Name: 在SH-SY5Y人神经母细胞瘤分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞分化获得功能性神经元的可靠方法。该方案为神经生物学和神经病毒学研究提供可重复的体外培养技术，帮助研究人员生成均一的分化神经元群体用于后续实验分析。

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我们感谢 Yolanda Tafuri 在优化 SH-SY5Y 细胞分化条件方面所做的贡献，以及感谢 Dr. Lynn Enquist 的支持，本研究工作即在其实验室启动。Y. Tafuri 提供了图 3 中所示的图像。本研究得到了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所病毒病原体资源（ViPR）生物信息学资源中心（MLS 和 L. Enquist）以及项目编号 K22 AI095384（MLS）的资助。

1. 一般注意事项
<ol>
	<li>参见材料/设备表以获取所需试剂的清单。所有步骤均须在严格的无菌条件下进行。</li>
	<li>凡涉及胎牛血清（FBS）的培养基配制，均应使用热灭活胎牛血清（hiFBS）。热灭活方法：将50 ml FBS置于56 °C水浴中加热30分钟，每10分钟轻轻颠倒混匀一次（另见表1）。 
	注意：若FBS未进行热灭活处理，SH-SY5Y细胞培养物中的上皮样表型进展会更快。</li>
	<li>每次操作前，需将培养基放入培养箱中预热并平衡，以建立适当的pH值。例如，50 ml培养基在培养箱中（pH 7，37 °C，5% CO2）约需1小时方可完全平衡。 
	注意：本方案采用两步传代法，需对部分分化的SH-SY5Y细胞进行胰酶消化并重新接种。这对极为脆弱的细胞而言是一个应激过程。因此，必须尽可能缩短细胞在胰酶中的孵育时间，以便优先使神经元样细胞脱落，而保留上皮样细胞仍贴附于培养皿表面。</li>
	<li>使用10 ml塑料移液管对已分化细胞进行吹打重悬时，应缓慢操作，将管尖紧贴含有细胞的锥形管底部，以缓慢速度上下吹打不超过五次。</li>
</ol>
2. SH-SY5Y 维持培养物的传代
<ol>
	<li>当细胞生长至70-80%融合度时进行传代培养，传代次数不得超过10至15代。通常每3-5天需传代一次（假设传代时稀释倍数不超过5倍）。</li>
	<li>从T-75培养瓶中传代细胞时，先吸除培养基，然后用约10 ml 1×PBS冲洗。 
	注意：传代过程中不建议将SH-SY5Y维持培养物稀释超过1:5，否则因密度过低可能导致细胞死亡。</li>
	<li>吸除PBS，加入2.5 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×）。</li>
	<li>在培养箱中孵育2-3分钟，轻轻摇晃以使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>加入10 ml基础生长培养基（见表2），轻轻吹打1-2次。</li>
	<li>以1,000 × g离心2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于5 ml基础生长培养基中。</li>
	<li>将细胞按1:3至1:5比例稀释至总体积20 ml，用于T-75培养瓶的常规接种；或进行细胞计数后接种以用于分化实验（第5节）。</li>
</ol>
3. 冻存SH-SY5Y细胞
<ol>
	<li>将早期传代的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞在基础生长培养基中冻存，培养基中添加5%（v/v）DMSO。</li>
	<li>最初将分装样品在-80 °C冷冻24小时，然后转移至液氮中进行长期保存。 
	注意：作为参考，一个汇合度为75–85%的T-75培养瓶可获得五份1 ml的SH-SY5Y细胞冻存液。每份冻存液应含有总计200万至500万个细胞。</li>
</ol>
4. 解冻并培养未分化的 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞
<ol>
