Name: Ein In Vitro Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Lernen Sie die Organ-Kulturmethode für murine Bandscheiben zur Untersuchung entzündlicher Reaktionen und Degenerationsmechanismen. Diese Technik ermöglicht die Erhaltung der nativen Anatomie und unterstützt die Arzneimittelforschung.

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Diese Arbeit wurde von der Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Ausbildung Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 und NIH K01AR069116 unterstützt. Die Autoren möchten sich Patrick Wong für seine Beiträge in der Datenerhebung danken.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Washington University in St. Louis Tierstudien Ausschuss durchgeführt. 1. Tiere <ol><li> Erhalten Sie zwei Stämme von Mäusen: 10 Wochen alte Balb / c (n = 6, Balb-M, BALB / cAnNTac) und 10 Wochen alte nuclear factor kappa-B-Luciferase-Reporter Tiere (NF-κβ-luc) gezüchtet auf einem BALB / c-Hintergrund (n = 6, BALB / c-Tg (Relà-luc) 31Xen). </li><li> Vor der Dissektion euthanize Tiere mit CO 2 Überdosierung bei einer Flußrate von 2,5-3 l / min für 5 min , gefolgt von weiteren 2 min Zeit der Behausung. </li><li> Desinfizieren des Außenbereiches des Tieres, indem sie in einem 70% Ethanol-Bad für 2 min vor der Dissektion Baden. </li></ol> 2. Dissection <ol><li> Führte einen Längsvertikalschnitt auf der dorsalen Oberfläche der Maus kleine Dissektion Schere mit der Körperhöhle zu exponieren. </li><li> Machen Sie zwei vertikale Längsschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule des Tieres abder erste Lendenwirbel (L1) an die Schwanzwirbel (C8). </li><li> Unter Verwendung eines Skalpells, feinen Pinzette und Schere fein Dissektion vorsichtig entfernen die Wirbelsäule von L1-C8 aus der Körperhöhle des Tiers. </li><li> vorsichtig entfernen überschüssige Weichgewebe die Wirbelsäule umgeben, während sichergestellt wird, um nicht abkratzen oder IVD auf der ventralen Seite verletzen. </li><li> die Wirbelsäule in die Wirbelkörper-scheiben Wirbel funktionelle Wirbelsäuleneinheiten (FSU) in der L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6 und C7 / C8 Scheiben weiter sezieren. </li><li> Spülen Sie die FSU in Hanks balancierter Salzlösung, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin für 2 min. </li><li> zuweisen zufalls die FSU in drei Gruppen: uncultured und unbehandeltem FSUs (frisch), gezüchteten aber unbehandelten FSUs (Kontrolle) kultiviert und behandelt FSUs stab (STAB). </li><li> Schnellfrost die frischen FSU Proben mit flüssigem Stickstoff unmittelbar nach Dissektion und Speicher in einem -20 ° C-Gefrierschrank. </li></ol> 3. Organkulturbedingungen<ol><li> Bereiten 500 ml steriles Kulturmedium von 1: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM: F12), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml serologischen Pipetten, Pipetten 2 ml Kulturmediums in jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Folgende Dissektion und spülen, stellen jeweils FSU in eine einzelne Vertiefung in den Medien gefüllten 24-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Proben in einem sterilen Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 und&gt; 90% Luftfeuchtigkeit bewahrt. </li><li> Nach einer anfänglichen Kulturdauer von 24 h, verletzen mechanisch STAB Gruppenproben über Nadeleinstich des Anulus fibrosus eine sterile 27-Gauge - Nadel , wie in 1A gezeigt. </li><li> Ändern Medien alle 48 h durch eine neue Medien gefüllte Vorbereitung 24-Well-Kulturplatte und Transfer Proben von der alten Platte auf die neue mit einem sterilen Pinzette. Aspirieren die alten Medien und dispose der alten Kulturplatte in einem Biohazard Abfalleimer. </li><li> Am letzten Tag der Kultur, Inkubieren alle Proben in Medium 0,75 mg / ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid für 24 h enthalten. </li><li> Danach gefriert ganzen FSUs mit flüssigem Stickstoff und Speicher in einem -20 ° C - Gefrierschrank , bis sie bereit für die mechanische Prüfung oder Histologie (1B). </li></ol> 4. Längs Messungen NF-kappaB <ol><li> Bild die FSU von NF-κβ-Luciferase Tieren bei 1, 5, 13 und 19 Tagen NF-kappaB Ausdruck zu bewerten. