Name: Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Validierung eines transgenen Mausmodells zur induzierbaren Störung von LINC-Komplexen in zellspezifischen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kernpositionierung.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Morphologie und Imaging-Kern, der Molekulargenetik Kern (Abteilung für Augenheilkunde und Visual Sciences) und der Mausgenetik Kern an der Washington University in St. Louis School of Medicine. Die Autoren werden von der kleinen Zuschuss-Programm von der McDonnell Zentrum für Zelluläre und Molekulare Neurobiologie, der Hoffnung Zentrum für Neurologische Störungen unterstützt das National Eye Institute (# R01EY022632 zu DH), ein National Eye Institute zentralen Kern Grant (# P30EY002687) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung, um Blindheit zu der Augenklinik und Visual Sciences verhindern.

Ethics Statement: Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Washington University in St. Louis genehmigt. 1. Mauszucht und Genotypisierung <ol><li> Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mäusen, die mit Tg (PCP2-Cre) Mäuse Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 zu erzeugen. Anmerkung: Während der Rest dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung der Tg (PCP2-Cre) Mauslinie zu EGFP-KASH2 Ausdruck Purkinje Zellen innerhalb des Kleinhirns zu beschränken, kann ein ähnliches Verfahren mit einer anderen Tg (Cre) Maus verfolgt werden ( Abbildung 2a). </li><li> Führen Genotypisierung um Welpen beherbergen beide EGFP und Cre-Transgene, wie zuvor beschrieben 19 zu identifizieren. </li></ol> 2. Vorbereitung der Materialien für die Präparation und Gewebeentnahme <ol><li> Bereiten Sie 100 ml 30% Saccharose in PBS (30 g Saccharose / 100 ml 1x PBS) und bei -20 ° C. Der Tag der Gewebe hie Ernte, Tauwetter und Last ~ 30-35 ml Saccharose-Lösung in einen 35-ml-Spritze für transkardialer Infusionen. </li><li> Vorbereitung 40 ml von 4% PFA in PBS (10 ml 16% igem Paraformaldehyd und 30 ml PBS). Last ~ 30-35 ml 4% PFA in eine 35 ml-Spritze zur transkardialer Perfusionen. </li><li> Füllen Sie einen 10 cm-Gewebekulturplatte mit 10 ml PBS für Gewebedissektion. </li><li> Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin-Cocktail, bestehend aus 16 mg / ml Ketamin und 3 mg / ml Xylazin. </li><li> Eine Lösung aus 70% Ethanol für die Präparation. </li></ol> 3. Dissection und Gewebeentnahme <ol><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze injizieren 500 ul des Ketamin / Xylazin Cocktail pro 25 Gramm Körpergewicht, und warten Sie ca. 15 min. Alternativ verwenden Sie einen anderen institutionell genehmigten Sedierung Methode, die für das biologische System von Interesse geeignet ist. </li><li> Nach Sedierung, sanft Prise die Hinterpfote, den Mangel an Schmerzreaktion zu bestätigen, stecken alle Pfoten auf einem Styropor-Fach mit der Rückenseite desMaus nach unten. </li><li> Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und einen Einschnitt von den Unterbauch an die Spitze des Brustkorbs, um Zugang zum Herzen zu gewinnen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens und legen Sie die Spritze mit der 30% igen Zuckerlösung in den linken Ventrikel des Herzens. </li><li> Perfusion der Lösung bei einer Rate von ~ 2-5 ml pro min. Wenn leer, entfernen Sie die Spritze und wiederholen Sie mit der 4% PFA-Lösung. </li><li> Unpin die Maus vom Styroporbehälter und zu enthaupten, um das Gehirn zu gelangen. </li><li> Entfernen Sie die Haut um den Kopf des Tieres mit einer Pinzette und Schere. Poke ein Loch in den hinteren Teil des Schädels mit einer Nadel und entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit Schere und Pinzette. </li><li> Sobald das Gehirn ist eindeutig erreichbar, verwenden Pinzette, um das Kleinhirn zu entfernen und legen Sie sie in PBS. Halbieren das Kleinhirn in der Sagittalebene mit einem Skalpell und übertragen, die 30% Saccharose-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Hinweis: Um prepsind Paraffinschnitten, beheben das Kleinhirn über Nacht bei 4 ° C in 4% PFA vor Gewebeeinbettung und Schnitte. </li></ol> 4. Gewebeverarbeitung und Schnitte <ol><li> Bereiten einer Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Dass die Temperatur des Bades während 5 min sich ausgleichen lassen. </li><li> Füllen Sie eine cryomold mit OCT-Verbindung und legen Sie eine Hälfte des zweigeteilten Kleinhirn in die