Name: Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen Ex Vivo Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie die Verabreichung von Verbindungen an intakte Pankreasinseln mittels PLGA-Mikrosphären zur Untersuchung der Beta-Zell-Proliferation. Diese Methode ermöglicht lokalisierte Freisetzung für Diabetes-Forschung.

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Die Autoren danken Bethany Carboneau (Vanderbilt University) für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir danken auch Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) für die Isolierung von Inselzellen und Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) und Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) für die Nutzung ihrer Zentrifugen- und Gewebekulturanlage. Diese Forschung umfasste die Nutzung des Islet Procurement and Analysis Core des Vanderbilt Diabetes Research and Training Center, das durch NIH-Zuschüsse DK20593 unterstützt wurde. Diese Arbeit wurde durch ein Postdoctoral Fellowship der American Heart Association (14POST20380262) an R.C.P. und Zuschüsse der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) und des Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) an M.A.G. unterstützt.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und durchgeführt. 1. Labeling COI mit Fluorophore (Optional) <ol><li> Wähle einen fluoreszierenden Farbstoff, der mit einer freien primären Amin (beispielsweise auf einem Protein), wie beispielsweise Succinimidylester oder Fluorescein - Derivate reagieren, Mikrokügelchen Ladung zu visualisieren. Auflösen 8x molarer Überschuß (bezogen auf Mol COI) von Fluorophor in 200 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Resuspendieren von 50 mg COI bis zu einem Endvolumen von 800 ul in einem Fahrzeug-Lösung (Endkonzentration von 62,5 ng / ul). Die Trägerlösung wird in Abhängigkeit von der Quelle des COI variieren. HINWEIS: Typische Fahrzeuglösungen umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder DMSO. </li><li> Fügen Sie alle Fluorophor / DMSO-Lösung aus Schritt 1.1 und resuspendieren COI. Vortex über Nacht bei 4 ° C. Alternativ vortexen der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur(RT) für 4 Stunden. </li><li> Im Anschluss an die Markierungsreaktion überschüssiges Fluorophor eine Entsalzungs Spalte. <ol><li> Drain-Speicherpuffer von Entsalzungssäule und spüle mit 16 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Entsorgen Sie durch alle fließen. </li><li> Fügen Sie die fluoreszenzmarkierten COI an die Entsalzungssäule. Eluieren mit 1,2 ml VE-Wasser und sammeln durch den Fluss. </li><li> Wiederholen Sie Elutionsschritt zusätzlich viermal, das Hinzufügen jedes Mal 1,2 ml VE-Wasser und die Strömung durch als getrennte Probe zu sammeln. </li><li> Gefriert alle gesammelten Strömung durch Proben bei -80 ° C lyophilisieren und gemäß den Anweisungen des Herstellers für 24 Std. </li></ol></li></ol> 2. COI belasteten Microsphere Herstellung über die Wasser-in-Öl-in-Wasser - Emulsion Solvent Evaporation Method <ol><li> 1 mg des fluoreszenzmarkierten COI zu 100 ul entionisiertem Wasser die erste Wasserphase (W1) zu bilden. </li><li> Man löst 65 mg Poly (milch-co-glykol acid) (50:50 Lactid: Glycolid, Molekulargewicht 54.000 - 69.000) in 750 &amp; mgr; l Dichlormethan in einem Reaktionsgefäß. Ultrasonicate für 10 bis 30 s (bei 160 W), um vollständig den PLGA aufzulösen. Dies bildet die Ölphase (O). </li><li> In allen der W1-Phase erzeugt in Schritt 2.1 auf die O-Phase in einer tropfenweise Art und Weise. Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm für 30 sec Emulgieren der W1 / O-Phase zu bilden. </li><li> Fügen alle der W1 / O-Phase in eine tropfenweise Art und Weise zu 15 ml einer 1% (Gewicht / Volumen) wässrigen Poly (vinylalkohol) (PVA) -Lösung und Emulgieren für 30 sec unter Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm . </li><li> Übertragen die Emulsion erzeugt in Schritt 2.4 in einen 200-ml-Rundkolben und unterliegen einer 635 mm Hg Vakuum am Rotationsverdampfer für 1 Stunde unter Verwendung des Lösungsmittels und erzeugen die wässrige Phase zu entfernen. </li><li> Aliquot 1 ml der wässrigen Phase erzeugt, in Schritt 2,5 bis vierzehn Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der wässrigen Lösung in die Mikrozentrifugenröhrchen bei 7.500xg für 8 min. HINWEIS: Bei diesem Schritt werden die Mikrokügelchen in der verbleibenden wäßrigen Lösung und sind mit dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens eingeengt. </li><li> Vorsichtig 900 ul der wässrigen Lösung aus den mit einer Mikropipette Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, Pipettieren, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören. <ol><li> Waschen Sie die Mikrokügelchen von überschüssigem PVA durch Zugabe von 1 ml Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen entionisiert. Zentrifuge bei 7.500 × g für 8 min und wieder vorsichtig 900 ul einer wässrigen Lösung von den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette, Pipettieren zu entfernen, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören. ANMERKUNG: Die restlichen 100 &amp; mgr; l wässrige Lösung enthält, die erzeugten Mikrokugeln. </li></ol></li><li> Fixieren Sie die wässrigen Mikrokügelchen Lösung erzeugt in Schritt 2.7 bei -80 ° C. </li><li> Lyophilisieren Mikrokugeln mit einem Lyophilisator Verwendung nach HerstellerAnweisungen und bei -20 ° C. HINWEIS: Messen Beladungseffizienz des COI durch vollständiges Auflösen von PLGA - Mikrokügelchen und die Proteinkonzentration relativ zu einer Standardkurve des freien Proteins 7 zu bestimmen. </li><li> Als negative Kontrolle, eine Charge von &quot;leeren&quot; Mikrokugeln erzeugen (im Folgenden als Steuermikrokugeln bezeichnet). HINWEIS: Die Erzeugung von Steuermikrokugeln ist identisch zu der Erzeugung von hydrophilen COI-beladenen Mikrosphären, ohne COI zusätzlich zu 800 ul der Trägerlösung in Schritt 1.2. Spiel Steuer Partikel in Massenkonzentration von PLGA in Bezug auf COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen für β-Zellen-Mitogen-Assay. </li></ol> 3. Herstellung von Islet Kultur, Medien und Pre-Test Medien <ol><li> Bereiten 200 ml Medium für die Kultur von intakten Maus Inselchen: RPMI 1640 Medium mit 11 mM Glukose supplementiert, 10% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als istlassen Kulturmedien). Anmerkung 1: Im Gegensatz zu fötalem Rinderserum (FBS), Pferdeserum fehlt Plazentalaktogen, ein Induktor von β-Zellproliferation, die Analyse in dem Proliferationsassay confounds. ANMERKUNG 2: Wenn die PLGA-Mikrokugeln nicht sterilisiert werden vor der Verwendung, die Zugabe von Antibiotika zu den Kulturmedien von entscheidender Bedeutung mikrobiologische Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Entfernen 25 ml islet Kulturmedien mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung und in einem 50 ml konischen Röhrchen. Ergänzen die 25 ml islet Kulturmedien in der 50 ml konischen Röhrchen mit einer Endkonzentration von 0,2 mM EGTA die Vorassay-Medien zu erzeugen. HINWEIS: Die Zugabe von EGTA leicht lockert Zell-Zell-Kontakte in den kleinen Inseln ohne Inselarchitektur zu verändern. Dies hilft, die COI sicherstellen können, die inneren Zellen der Insel zu erreichen und hilft Nekrose der zentralen Insel zu verhindern. </li></ol> 4. Die Anzucht von Intact Maus Inselchen <ol><li> Isolieren intakter Inseln aus einem vorher ausgewählten Stamm, Geschlecht, age und Genotyp der Mäuse nach einer Routine Kollagenaseverdau des Pankreas 8,9. Pool zusammen Inseln aus wie Proben. </li><li> Aliquot 40 Inselchen in eine Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte in 200 ul islet Kulturmedien. Optisch Größe-Spiel Inseln pro Vertiefung (eine genaue Beurteilung der Insel equivalency (IEQ) zwischen den Proben ist nicht erforderlich). Füllen Sie leere Brunnen unmittelbar neben Brunnen mit kleinen Inseln mit 200 &amp; mgr; l sterilem Wasser eine Verdampfungspuffer zur Verfügung zu stellen. Kultur Inselchen in Medien über Nacht bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2. </li></ol> 5. Wieder Suspension von COI-geladen und die Kontrolle von PLGA Microspheres <ol><li> Nachdem über Nacht islet Erholung resuspendieren Mikrokügelchen durch Zugabe Vorassay-Medien zu einem Aliquot von lyophilisiertem COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen, so dass die Endkonzentration von COI in dem Reaktionsgefäß beträgt 10 ng / &amp; mgr; l (die Menge des COI in einer gegebenen Menge an die erzeugten microssphäre wurde in Schritt 2.9) bestimmt. Beschallen die resuspendierten COI-beladenen Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Steuer PLGA-Mikrokugeln durch Zugabe des gleichen Volumens Vorassay-Medien zu einer gleichen Masse von lyophilisierten Kontroll PLGA-Mikrokügelchen. Beschallen die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C. </li><li> Optisch bestätigen Mikrokugeln durch Pipettieren von 2 ul resuspendiert Mikrokugeln zwischen zwei Glasplättchen verteilt sind. Visualisieren Mikrokugeln mit einem 40X-Objektiv auf einem Epifluoreszenz oder Hellfeldmikroskop verwendet wird. </li><li> Wenn eine nennenswerte Aggregation von Mikrosphären ist noch sichtbar, beschallen in einem Eiswasserbad für weitere 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C und repeat Visualisierung resuspendiertes Mikrokugeln. </li></ol> 6. Behandlung von Inselchen mit COI-geladen oder Steuer PLGA Microspheres &lt;/ P&gt; <ol><li> Für jede Vertiefung mit COI-beladenen Mikrosphären behandelt werden, Assaymedium herzustellen, indem man die 10 ng / &amp; mgr; l der resuspendierten COI-Mikrokügelchen mit bereits Testmedium auf ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l und einer vorbestimmten Endkonzentration verdünnt wird. HINWEIS: Die optimale Endkonzentration des Proteins wird für jeden COI für diesen Assay verwendet, variieren. Idealerweise werden eine Reihe von Endkonzentrationen getestet. </li><li> Für jede Vertiefung als Kontrolle verwendet werden, Steuerassaymedium herzustellen, indem die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen Verdünnung in Schritt 5.2 mit dem gleichen Verdünnungsvolumen erzeugten verwendet 6.1 Die COI-beladenen Mikrosphären in Schritt zu verdünnen. HINWEIS: Islets behandelt mit Kontrollassaymedium wird als negative Kontrolle dienen Erfassung irgendeiner Wirkung zu ermöglichen, die leere Mikrokugeln auf die experimentellen Ergebnisse haben können. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 100 ul der Inselkulturmedien aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette, so dass keine kleinen Inseln aus den Vertiefungen verdrängt werden. fügen Sie vorsichtig 100 μl Assaymedium oder 100 &amp; mgr; l Kontrollassaymedium zu jeder Vertiefung. </li><li> Inkubieren Inselchen bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2 für drei Tage. </li></ol> 7. Dispergierwerkzeuge Intact Inselchen auf Objektträger <ol><li> Nach drei Tagen mit einer Mikro verwenden, um sorgfältig Testmedien aus allen Vertiefungen entfernen und zu entsorgen, um nicht-Inseln zu entfernen. fügen Sie vorsichtig 200 ul PBS zu Inselchen sie der Testmedien zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig und PBS mit einer Mikropipette zu verwerfen und sanft Inseln wieder mit einem zusätzlichen 200 &amp; mgr; l PBS waschen. </li><li> Entfernen und entsorgen PBS mit einer Mikropipette und fügen 100 ul 0,025% Trypsin, 2 mM EDTA-Lösung. 3 min bei RT inkubieren. Pipettieren Inselchen in der Trypsin-EDTA-Lösung nach oben und unten je 2 min bis Inseln werden visuell in einzelne Zellen dispergiert und bestätigt werden (beachten Sie, dass einige kleine Klumpen von Zellen noch vorhanden sein können) mit einem Lichtmikroskop. Übertragen Sie das gesamte Volumen jeder Vertiefung einzelnerly in labeled- Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 400 ul der Inselkulturmedien zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen, die Trypsin-vermittelte Zell-Dissoziation zu stoppen. </li><li> Zentrifuge Proben für 5 min bei 100 × g bei 4 ° C Inselzellen auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu pelletieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand einer Mikropipette und Pellet in 200 ul frische Inselkultur-Medien. </li><li> Unter Verwendung eines Zyto-Zentrifuge, distanzierte Zentrifuge Inseln bei 140 × g für 3 min auf geladene Objektträger. </li><li> Luft trocknen Dias bei RT für 10 min, ziehen dann einen Rahmen