	<li>配制基础培养基。</li>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻冻存的细胞（约2分钟）。</li>
	<li>将细胞重悬于15 ml锥形管中的9 ml基础培养基中，然后在1,000 × g条件下离心2分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀的细胞，再用10 ml基础培养基轻柔地重悬细胞。</li>
	<li>将细胞接种至T-25培养瓶或60 mm2培养皿中。</li>
	<li>次日更换培养基以去除死细胞。</li>
</ol>
5. 第0天：铺板细胞以进行分化
<ol>
	<li>参见图1中的分化时间表。</li>
	<li>用1×PBS冲洗未分化细胞，吸除液体，然后加入1–2 ml预热的1×0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化。</li>
	<li>将细胞在胰蛋白酶中于培养箱内孵育约3分钟。</li>
	<li>加入10 ml基础生长培养基以终止胰蛋白酶反应，冲洗培养皿或培养瓶内壁，并轻轻吹打1–3次。将悬液转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>以1,000 × g离心2分钟，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>用5 ml基础生长培养基重悬细胞沉淀，并轻轻吹打1–3次。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，然后用基础生长培养基稀释至50,000个细胞/ml。</li>
	<li>每35 mm2&#160;培养皿接种2 ml细胞悬液，即每皿共100,000个细胞，随后放回培养箱中继续培养。</li>
</ol>
6. 第1天：更换培养基（分化培养基#1）
<ol>
	<li>取50 ml分化培养基#1（见表2），置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>培养基升温后，放入培养箱（37 °C，5% CO2）中至少平衡1小时，以建立适宜的pH值，再用于实验。</li>
	<li>在将培养基加入培养皿前，立即向已预热并平衡的培养基中添加视黄酸（RA）（见表1）。 
	注意：视黄酸对光敏感，应保存在避光瓶中，并置于4 °C储存。</li>
	<li>轻柔吸除旧培养基并弃去。</li>
	<li>每35 mm2&#160;培养皿中加入2 ml含视黄酸的分化培养基#1，然后放回培养箱。</li>
</ol>
7. 第3天：更换培养基（分化培养基#1）
<ol>
	<li>重复第 6 节（步骤 1-5）</li>
</ol>
8. 第5天：更换培养基（分化培养基#1）
<ol>
	<li>重复第6节（步骤1-5）</li>
</ol>
9. 第7天：按1:1比例传代细胞
<ol>
	<li>在将培养基加入培养皿之前，立即将RA加入已预热并平衡的分化培养基#1中。</li>
	<li>轻轻吸出旧培养基并弃去。</li>
	<li>每35 mm培养皿加入200 µl预热的0.05% 1x胰蛋白酶EDTA2&#160;将培养皿放入培养箱中孵育约2-3分钟，或在显微镜下观察到细胞明显从培养板上脱落时为止。</li>
	<li>通过每35 mm培养皿加入2 ml含RA的分化培养基#1来终止胰蛋白酶消化2&#160;培养皿 用培养基冲洗培养板上残留的神经元细胞，然后将内容物转移至50 ml锥形管中。 
	注意：进行胰蛋白酶消化步骤时，不要同时处理过多培养皿。这有助于确保神经元培养物不会在胰蛋白酶中孵育过久，以免产生细胞毒性。</li>
	<li>将最多10个培养皿中的内容物合并至一个50 ml锥形管中，用10 ml塑料移液管轻柔地上下吹打不超过5次。</li>
	<li>将2 ml细胞悬液分装至新的35 mm培养皿中2&#160;培养皿放回培养箱。</li>
</ol>
第10天：更换培养基（分化培养基#2）
<ol>
	<li>加入RA（参见 表1) 在将培养基加入培养皿前，立即加入已预热并平衡好的培养基中。</li>
	<li>轻柔吸去旧培养基并弃去。</li>