Form. </li><li> Mit Hilfe eines Binokular und einer Pinzette Position das Kleinhirn, so dass der zweigeteilten Oberfläche (in der Nähe der Mittellinie des Kleinhirns) nach oben zeigt. </li><li> Übertragen Sie die cryomold auf die Trocken Eisbrei für 5 Minuten, bis der OCT-Verbindung hat eine solide weißen Matrix um die Gewebeprobe gebildet. Anmerkung: Die gefrorene Probe kann nun bei -20 ° C, wenn erforderlich, gespeichert. </li><li> Etikett vorbehandelt Polylysin Folien zum Sammeln von Gewebeschnitten und bereiten den Kryostaten gemß den Anweisungen des Herstellers, um 15 um Abschnitte des cere sammelnbellum. Um die Abschnitte zu sammeln, vorsichtig an den Oktober Abschnitt mit dem Poly-Lysin-beschichtete Seite der Folie. Um die Ausrichtung des Abschnitts zu erhalten, müssen Sie die Folie während dieses Schritts nicht drehen. </li><li> Shop Gewebeschnitte bei -20 ° C, bis mit der Färbung und Imaging fortfahren. </li></ol> 5. Die Färbung und Imaging von Kleinhirn Sections <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor der Gewebefärbung: ~ 50 ml PBS ~ 5-10 ml von 4% PFA in PBS ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS </li><li> Thaw Kleinhirnschnitten. Wichtig ist, zu minimieren, ihre Exposition gegenüber einer beliebigen Quelle von kontinuierlichen und intensiven Licht, um Verblassen der EGFP verhindern. </li><li> Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift, ein Rechteck um den Gewebeschnitten. </li><li> Post-fix die Abschnitte mit 4% PFA für 5 min. Verwenden Sie ausreichend Flüssigkeit, um den gesamten Bereich von der hydrophobe Barriere (in der Regel ~ 500 ul) abgegrenzt decken. Mit Hilfe eines Vakuum oder Pipette wiederbewegen das Fixiermittel besonders achten, dass die Gewebeschnitte stören. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig anzuwenden PBS auf der Folie, ohne die Gewebeschnitte zu stören. Nach 5 min verwenden das Vakuum oder Pipette vorsichtig die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die PBS spülen insgesamt dreimal. </li><li> Verwendung einer Pipette vorsichtig Die geeignete Verdünnung von primären Antikörpern (3 ul Calbindin und / oder Nesprin2 Antikörper pro 900 Mikroliter Lösung) in 0,5% Triton X-100, 10% Eselserum in PBS gelten. Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anmerkung: EGFP-KASH2 wird durch direkte Fluoreszenz-Mikroskopie auf Gefrierschnitten sichtbar und es ist nicht notwendig, um eine Anti-EGFP-Antikörper zu verwenden. Wenn Paraffinschnitte wurden hergestellt, Imaging von EGFP-KASH2 erfordert jedoch Immunodetektion mit einem Anti-EGFP-Antikörper. </li><li> Entfernen Sie die Antikörperlösung und spülen Sie mit PBS dreimal. </li><li> Vorbereitung 1: 1000 Verdünnungen von Alexa-Fluor sekundären Antikörper in 0,5% Triton X-100,10% Eselserum in PBS und lagern in der Dunkelheit. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die endgültige PBS spülen und wenden Sie die Sekundärantikörperverdünnung für eine Stunde im Dunkeln. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung, spülen und waschen Sie den Abschnitt dreimal. Falls erforderlich, tragen Sie eine Kernfärbung, wie DAPI (~ 300 nM), während der ersten PBS-Anwendung. </li><li> Vollständig zu entfernen, die PBS-Lösung, um von der Gewebe und Ort ~ 5-7 &amp; mgr; l Montagetechnik auf dem Gewebeschnitt. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Gewebeschnitts und beiseite stellen für ~ 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit eingestellt. </li><li> Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtern ausgestattet, um EGFP und alle anderen für die Sekundärantikörper in den Schritten 5.8 / 5.9 verwendet geeigneten Wellenlängen zu visualisieren. In Kleinhirnscheiben, mit einem 20x-Objektiv an EGFP-KASH2 Kern Felgen anzuzeigen. </li></ol>

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<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der wichtigste Schritt, um erfolgreich zu studieren die Rolle des LINC-Komplexe in vivo unter Verwendung der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Modell ist, um eine geeignete Cre Mauslinie (n) zu identifizieren. In der Tat, wenn Cre ist in anderen Zelltypen in ähnlicher Wegen beteiligt aktiv, es kann die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Daher ist es wichtig, in der Nähe von Zellen zu untersuchen, wie hier in der molekularen und Körnerzellschicht des Cerebellums (2B) dargestellt. Ebenso ist es, ...