um die dissoziierte Inselchen mit einem hydrophoben Markierungsstift. </li><li> Fix-Zellen mit 75 &amp; mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 10 min. Entfernen Sie die 4% PFA und vorsichtig waschen Zellen in 75 &amp; mgr; l PBS zweimal. Nach dem Waschen permeabilisieren Zellen mit 75 &amp; mgr; l 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min. Dann waschen Sie die Zellen mit 75 &amp; mgr; l PBS. Achtung: PFA ist bekannt, allergen, krebserregend und giftig. </li></ol&gt; 8. Immunofluoreszenz Kennzeichnung von Dissociated Inselchen für Insulin und die Zellproliferation Marker, Ki67 <ol><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer durch zwei nasse Handtücher in den Boden einer 100 Dia Kapazität Objektträger Box platzieren. </li><li> Die Objektträger flach nach unten (Zellen nach oben) in der feuchten Kammer. Vorbereiten Proben für die Markierung durch die PBS aus dem vorhergehenden Waschschritt Aspirieren einer Mikropipette und Zugabe von 75 &amp; mgr; l Blockierlösung (5% normalem Eselserum (NDS) in PBS) zu jeder Folie zu blockieren unspezifische Bindung von Antikörpern an den Proben. Inkubiere Objektträger in Lösung für 1 Stunde bei RT blockiert. </li><li> enthält Meerschweinchen-anti-Insulin und Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörpern, verdünnt auf 1 &amp; mgr; g / ml in 5% NDS in PBS vorsichtig absaugen Lösung unter Verwendung einer Mikropipette blockieren und 75 &amp; mgr; l primärer Antikörper-Lösung hinzu. für 1 h bei RT inkubiert. HINWEIS: Alternative Marker der Zellproliferation umfassen wuchernden cell nuclear antigen (PCNA) und Phosphohistone H3 (PH 3), </li><li> vorsichtig absaugen primären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und spülen Sie die Zellen mit 75 &amp; mgr; l PBS. Absaugen PBS mit einer Mikropipette und spülen Zellen zwei Mal mit je 75 &amp; mgr; l PBS. Inkubieren jede Probe mit 75 &amp; mgr; l anti-Meerschweinchen-Cy5 sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers Cy3 bis 2 &amp; mgr; g / ml verdünnte Lösung für 1 h bei RT in blockieren. HINWEIS: Verwenden Sie mit dem gleichen oder spektral überlappende Fluorophore markierte Antikörper verwenden, die bereits verwendet wurde, um die Mikrokugeln beschriften nicht zweitrangig. </li><li> Absaugen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und Inkubation in 75 &amp; mgr; l von 300 nM DAPI in PBS für 3 min bei RT mit. Absaugen DAPI mit einer Mikropipette und spülen Sie in VE-Wasser für 5 min. </li><li> Vorsichtig absaugen Wasser aus Proben mit einer Mikropipette. Spot eine Tropfen (etwa 100 ul) von schnelltrocknend Befestigungslösung verblassungshemmenden Reagenz auf einem Deckglas enthält. Kehren Sie die Mikroskop-Objektträger Probenseite nach unten, onde Montagelösung. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schieber eine Pipettenspitze mit Blasen zu entfernen und überschüssige Flüssigkeit mit einem weichen Reinigungstuch abwischen. Erlauben Deck über Nacht bei RT trocknen. </li></ol> 9. Bildaufnahme und Analyse <ol><li> Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer angeschlossenen Kamera zur Bildaufnahme. Für jeden Fluorophor, bestimmen die optimale Belichtungszeit (in der Regel 20 msec für DAPI, 40-80 msec für Insulin und 250 msec für Ki67). Sicherzustellen Bildaufnahmeparameter für alle Proben gleich sind. </li><li> Für jede Probe zählen manuell 3000 Insulin-positiven Zellen und derer zählen, wie viele sind auch Ki67-positiv. Nur zählen Insulin-positive Zellen, die eine gut definierte und deutlich sichtbaren Kern haben. Der prozentuale Anteil proliferierender β-Zellen für jede Probe durch die Anzahl der Ki67-positiv / Insulin-positive Zellen durch die Gesamtzahl von Insulin-positiven Zellen Dividieren und Multiplizieren mit 100. </li><li> Nach determining den Prozentsatz für jede Probe β-Zellen von proliferierenden, festzustellen, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in Proliferations β-Zellen zwischen Kontroll- und experimentellen Proben vorhanden ist, indem Ergebnisse mit einer Einweg-ANOVA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software statistischen Analyse. </li></ol>