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von 1 mg / ml Luciferin-Lösung in jeder Vertiefung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Bild, um die Proben für die Biolumineszenz unter Verwendung des Abbildungssystems mit einer 1 min Belichtungszeit und bin Einstellung von 2. </li><li> Gleichzeitig verwendet die Maschine um ein Bild aufzunehmen und es mit dem Biolumineszenz-Bild überlagert die anatomische Lage der Lumineszenz in der IVD zu bestimmen. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. mechanische Beurteilung <ol><li> Bestimme das mechanische Verhalten der IVDs durch Verwendung Wegkontrolliert dynamische Kompression 9. </li><li> Unter Verwendung einen Dissektionsmikroskop, Skalpell und Pinzette, entfernt die knöchernen Wirbelkörper der FSU von jeder Probe, während der knorpeligen Endplatten intakt zu halten und den IVD befestigt. </li><li> Befestigen der isolierten IVDs auf eine 1 cm x 1 cm x 0,2 cm Aluminiumplatte unter Verwendung von Cyanacrylat-Klebstoff. </li><li> Messen Sie die Scheibenhöhe und Breite um durchschnittlich drei Messungen auf der Längsachse jeder Scheibe unter einem Laser-Mikrometer verwendet wird. Berechnen Sie das Scheibenhöhenverhältnis, indem die durchschnittliche Scheibenhöhe durch die maximale Scheibenbreite dividiert wird. </li><li> Verwenden der gemessenen Scheibenhöhe der Eingangsspannungswerte in mechanischen Tests verwendet zu berechnen. Beachten Sie, dass die durchschnittliche Scheibenhöhe um ± 39 um etwa 690 war. </li><li> Platzieren Sie die Proben in einer phosphatgepufferten Salzbades unter der compressiauf Maschine und Vorspannung der Scheibe bis 0,02 N. </li><li> Zyklisch komprimiert die Scheibe mit einer sinusförmigen Wellenform bei 1 Hz für 20 Zyklen bei der 1% Dehnung Ebene und 5% Dehnungsniveau für jede 3-Studien unter Verwendung von und die Last und die Verschiebungswerten der IVD aufzuzuzeichnen. Erlauben Sie 10 Minuten Zeit zwischen den Versuchen für die Scheibe ruht sich zu entspannen und um Verletzungen zu vermeiden. </li><li> Berechne die mittlere Steifigkeit von der Ladephase des letzten Zyklus, und berechnet die Verlusttangente von dem Phasenwinkel zwischen Last- und Verschiebungsdaten. </li></ol> 6. Proteoglycan und Kollagen Quantifizierung <ol><li> Nach der mechanischen Tests messen die Scheibe Naßgewicht durch das isolierte IVD in einer vorher tariertes Zentrifugenröhrchen platziert und Messen des Gewichts einer Analysenwaage verwendet wird. </li><li> Verdauen des isolierten IVDs in 250 &amp; mgr; l Papain-Digestion-Lösung (0,1 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, 0,005 M Cystein-HCl, pH 6,4) über Nacht bei 65 ° C ein Heizblock verwendet wird. </li><li> Zentrifuge Proben für 10 minbei 2000 × g und die überstehende Flüssigkeit sammeln. </li><li> Messen Sie das Proteoglycan-Gehalt des IVD durch die Dimethylmethylen blaue Verwendung (DMMB) -Assay mit Chondroitinsulfat-Standards. </li><li> Bereiten DMMB - Lösung (21 mg DMMB, 5 ml absolutes Ethanol, 2 g Natriumformiat in 1 l ddH 2 O). </li><li> Pipette 30 ul Standards und Proben in dreifacher Ausführung in einer 96-Well-Platte, zusammen mit 250 ul DMMB-Lösung in jeder Vertiefung. </li><li> Die Absorption der Platte bei 525 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Messen Sie den Kollagengehalt eines Hydroxyprolin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li></ol> 7. Histologie <ol><li> Fix eine Teilmenge der Proben in 4% Paraformaldehyd für 24 h, de-verkalken für 48 h in 5% Ameisensäure, Entwässern mit Ethanol und in Paraffin eingebettet werden. </li><li> Unter Verwendung eines