Die Kernhülle (NE) trennt das Kernplasma aus dem Zytoplasma. Es besteht aus einem inneren und äußeren Kernmembran (INM und ONM, respectively), die an Kernporen verbinden zusammen. Das Lumen von beiden Membranen abgegrenzt wird als perinukleären Raum (PNS). Die ONM ist eine Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der INM haftet an der Lamina, um ein Maschenwerk des Typs V-Atom Intermediärfilamente von A- und B-Typ dargestellt Lamine 1,2. Linker der Nucleoskeleton und Zytoskelett (LINC) -Komplexe sind makromolekularer Komplexe, die die gesamte Kernhülle überspannen kann, um das Innere des Kerns physikalisch verbinden Zytoskelettfilamenten und molekularen Motoren (1A). Sie bestehen aus Wechselwirkungen zwischen evolutionär konservierte Motive, die zwei Familien von integralen Transmembranproteine ​​des NE charakterisieren: Sun (SAD1 / Unc84) Proteine ​​und Nesprine (Nuclear Envelope Spek). Bei Säugetieren Sun1 und Sun2 are Transmembranproteine ​​des INM, deren N-terminale nukleoplasmatischen Region interagiert direkt mit A- und B-Typ Lamine 3-5. Auf der anderen Seite des INM, im PNS, Hafen Sun Proteine ​​einen evolutionären konserviert Strecke von ~ 150 C-terminalen Aminosäuren genannt SUN-Domäne. SUN Domänen interagieren direkt mit dem evolutionären konserviert KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne Homologie) -Domäne, die molekulare Signatur der Nesprine. KASH Domänen bestehen aus einer Strecke von ca. 30 C-terminalen Aminosäuren, die in die PNS, gefolgt von einer Transmembran-Domäne 6 ragt. Mindestens vier verschiedene Nesprin Gene (Nesprin1-4) kodieren KASH haltige Proteine, die an der NE 7 lokalisieren. Die zytoplasmatischen Regionen Nesprine, deren Größen variieren von ~ 50 kDa (Nesprin4) zu einer erstaunlichen 1.000 kDa (Nesprin1 giant) enthalten mehrere Spektrin wiederholt sowie spezifische Motive, damit ihre Wechselwirkung mit Zytoskelett-Komponenten, wie beispielsweise Actin, plectin und molekularen Motoren 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studium in Wirbeltieren und wirbellosen Tieren haben gezeigt, dass Lamin / Sun / Nesprin / molekulare Motoren stellen eine evolutionär konservierte &quot;Achse&quot; Steuerung Kern Migration und Verankerung. Einige Knock-out (KO) Maus-Modellen der LINC komplexe Bauteile wurden beschrieben und waren maßgeblich an der Schaffung eines Rahmens, um die Rolle von Sun und Nesprin Proteine ​​an der NE während der Entwicklung von Säugetieren 9,14,15 zu verstehen. Allerdings sind diese Modelle weisen mehrere signifikante Nachteile auf, insbesondere: 1) Schwierigkeiten bei der Interpretation Phänotypen aufgrund der nicht autonomen Effekte, 2) Schwierigkeiten bei der Unterscheidung der phänotypischen Beitrag von Zell KASH haltigen vs. KASH losen Nesprin Isoformen 16, 3) die funktionelle Redundanz von Sonne und Nesprin Proteine ​​an der NE in zahlreichen Zelltypen erfordert komplexe Zuchtprogramme, alle SUN-KASH Wechselwirkungen bei Mäusen 17 und 4) die perinatale Sterblichkeit von Mäusen mangelhaft für die KASH-Domäne sowohl inaktivierenNesprins1 und 2 schließt die Analyse der Erwachsenen Phänotypen 18. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Mausmodell entwickelt, um alle SUN-KASH Wechselwirkungen in vivo stören, in einer Zelle autonom und entwicklungsregulierter Weise umgehen somit viele der oben beschriebenen Nachteile. Diese Cre / lox-basierten Mäusemodell beruht auf zwei wichtige Konzepte: 1) die KASH Domäne von irgendeinem bekannten Nesprin Protein ausreicht, um EGFP auf die NE in Zellkultursystemen Ziel und 2) Sonnendomänen interagieren promiscuously mit KASH Bereichen, wodurch eine Überexpression von beliebige KASH Domäne werden alle endogenen SUN Domänen zu sättigen und zu inaktivieren LINC-Komplexe in einer dominant-negative Art und Weise 17 (1B). Dieses Protokoll beschreibt Gewebe Ernte- und Verarbeitungsschritte verwendet werden, um die Störung aller SUN-KASH Wechselwirkungen im Kleinhirn-Purkinje-Zellen bestätigen.