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<li>Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pH-+and+temperature-responsive+microparticles+for+protein+delivery+to+ischemic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues.</a> Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).</li>
<li>Poole, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , wenn sie <...

Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell - Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose - Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame Therapien entwickelt werden können. Die Transplantation von menschlichen Kadaver Inseln in Personen mit Diabetes stellt Blutzucker-Homöostase für einige Zeit, aber die Verfügbarkeit und den Erfolg dieses experimentellen Verfahrens wird durch einen Mangel an menschlichen Inselchen für Transplantation und von ß-Zelltod in den kleinen Inseln achtern behinderter Transplantation 4. Selbst mit der Entdeckung von Faktoren , die die Vermehrung von Insulin-produzierenden Zellen zu induzieren, eine große Herausforderung noch existiert , diese Faktoren zu den relevanten Stellen in vivo zu liefern. Eine Strategie für eine nachhaltige lokale Auslieferung von β-Zellen-proliferative Verbindungen ist Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA). PLGA hat eine Geschichte der Verwendung in FDA Drug - Delivery - Produkte zugelassen seiner hohen Sicherheit durch, die biologische Abbaubarkeit und erweiterte Freisetzungskinetik 5. Insbesondere ist PLGA ein Copolymer aus Lactid und Glycolid , das mit Wasser durch Hydrolyse abgebaut wird entweder in vivo oder in Kultur zu Milchsäure und Glykolsäure, die natürlich Metaboliten im Körper auftreten. Die verkapselte Wirkstoff-Verbindung kann sowohl durch Diffusion und / oder Abbau gesteuerte Freisetzungsmechanismen in die Umgebung freigesetzt werden. Verkapselung von COI bietet Schutz vor enzymatischem Abbau, die Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Reagens gegenüber unencapsulated COI 5. Wir schlagen vor , dass PLGA - Mikrokügelchen verwendet werden können Kandidatenverbindungen auf intakte Inseln in Kultur zu verabreichen, und letztlich in vivo. Testen der Wirksamkeit von PLGA β-Zell - Mitogene zu verabreichen vivo zu Inselchen ex ist kritisch , vor der Transplantation Protokolle untersucht werden. Derzeit gibt es keine Technik, β-Zellproliferation in lebenden Tieren zu messen. Experimente Wirksamkeit potenzieller proliferative Verbindungen in vivo zu beurteilen , daher Verabreichung dieser Verbindungen erfordern Tiere zu leben, mit anschließender Trennung und Verarbeitung von Bauchspeicheldrüsen für Immunmarkierung. Solche Protokolle sind teuer und mühsam, und erfordern die Verbindung systemisch verabreicht werden, ohne Garantie, dass sie die Inseln zu erreichen. Umgekehrt sind einige immortalisierte β-Zelllinien für die Untersuchung von Insulin-produzierenden Zellen in Kultur zur Verfügung, aber diese Zellinien fehlt das islet Architektur und environment gefunden in lebenden Organismen 6. Immortalisierte β-Zelllinien sind auch als mit einem viel höheren Grad an Replikations als endogene β-Zellen in vivo charakterisiert, wodurch Analyse von Verbindungen komplizieren die Proliferation induzieren. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, das intakte Inseln, isoliert aus erwachsenen Mäusen verwendet. Im Gegensatz zu β-Zelllinien behalten intakte Inseln normale Inselarchitektur. Ebenso reduziert im Gegensatz zu Experimenten in vivo durchgeführt, Verabreichen proliferative Verbindungen direkt mit kultivierten intakte Inseln signifikant die Menge an Reagenzien , die genau erforderlich ist , um β-Zell - Proliferation zu messen. Die vorliegende Studie verwendet PLGA ein COI, in diesem Beispiel rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) zu verabreichen. Das hier beschriebene Verfahren verleiht einen signifikanten Vorteil gegenüber der Verabreichung von rohen Verbindung zu kultivierten Inseln, wie es für eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung in th erlaubte Medien. Bemerkenswert ist, kann dieser Assay eine Vielzahl von Proteinen und Antikörpern von Interesse intakte Inseln zu verabreichen, werden modifiziert. Auswirkungen auf andere endokrine Zelltypen, einschließlich α-Zellen, ebenfalls analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carbonsäure, Succinimidylester, 6-Isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>Zur Markierung von COI mit Fluorophor</td></tr><tr><td>DMSO Dimethylsulfoxid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Zum Auflösen von Fluorophor in Schritt 1</td></tr><tr><td>Einweg-PD-10-Entsalzungssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Entsalzungssäule in Schritt 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-Lactid-co-glycolid), esterterminiert, Molekulargewicht 54.000 - 69.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2 verwendet</td></tr> Poly<tr><td>(vinylalkohol) Molekulargewicht 89.000 - 98.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Wird zur Erzeugung von Mikrosphären in Stufe 2</td></tr><tr><td>verwendet RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>Zur Kultivierung von Inselzellen</td></tr><tr><td>Dextrose wasserfrei</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Ergänzung für Inselmedien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotika für Inselmedien</td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Ergänzung für Inselmedien</td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Für die Kultivierung von Inselzellen</td></tr><tr><td>Ethylenglyko-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement für Pre-Assay-Inselmedien</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>Zum Spinnen von Zellen auf Objektträger</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Wird bei der Dissoziation von Inselzellen</td></tr><tr><td>verwendet Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Zur Fixierung von Zellen</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>Für die Permeabilisierung</td></tr><tr><td>von Zellen Normales Eselserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blockierungsreagenzien für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Anti-Ki67-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Für Ki67-Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Polyklonales Meerschweinchen Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Für Insulin-Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Für Ki67-Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>Für Insulin-Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Für die Zellkernvisualisierung in Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Schnelltrocknende Einbettmedien</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &deg; C 4,5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>Für die Lyophilisierung von Mikrosphären</td></tr></tbody></table>