	<li>缓慢加入 2 mL 分化培养基 #2（参见 表2) 每35毫米类风湿性关节炎组织2&#160;将培养皿放回培养箱。切勿使神经元长时间暴露于空气中，以免其迅速干燥。</li>
</ol>
11. 第9天：制备细胞外基质（ECM）包被培养皿
<ol>
	<li>将一管 ECM 溶液置于冰上解冻，并用预冷的 DMEM 按 1:100 比例稀释。</li>
	<li>将 2 ml 稀释液加入每个 35 mm2&#160;培养皿中，确保完全覆盖皿底。</li>
	<li>放入培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育 1 小时或过夜。</li>
	<li>吸除液体，于生物安全柜中晾干约 1 小时。可在室温下保存长达 2 个月。</li>
</ol>
第12天：以1:1比例将细胞转移至ECM包被的培养板
<ol>
	<li>在将培养基加入培养皿前，立即将RA（见表1）加入已预热并平衡的培养基中。</li>
	<li>轻柔吸除培养基并弃去。</li>
	<li>向每个35 mm2&#160;培养皿中加入200 µl预热的胰蛋白酶，室温孵育约1–2分钟，或直至在显微镜下观察到神经元明显从培养皿表面脱离。 
	注意：此胰蛋白酶消化步骤应在室温下进行，以避免神经元与胰蛋白酶过度孵育而造成损伤。此阶段神经元从培养板脱落的速度远快于类上皮细胞。</li>
	<li>每35 mm2&#160;培养皿中加入2 ml分化培养基#2以终止胰蛋白酶反应，并用该培养基冲洗培养板上残留的神经元细胞，随后将全部内容物转移至50 ml锥形管中。</li>
	<li>将最多10个培养皿的内容物合并至同一50 ml锥形管中，使用10 ml塑料移液管轻柔吹打混悬液，上下吹打不超过五次。</li>
	<li>将2 ml细胞悬液分装至经ECM包被的35 mm2&#160;培养皿中，放回培养箱继续培养。</li>
</ol>
第13天：更换培养基（分化培养基#3）
<ol>
	<li>在将培养基加入培养皿前，立即将视黄酸（RA）（见表1）加入已预热并平衡的培养基中。</li>
	<li>轻柔吸除旧培养基并弃去。</li>
	<li>每35 mm2&#160;培养皿中缓慢加入2 ml含RA的分化培养基#3（见表2），然后放回培养箱。避免神经元长时间暴露于空气中。</li>
</ol>
第14天：更换培养基（分化培养基#3）
<ol>
	<li>重复第13节（步骤1-3）</li>
</ol>
第15天：最后一次换液（分化培养基#3）
<ol>
	<li>重复第13节（步骤1-3）</li>
</ol>
16. 第18天：神经元培养物已准备好使用
<ol>
	<li>每3天更换一次含有视黄酸（RA）的新鲜分化培养基#3，以维持神经元的健康状态。 
	注意：细胞应已分化为神经元，并表现出神经元表型。通常情况下，终末分化后的培养物可保持稳定达14天，但神经元的存活时间取决于分化起始时未分化细胞的传代次数。传代次数越高，所得分化神经元的有效寿命越短。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方案提供了一种简单且可重复的方法，用于生成均一且具有活性的人类神经元培养物。该方案结合了多种先前已发表的方法1-4中的技术与实践，旨在阐明每一环节的最佳操作规范。SH-SY5Y细胞的分化依赖于逐步去除血清；添加视黄酸、神经营养因子和细胞外基质蛋白；以及通过连续传代筛选出已分化成熟的贴壁神经元。该细胞系初始时由贴壁细胞和悬浮细胞组成的异质性群体构成。本方案旨在通过在传代或更换培养基前省略PBS洗涤步骤，以保留这两类细胞群体，但需牺牲部分悬浮细胞，以便清除死亡的上皮样细胞。所介绍的方法可获得均一的已分化人源SH-SY5Y神经元群体，适用于后续实验研究。
尽管其他试剂也可用于引导神经元向胆碱能或肾上腺素能表型分化16,17，但既往研究已采用视黄酸（RA）诱导SH-SY5Y细胞分化，以获得多巴胺能表型的神经元37,38。研究表明，添加RA可通过多种机制诱导细胞分化，包括使细胞周期停滞于G0/G1期、上调细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制因子p21和p27Kip1以及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x...

