alla camera isofluoro.Pizzica i cuscinetti dei piedi dei topi per assicurarti che l'animale sia profondamente anestetizzato. Metti anche un unguento su entrambi gli occhi Per evitare che gli occhi si aprano, pulisci la parte posteriore dei topi con una soluzione di iodio povidone. Quindi, iniettare un pellet di idrossitamoxifene a lento rilascio con un trocar di precisione sotto la pelle della schiena.E spingi il pallino fino alla linea mediana tra due spalle. Sigillare l'incisione con un applicatore di clip per ferite e monitorare i topi per il recupero. Per l'anestesia.Togliete i cervelli di un giorno dal topo e mantenete i quattro cervelli rimuovendo i bulbi olfattivi e il cervelletto. Conservare i quattro tessuti cerebrali in un millilitro di terreno di coltura freddo e conservarli a quattro gradi Celsius. Assicurati di elaborare il tessuto neurale entro un'ora.Determinare il peso del tessuto per assicurarsi che il limite di 400 milligrammi per digestione non venga superato. Posiziona il cervello sul coperchio di una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro e schiaccia il cervello usando un bisturi. Utilizzando un puntale per pipetta da un millilitro, aggiungere un millilitro di soluzione salina di Hank's balance o HBSS.Quindi pipettare nuovamente i pezzi in una provetta da 15 millilitri dopo aver risciacquato con centrifuga HBSS a 300 volte G per due minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso con cura il surnatante, aggiungere 1.950 microlitri di enzima preriscaldato. Mescolarne uno per un massimo di 400 milligrammi di tessuto.Incubare il campione nella provetta da 15 millilitri per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Mescolare il campione capovolgendo o agitando la provetta ogni cinque minuti. Quindi preparare 30 microlitri di enzima Mescolare due per campione di tessuto aggiungendo 20 microlitri di soluzione, da tre a 10 microlitri di soluzione quattro.Quindi aggiungere al campione, invertendo delicatamente per mescolare, dissociare meccanicamente il tessuto utilizzando una pipetta in pasta lucidata a fuoco a punta larga, pipettando su e giù 10 volte, evitando lentamente la formazione di bolle d'aria. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti, capovolgendo la provetta ogni tre minuti. Quindi, applicare la sospensione cellulare su un filtro cellulare da 70 micron posizionato su una provetta da 50 millilitri.Applicare 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS attraverso il colino cellulare. Quindi scartare il filtro cellulare e centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per 20 minuti. Impostare la temperatura ambiente dopo la centrifugazione, aspirare completamente il surnatante.Risospendere le cellule con il mezzo di cellule staminali al volume richiesto per ulteriori applicazioni per attivare il tele array nelle serrature, arrestare le serrature. Cellule staminali neurali di Turt. Trattare le cellule con 100 micromolari di idrossitamoxifene per due giorni per attivare l'emasi, e turt er cellule staminali neurali.Mantenere le cellule in terreno di coltura con 100 micromolari di idrossitamoxifene per eseguire il pesce telomero. Innanzitutto, preparare i cromosomi in metafase da cellule in coltura per sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina o FFPE. Distribuire il campione in xilene e reidratarlo in una serie di etanolo per cinque minuti ciascuno e in PBS per cinque minuti.Quindi postfissare le sezioni in un rapporto di tre a uno di metanolo e acido acetico per una o due ore. Disidratare le sezioni in una serie di etanolo freddo per cinque minuti ciascuna e lavare a secco all'aria in un XPBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, in natura, i cromosomi in formaldeide al 4% a 37 gradi Celsius per due minuti.Disidratare le sezioni in una serie di etanolo freddo come prima e asciugare all'aria una volta asciutte, applicare da 12 a 25 microlitri della miscela di ibridazione dell'acido nucleico peptidico su ogni vetrino. Sigillare il vetrino coprioggetti con cemento di gomma che fissa i preparati cromosomici naturali e le sezioni di tessuto a 80 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi ibridare a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius per due o quattro ore in una camera umida.Successivamente, lavare i campioni a temperatura ambiente con tampone di lavaggio per 15 minuti due volte. Quindi lavarli a temperatura ambiente per cinque minuti con PBS e interpolarli 23 volte. Infine, controcolorare i vetrini con DPI o fluorescenza rossa lontana per l'esame microscopico.Quando i telomeri sono stati riattivati transitoriamente in topi disfunzionali dei telomeri, i fenotipi degenerativi potrebbero essere migliorati in più organi come il cervello e i testicoli per determinare l'impatto della riattivazione dei telomeri sulle cellule. Le cellule staminali neurali in vitro in coltura sono state isolate da topi ER G four lock stop lock, TURT e G four turt di ultima generazione. Quando i telomeri sono stati riattivati nelle cellule staminali neurali disfunzionali dei telomeri, la capacità di autorinnovamento è stata notevolmente aumentata.Anche la neurogenesi in vitro è stata significativamente migliorata per determinare l'impatto della riattivazione della masi sulla tumorgenesi nel contesto della disfunzione dei telomeri, la riattivazione della masi mediante trattamento con tamoxifene è stata eseguita in un modello di tumore alla prostata. Modello di linfoma endottico a cellule T. Il trattamento ha portato a un notevole aumento della tumorgenesi in entrambi i modelli.Infine, il pesce dei telomeri è stato eseguito su FFPE, tessuti cerebrali di topo e cromosomi in metafase. In queste immagini, il rosso indica il DNA, il verde indica la colorazione dei telomeri e il ciano indica la colorazione del centromero. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come attivare l'attività del trauma in mTOR ER e bloccare i blocchi, gli animali mTOR e le linee cellulari e come usarli per studiare le tue domande sul cancro e sull'agente.

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