sustained verabreichung von β-zellen-mitogene zu intact maus inselchen<em&gt; ex vivo</em&gt; verwendung von biologisch abbaubaren poly (milch-co-glykolsäure) microspheres

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell - Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in - vivo - Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in - situ - Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.

Figur 1 ist eine visuelle Darstellung der Mikrokugeln unter Verwendung des obigen Protokolls erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ergibt rhCTGF beladenen Mikrokügelchen in verschiedenen Größen. Der größte Teil der Mikrokügelchen zwischen 1 und 10 &amp; mgr; m im Durchmesser sein, obwohl einige Mikrokugeln kann größer (Abbildung 2). Falls gewünscht, können Mikrokügelchen eine Größe basierend auf Herstellungsparameter abgestimmt und op...

Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA)-Mikrosphären zu verwenden, um Verbindungen in kultivierte, intakte Pankreasinseln abzugeben, um die Wirkung einzelner Substanzen auf die Proliferation adulter pankreatischer Beta-Zellen zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Substanzen zu testen, die lokal und kontrolliert an intakte Inseln abgegeben werden. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie leicht an alternative Biomaterialien für die Abgabe, interessierende Verbindungen und Endpunktanalysen angepasst werden kann.Diese Methode bietet außerdem das Potenzial, Wirkstoffe in Kombination mit der etablierten In-vivo-Übertragung von Inseln abzugeben. Die Herstellung der PLGA-Mikrosphären wird Taylor Kavanaugh, der Doktorand in meinem Labor, demonstrieren. Geben Sie zunächst einen Milligramm der fluoreszenzmarkierten Verbindung von Interesse hinzu, um die erste wässrige Phase zu bilden, zu 100 Mikrolitern entionisiertem Wasser.Lösen Sie anschließend 65 Milligramm PLGA in 750 Mikrolitern Dichlormethan in einem Szintillationsfläschchen und behandeln Sie die Mischung 10 bis 30 Sekunden lang mit Ultraschall bei 160 Watt, um das PLGA vollständig aufzulösen. Dadurch entsteht die Ölphase. Geben Sie die gesamte erste Wasserphase tropfenweise zur Ölphase hinzu.Verwenden Sie dann einen Handhomogenisator, um die Lösung bei 20.000 U/min 30 Sekunden lang zu emulgieren, wodurch die erste Wasser-Öl-Phase entsteht. Fügen Sie anschließend die gesamte erste Wasser-Öl-Phase tropfenweise zu 15 Milliliter 1 %iger PVA-Lösung hinzu und emulgieren Sie wie zuvor gezeigt. Überführen Sie danach das gesamte Volumen der Emulsion in einen 200-Milliliter-Rundkolben und verwenden Sie einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel unter einem Vakuum von 635 Millimeter Quecksilbersäule eine Stunde lang zu entfernen, wodurch die wässrige Phase entsteht.Geben Sie je ein Milliliter der wässrigen Phase in 14 Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Mikrosphären durch Zentrifugation. Entfernen Sie am Ende der Zentrifugation mit einer Mikropipette 900 Mikroliter der wässrigen Lösung aus jedem Röhrchen, wobei darauf geachtet werden muss, die Pellets nicht aufzurühren. Waschen Sie die Mikrosphären mit je einem Milliliter entionisiertem Wasser, gefolgt von der vorsichtigen Entfernung von 900 Mikrolitern des Überstandes.Anschließend 900 Mikroliter deionisiertes Wasser zu den verbleibenden 100 Mikrolitern der Überstände hinzufügen. Dann kurz verwirbeln und sonifizieren, um die Pellets erneut in Suspension zu bringen. Nach der Isolierung der Inseln aus den betreffenden Versuchstieren 40 optisch größengleiche Inseln in ein Loch einer 96-Loch-Gewebekulturplatte in 200 Mikrolitern Inselkulturmedium aussäen.Am nächsten Morgen ein Aliquot Mikrosphären in Prä-Assay-Medium resuspendieren, sodass die Endkonzentration der interessierenden Verbindung im Reaktionsgefäß 10 Nanogramm pro Mikroliter beträgt, und die Mikrosphären 10 Minuten lang bei 160 Watt in einem Eiswasserbad mit 10 Sekunden langen Impulsen bei vier Grad Celsius beschallen. Danach vorsichtig 100 Mikroliter Islet-Kulturmedium aus jedem Well entnehmen, ohne die Inseln zu lösen, und die Kulturen mit 100 Mikrolitern des Mikrosphären enthaltenden Assay-Mediums inkubieren. Nach drei Tagen das Assay-Medium vorsichtig aus allen Wells entfernen, ohne die Inseln zu stören, und die Inseln zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS vorsichtig waschen.Inseln haften nur locker an einer 96-Loch-Platte. Daher ist es entscheidend, dass Medium und PBS vorsichtig aus jedem Loch entfernt werden, damit die Inseln nicht versehentlich gelöst und verworfen werden. Nach der zweiten Wäsche die Inseln vorsichtig für drei Minuten bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter Trypsin-EDTA-Lösung eintauchen, wobei nach zwei Minuten sanft pipettiert wird.