使用的能力 体外 模型系统极大地推动了神经生物学和神经科学领域的发展。细胞培养为研究蛋白质功能及特定现象背后的分子机制、理解疾病与感染的病理过程以及开展药物的初步测试评估提供了高效的平台。在神经生物学中，主要的细胞培养模型包括源自大鼠和小鼠的原代神经元培养，以及神经母细胞瘤细胞系，如大鼠B35细胞。5小鼠 Neuro-2A 细胞6和大鼠PC12细胞7尽管使用此类细胞系极大地推动了该领域的发展，但在处理非人类细胞和组织时仍存在若干混杂因素。这些因素包括了解代谢过程、疾病表型表现以及发病机制方面存在的物种特异性差异。此外，值得注意的是，小鼠与人类在基因表达及转录因子信号传导方面存在显著差异，这凸显了啮齿类动物模型的局限性，也强调了明确哪些通路在啮齿类与人类之间保守的重要性。8-11其他研究者已采用人类神经元细胞系，包括N-Tera-2（NT2）人类畸胎瘤细胞系以及诱导性多能干细胞（iPSCs）。这些细胞系为研究提供了良好的模型 体外 人类系统。然而，使用视黄酸（RA）诱导NT2细胞分化会生成神经元、星形胶质细胞和放射状胶质细胞的混合群体12，需要额外的纯化步骤以获得纯化的神经元群体。此外，NT2细胞表现出高度可变的核型13，72%的细胞染色体数目超过60条。不同iPSC细胞系在分化能力上表现出差异，且分化效率各不相同14因此，拥有一个稳定且可重复的人类神经元细胞模型来补充这些替代方法是十分必要的。
SH-SY5Y 神经母细胞样细胞是亲代神经母细胞瘤细胞系 SK-N-SH 的一个亚克隆。该亲代细胞系于1970年从骨髓活检样本中建立，其中包含神经母细胞样和上皮样细胞15。SH-SY5Y 细胞具有稳定的核型，共含47条染色体，可通过多种不同机制从神经母细胞样状态分化为成熟的类人神经元，这些机制包括使用视黄酸（RA）、佛波酯以及特定的神经营养因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）。已有研究表明，采用不同的诱导方法可选择性地获得特定类型的神经元亚型，例如肾上腺素能、胆碱能和多巴胺能神经元16,17。这一特性使 SH-SY5Y 细胞在多种神经生物学实验中具有重要应用价值。
多项研究指出，SH-SY5Y 细胞在未分化状态与分化状态之间存在重要差异。当 SH-SY5Y 细胞处于未分化状态时，其增殖迅速，呈非极性形态，仅有少量且较短的突起。它们常以团块状生长，并表达提示其为未成熟神经元的标志物18,19。而在分化后，这些细胞会延伸出长而分支的突起，增殖能力下降，在某些情况下出现极性2,18。已有研究证实，完全分化的 SH-SY5Y 细胞表达多种成熟神经元标志物，包括生长相关蛋白（GAP-43）、神经元核抗原（NeuN）、突触素（SYN）、突触小泡蛋白 II（SV2）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白（MAP）2,16,17,20，且不表达胶质细胞标志物，如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4。进一步支持分化的 SH-SY5Y 细胞代表一个均质神经元群体的证据是，去除脑源性神经营养因子（BDNF）会导致细胞发生凋亡4。这表明分化的 SH-SY5Y 细胞的存活依赖于神经营养因子，类似于成熟神经元。
自1978年建立SH-SY5Y细胞亚克隆以来，其使用频率持续增加3一些应用实例包括研究帕金森病17，阿尔茨海默病21，以及包括脊髓灰质炎病毒在内的病毒感染的发病机制22，肠道病毒71型（EV71）23,24，水痘-带状疱疹病毒（VZV）1，人巨细胞病毒25和单纯疱疹病毒（HSV）2,26需要注意的是，已有多个使用SH-SY5Y细胞的研究在未分化状态下应用这些细胞，尤其是在神经病毒学领域27-36未分化与已分化SH-SY5Y细胞在表型上的差异引发了一个问题：在成熟分化的神经元中，感染进程是否会有所不同？例如，已分化的SH-SY5Y细胞对HSV-1的摄取效率高于未分化的增殖性SH-SY5Y细胞，这可能是由于未分化的SH-SY5Y细胞缺乏能够结合HSV并调节其进入的表面受体所致。2因此，在设计以测试神经元为重点的实验时，至关重要的是 体外, 为了获得最准确的翻译结果并进行比较，SH-SY5Y 细胞应先进行分化处理 体内 模型
建立一种可靠的方法来生成人类神经元培养物对于研究人员开展能够准确模拟人类神经系统的转化实验至关重要。本文介绍的方案总结了先前方法1-4中的最佳实践，用于富集经视黄酸诱导分化的人类神经元。