<table><tbody><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsion Objektträger</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antikörper</td><td></td><td></td><td>Zuvor beschrieben in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Montage Medien</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validierung eines maus-modell zu linc komplexe disrupt in einem zellspezifisch

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Die nukleare Migration und Verankerung in sich entwickelnden und adulten Geweben hängt stark von großen makromolekularen Proteinanordnungen ab, die als LInkers des Nukleoskeletts und des Zytoskeletts (LINC-Komplexe) bezeichnet werden. Diese Proteingerüste überspannen die Kernhülle und verbinden das Innere des Zellkerns mit Komponenten des umgebenden zytoplasmatischen Zytoskeletts. LINC-Komplexe bestehen aus zwei evolutionär konservierten Proteinfamilien, Sun-Proteinen und Nesprinen, die C-terminale molekulare Signaturmotive beherbergen, die als SUN- bzw. KASH-Domänen bezeichnet werden. Sonnenproteine sind Transmembranproteine der inneren Kernmembran, deren N-terminale nukleoplasmatische Domäne mit der Kernlamina interagiert, während ihre C-terminalen SUN-Domänen in den perinukleären Raum hineinragen und mit der Kash-Domäne von Nesprins interagieren. Kanonische Nesprin-Isoformen haben einen N-Terminus unterschiedlicher Größe, der in das Zytoplasma projiziert und mit Komponenten des Zytoskeletts interagiert. Dieses Protokoll beschreibt die Validierung einer dominant-negativen transgenen Mausstrategie, die endogene SUN/KASH-Interaktionen auf zelltypspezifische Weise stört. Unser Ansatz basiert auf dem Cre/Lox-System, das viele Nachteile wie perinatale Letalität und zellnicht-autonome Phänotypen umgeht, die mit Keimbahnmodellen der LINC-Komplexinaktivierung assoziiert sind. Aus diesem Grund bietet dieses Modell ein nützliches Werkzeug, um die Rolle von LINC-Komplexen während der Entwicklung und Homöostase in einer Vielzahl von Geweben zu verstehen.

Dieses Protokoll zeigt die Nützlichkeit der Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) Mausmodell EGFP-KASH2 Ausdruck cerebellar Purkinje-Zellen unter Verwendung Tg (PCP2-Cre) Mäusen zu beschränken. Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) Sekundärteilchen, die LacZ / V5 offenen Leserahmen an P6 durch die Rekombinase Cre, wodurch die Expression von EGFP-KASH2 spezifisch an Purkinje-Zellen (2A) gezielt führenden geschnitten. Wie erwartet, ist EGFP-KASH2 zur Kernhülle richtet, wie durch die um den Kern (2B)</stro...

Kernige Hüllproteine spielen eine zentrale Rolle in vielen grundlegenden biologischen Prozessen und wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Cre/Lox-basiertes Mausmodell, das die räumlich-zeitliche Kontrolle der Störung von LINC-Komplexen ermöglicht.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Nützlichkeit eines transgenen Mausmodells zu veranschaulichen, das die induzierbare und gezielte Expression eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten EGFP-Cache-two-Peptids in vivo sowie die daraus resultierende Störung endogener Linker-Komplexe ermöglicht. In diesem Experiment wird die Expression des fluoreszenzmarkierten Cache two geziilt auf die Purkinje-Zellen des Kleinhirns ausgerichtet. Dieser genetische Ansatz kann zentrale Fragen zur Rolle der Linker-Komplexe bei der Kernpositionierung in verschiedenen Geweben beantworten.Die induzierbare und gezielte Expression von E-G-F-P-K zwei bietet mehrere Vorteile. Erstens erfordert sie ein einziges Zuchtverfahren von Cay-Mäusen mit jeder vorhandenen Cruise-Stamm. Zweitens umgeht dieser Ansatz die perinatale Letalität, die bei Mausmodellen mit Keimbahnmutationen von Komponenten des Link-Komplexes beobachtet wird.Schließlich ermöglicht diese Methode die Untersuchung der Physiologie von Link-Komplexen in spezifischen Zellen oder Geweben in vivo. Chloe Potter, ein Mitglied des Labors, wird Ihnen die verschiedenen Schritte zeigen, die erforderlich sind, um E-G-F-P-K zwei

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Dieses Video beschreibt ein Verfahren zum Knockout des Zielgens unter Verwendung eines Tamoxifen-induzierbaren Cre-Rekombinase-Systems nach intraperitonealer Injektion von Tamoxifen in einem Mausmodell.

CreER-LoxP-System-basierte Zielgen-Inaktivierung: Ein Tamoxifen-induzierbares Cre-Rekombinase-System für den Zielgen-Knockout in einem Mausmodell

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung...

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Erfahren Sie die Validierung eines transgenen Mausmodells zur induzierbaren Störung von LINC-Komplexen in zellspezifischen Geweben. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kernpositionierung.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

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