Überführen Sie das gesamte Volumen jedes Wells in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 400 Mikroliter Islet-Kulturmedium zu jedem Röhrchen hinzu, um die Dissoziation zu stoppen. Nachdem die mikrosphärenbehandelten Inseln durch Zentrifugation gesammelt wurden, entfernen Sie vorsichtig die Überstände mit einer Mikropipette und resuspendieren die Pellets in 200 Mikrolitern frischem Islet-Kulturmedium. Anschließend zentrifugieren Sie die dissoziierten Inseln mit einem Cytospin auf geladenen Objektträgern.Nach dem Lufttrocknen zeichnen Sie mit einem hydrophoben Markierstift einen Rahmen um die Inseln und fixieren die Zellen mit 75 µL vierprozentigem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von zwei Waschungen mit jeweils 75 µL PBS. Nach der zweiten Waschung permeabilisieren Sie die Zellen mit 75 µL 0,2 % Triton X-100 in PBS für 10 Minuten, gefolgt von einer abschließenden Waschung mit 75 µL PBS allein. Um die Inseln immunologisch zu markieren, legen Sie die Objektträger mit der Zellseite nach oben in eine feuchte Kammer und entfernen Sie das PBS.Als Nächstes blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 75 µL normalem Eselserum bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde ersetzen Sie das Serum durch 75 µL des gewünschten primären Antikörpers und inkubieren erneut eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation saugen Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig ab und waschen die Proben mit 375 µL PBS-Puffer. Anschließend inkubieren Sie die Inseln für eine Stunde bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit 75 Mikrolitern des geeigneten immunfluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie die Lösung des sekundären Antikörpers durch 75 Mikroliter Dappy für drei Minuten, gefolgt von einer fünfminütigen Spülung mit entionisiertem Wasser. Nach Beendigung der Wäsche geben Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen einer schnell trocknenden Einbettlösung, die ein Anti-Fade-Reagenz enthält, auf einen Glasdeckel und legen einen Objektträger mit der Probenoberfläche nach unten auf die Einbettlösung.Der größte Anteil der Mikrosphären liegt im Durchmesser zwischen 1 und 10 Mikrometern, obwohl einige Mikrosphären größer sein können. Nach der Verteilung der intakten, mit PLGA-Mikrosphären behandelten Inseln und deren anschließender Immunmarkierung ist es üblich, Bereiche der Probe zu beobachten, die frei von jeglicher Markierung zwischen den Zellen sind, verursacht durch intakte Mikrosphären, die während der Waschschritte nicht vollständig entfernt wurden. Nach der Bildaufnahme kann der Prozentsatz an Ki67-insulinpositiven Zellen mithilfe einer Software zur Bildanalyse oder manuell durch Zählen der Gesamtanzahl markierter Zellen quantifiziert werden.Die Behandlung intakter Inseln mit rekombinanten humanen PLGA-Mikrosphären des Wachstumsfaktors für Bindegewebe über einen Zeitraum von drei Tagen führt, wie gerade gezeigt, zu einer erhöhten Proliferation der Beta-Zellen, was belegt, dass das Protein während der Herstellung der Mikrosphären keine Funktionalität verliert. Sobald die Technik beherrscht ist, können bei sachgemäßer Durchführung Ergebnisse innerhalb von weniger als einer Woche erzielt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass der Einfluss auf die Proliferation der Beta-Zellen in Ihrem Experiment je nach interessierender Substanz und den genauen Freisetzungs­kinetiken der hergestellten Mikrosphären variieren wird.Nach dieser Methode können andere Verfahren, wie beispielsweise die Cotransplantation von Wirkstoff-beladenen Mikrosphären zusammen mit intakten Pankreasinseln, durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu untersuchen, etwa ob der interessierende Wirkstoff die Proliferation von Beta-Zellen in vivo induzieren kann. PLGA hat eine etablierte Anwendungsgeschichte in medizinischen Geräten und Arzneimittelabgabesystemen, die von der FDA zugelassen wurden, und stellt somit eine geeignete Wahl für Forschende und Kliniker dar, die therapeutische Wirkstoffe über einen längeren Zeitraum hinweg gezielt an bestimmte Gewebe abgeben möchten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wirkstoff-beladene PLGA-Mikrosphären herstellt und sie kultivierten, intakten Inseln verabreicht.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung, während dieser Prozedur getroffen werden sollten.

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Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

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Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

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Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.

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In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

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Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

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Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen Ex Vivo Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres (Video) | JoVE Journal

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen

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