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>制备方法见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>Sigma</td><td>SRP3014 (10 &amp;mu;g)/B3795 (5 &amp;mu;g)</td><td>制备方法见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>制备方法见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>-</td></tr><tr><td>最低必需培养基（EMEM）</td><td>Sigma</td><td>M5650</td><td>-</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>制备方法见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>GlutamaxI</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>-</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>-</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td>制备方法见&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MaxGel 细胞外基质（ECM）溶液</td><td>Sigma</td><td>E0282</td><td>参见实验方案第11步</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>-</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>-</td></tr><tr><td>维甲酸（RA）</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>该试剂对光敏感，应避光保存于4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SH-SY5Y 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>-</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶 + EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td>-</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC 培养皿</td><td>Falcon (A Corning Brand)</td><td>353001</td><td>-</td></tr></tbody></table>

人神经母细胞瘤sh-sy5y细胞系的分化

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

建立适当的体内和体外系统，以提供可转化的人类疾病模型，是神经生物学和神经科学研究中的一个关键环节。神经生物学中传统的体外实验模型包括来自大鼠和小鼠的原代神经元培养、神经母细胞瘤细胞系（如大鼠B35和小鼠Neuro-2A细胞）、大鼠PC12细胞以及短期脑片培养。尽管许多研究人员依赖这些模型，但它们缺乏人类成分，所观察到的实验效应可能仅限于特定物种，在人类中未必以相同方式发生。此外，尽管这些细胞属于神经元，但其核型可能不稳定，这使得它们在基因表达研究以及细胞信号通路的可重复性研究中的应用受到限制。因此，开发更为稳定的人类神经系统疾病模型显得尤为重要。
以下实验方案描述了一种简单易行、可重复的方法，通过诱导染色体稳定的人源神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 分化，获得均一且具有活性的人类神经元培养物。该方法整合了此前报道的多种技术1-4，其核心在于逐步从培养基中去除血清。实验时间线包括逐步进行血清饥饿，并引入细胞外基质蛋白和神经营养因子。该过程促进神经元的分化，同时抑制上皮样细胞的生长，从而获得均一的神经元细胞群体。代表性结果展示了 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞成功地从初始的类上皮细胞表型分化为具有更广泛突起和分支结构的神经元样表型。本方案提供了一种可靠的方法，用于生成均一的神经元细胞群体，可用于后续的生物化学与分子生物学分析，为人类感染与疾病研究提供了更为准确的转化医学模型。

目前，在神经生物学和神经病毒学领域，有许多研究使用未分化的 SH-SY5Y 细胞作为人类神经元的功能模型27-36，且重要的是，未分化的细胞可能缺乏最佳病毒摄取等表型2 准确解释所必需的。在使用SH-SY5Y细胞或任何其他细胞系时，至关重要的是 体外 神经系统，细胞被适当地分化为神经元，以获得最能代表神经元中可能发生的生理过程的数据 体内上述方案可在18天内获得高存活率、均一且已分化神经元细胞培养物，可用于后续的生物化学和成像分析。未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞表现出较大、扁平、类似上皮样的表型，具有大量向外延伸的短突起（图2A），而分化后的细胞则具有多个神经突起，可与周围细胞相连接（图2B）。在诱导 SH-SY5Y 细胞分化时，需用胰蛋白酶孵育细胞尽可能短的时间，以确保仅神经元从培养皿中脱落，从而保留未分化的上皮样细胞，避免其污染已分化的神经元细胞群体。完全分化的 SH-SY5Y 细胞的神经元特性可通过免疫荧光检测经典神经元标志物等技术加以验证（图3</strong...

在神经生物学和神经病毒学研究中，拥有可靠且可重复的方法至关重要 体外 作为所发生事件的转化研究模型的系统 体内 在人类神经元中。本方案描述了如何培养并诱导SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞分化为具有活性的神经元，以用于后续实验研究。 体外 应用。

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的分化

拥有适当的体内和体外系统，以提供可转化为人类疾病研究的模型，是神经生物学研究中的一个关键组成部分。

本方案的总体目标是为神经生物学家和神经病毒学家提供一种简便且可重复的方法，以生成分化的人源神经元，用于后续的体外实验。该方法有助于回答传染病研究中的关键问题，例如确定神经元对感染或药物处理的反应。此外，该方法也可用于评估特定实验条件下相关的蛋白质组学或基因组学变化。该技术的主要优势在于提供了一种易于遵循的方案，可重复地获得完全分化且均一的人类神经元培养物。通常，初次接触该方法的研究者可能会遇到困难，因为这些细胞对消化处理、传代操作或暴露于非最佳环境条件等干扰因素十分敏感。开始此操作前，应先将培养基放入培养箱中预热并平衡，以在使用前建立适当的 pH 平衡。然后，当细胞达到70%至80%融合度时，对维持阶段的培养物进行传代。从T-75培养瓶中传代细胞时，吸除培养基。随后，用10毫升1×PBS冲洗培养瓶。接下来，吸除 PBS，加入 2.5 毫升 0.05% 或 1× 胰蛋白酶 EDTA。随后，将细胞孵育 2 至 3 分钟。然后，轻轻倾斜培养瓶，使细胞从瓶壁表面脱落。随后，加入 10 毫升基础生长培养基，将细胞吹打重悬一至两次。接着，以 1000 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。然后，吸除上清培养基。用 5 毫升基础生长培养基重悬细胞沉淀。在 T-75 培养瓶中进行常规接种时，将细胞稀释至总体积为 20 毫升，或计数后接种细胞以进行分化。以下是分化的实验时间安排：第 0 天，使用血细胞计数板对细胞进行计数。然后，使用基础培养基将细胞悬液稀释至每毫升50,000个细胞。每35毫米培养皿中接种2毫升细胞悬液，即每皿共接种100,000个细胞。随后，将细胞置于37摄氏度的培养箱中培养。第一天，将视黄酸（RA）加入预热并平衡好的培养基中。轻轻吸去旧培养基并弃去。随后，向每个35毫米培养皿中加入2毫升含视黄酸（RA）的分化培养基一，放回培养箱中继续培养。第7天，轻柔吸除旧培养基并弃去。向每个35毫米培养皿中加入200微升预热的胰蛋白酶EDTA溶液。然后将细胞放入培养箱中孵育2至3分钟，或直至在显微镜下观察到细胞从培养皿表面明显脱落。通过向每个 35 毫米培养皿中加入两毫升含视黄酸的分化培养基一，终止胰蛋白酶消化，并用该培养基冲洗残留的神经元细胞。随后，将全部液体转移至 50 毫升锥形管中。用 10 毫升塑料移液管轻柔地上下吹打不超过五次。此后，将两毫升细胞悬液分装至新的35毫米培养皿中，然后放回培养箱。第10天时，轻柔吸除培养基并弃去。向每个25毫米培养皿中加入200 µL预热的胰蛋白酶，室温孵育约一至两分钟，或直至在显微镜下观察到神经元明显从培养皿上脱落。第10天的实验步骤尤为困难，因为此时细胞在分化阶段具有较高的敏感性。必须将细胞在胰蛋白酶中的处理时间尽量缩短至室温下约一分钟，随后立即将细胞放回培养箱中。接着，向每个35毫米培养皿中加入两毫升分化培养基二号以终止胰蛋白

differentiation-of-the-sh-sy5y-human-neuroblastoma-cell-line

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在SH-SY5Y人神经母细胞瘤分化

本方案描述了从小鼠异位激活Sonic...

髓母细胞瘤干细胞的分离、富集与维持

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

在本视频中，我们利用诱导性多能干细胞对神经母细胞瘤进行小胶质细胞吞噬功能检测。该检测有助于评估神经退行性疾病中小胶质细胞功能的损伤情况。...

小胶质细胞吞噬作用检测：利用iPSC来源的巨噬细胞建立针对神经母细胞瘤细胞的体外小胶质细胞吞噬模型

本视频展示了一种利用系统性传代技术将未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞转化为完全分化的成熟神经元的方法。该方法包括将细胞培养于一系列血清浓度逐步降低的培养基中，以抑制类上皮细胞的增殖，同时促进类神经元细胞的分化与扩增。此外，培养基中添加了视黄酸和特定的生长因子，可诱导类神经元细胞终末分化为具有广泛分支形态的成熟神经元。...

人神经母细胞瘤细胞系向成熟神经元的分化

本文介绍了一种利用突触小泡蛋白2-pHluorin构建体和全内反射荧光显微镜技术研究神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态的方法。同时报道了图像处理与数据分析的策略。...

使用TIRFM和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动态：细胞成像与数据分析

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

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利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

本文详细描述了一种从出生后小鼠主要神经发生微环境来源的神经干细胞建立神经球培养物的实验方案。神经球可用于鉴定脑组织中的神经干细胞，从而估算前体细胞的数量。此外，这些三维结构可在诱导分化条件下接种，分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，进而用于细胞命运的研究。...

从出生后（P1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

在本实验方案中，我们描述了一种稳定且高效的分化策略，可用于由人类多能干细胞生成节后交感神经元。该模型将为多种自主神经系统疾病的研究所需的神经元提供来源。...

在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

神经退行性疾病与小胶质细胞功能失调相关。本文介绍了一种利用iPSC来源的巨噬细胞体外吞噬神经母细胞瘤细胞的检测方法。文中描述了活细胞延时成像和固定细胞高内涵成像的定量显微镜读数分析方法。...

诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析

学习使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞分化获得功能性神经元的可靠方法。该方案为神经生物学和神经病毒学研究提供可重复的体外培养技术，帮助研究人员生成均一的分化神经元群体用于后续实验分析。

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的分化

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