Mikrotoms, Abschnitt werden die Proben sagittal bei 10 &amp; mgr; m Dicke und gelten Schnitte an den Glasobjektträger. Beflecken die Abschnitte mit Safranin-O / Fast Green und DAPI. </li><li> Unter Verwendung eines Lichtmikroskops, Bild gleitet bei 10facher Vergrößerung. </li></ol> 8. Contrast-enhanced microComputed Tomography (microCT) <ol><li> Scannen eine Teilmenge von Proben , die bei den 0, 2, 5 und 7-Tage - Zeitpunkt unter Verwendung von Ioversol Längskontrastverstärkung 10 und dem Anschluss Phosphomolybdänsäure (PMA) Kontrastverstärkung bei dem 7 - tägigen Zeitpunkt. </li><li> 4 h vor dem microCT Abtastzeit, fügt 300 ul 350 mg / ml Jod Ioversol-Lösung zu den Kulturmedien für eine Endkonzentration von etwa 50 mg / mL iodhaltigen Ioversol-Lösung und Inkubieren in einem sterilen Inkubator bei 37 ° C für 4 h. </li><li> Nach der Inkubation wickelt die Probe in steriler Gaze und in einem Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml. </li><li> Die Proben werden in dem System microCT und Scan bei 45 keVp, 177 &amp; mgr; A, 10,5 um Voxel-Größe, und 300 ms Integration. </li><li> Exportieren von Daten aus dem microCT als DICOM-Dateien und visualisieren Software ( <em&gt; zB OsiriX). </li><li> An dem 7-Tage-Zeitpunkt, zu beheben Proben mit einer 4% Paraformaldehydlösung für 24 Stunden unter Verwendung von, gefolgt von 5% PMA-Lösung für 3 Tage, und scannen Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 8.4 verwendet werden. </li></ol> 9. Dreidimensional Finite-Elemente-Modellierung <ol><li> Segment der DICOM - Dateien des IVD unter Verwendung von Software mit manuellem Thresholding (zB OsiriX). </li><li> Konvertieren Sie die NP und AF Volumina des IVD in Voxel-basierten Finite-Elemente-Netze mit Meshlab. </li><li> Kombinieren Sie die Mikrostrukturen des NP und AF eine komplette IVD zu bilden und gilt experimentell bestimmte Randbedingungen in der Finite-Elemente-Software. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren dieses Manuskript zu erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Organkultur des murinen FSU mit dem Schwerpunkt auf die biologischen Veränderungen in der IVD-Überwachung. Die erfolgreiche Aufrechterhaltung dieser Kulturen erfordert eine sorgfältige sterile Techniken. Insbesondere werden die Schritte der Präparation 2,1-2,6 und die Kultur Schritte 3,1-3,6 besondere Sorgfalt erfordern sterilen Bedingungen, um sicherzustellen, werden beibehalten, und diese Schritte sollten vorzugsweise in einem isolierten Behandlungsraum...

Schmerzen im unteren Rücken (LBP) ist der führende Faktor für die globale Behinderung und verlorene Produktivität am Arbeitsplatz, und die Amerikaner allein verbringen mehr als 50 Milliarden Dollar für LBP Behandlung 1. Obwohl weit verbreitet, bleibt die Ätiologie von LBP komplex und multifaktoriell. Allerdings ist Bandscheibe (IVD) Degeneration zu den bedeutendsten Risikofaktoren für LBP 2. Der IVD ist aus drei Mikrostrukturen: die äußere Anulus fibrosus (AF), der Innenraum Nucleus pulposus (NP) und zwei knorpeligen Endplatten, die die gesamte Struktur proximal und distal 3 - Sandwich. Mit dem Altern und Degeneration, ändern sich die Komponenten IVD Strukturell kompositionell und mechanisch 4. Diese Änderungen umfassen den Verlust von Proteoglykanen und Feuchtigkeit in der NP, verringerte Scheibenhöhe und verschlechterte mechanische Kompetenz 5. Diese Veränderungen sindoft durch Cytokine begleitet , die eine Entzündungsreaktion, sowie Neutrophilen und Spinalganglien Eindringen in den Gelenkraum kulminiert in einer Kaskade von Ereignissen zu fördern , die 6 bis LBP Symptomen führen. Die Untersuchung der Mechanismen der IVD-Degeneration ist eine Herausforderung beim Menschen, weil es oft nicht möglich ist, die Ursache für die Degeneration vor dem Auftreten von Schmerzen im unteren Rücken zu isolieren. Somit wurde ein reduktionistischen Ansatz , um das experimentelle System zu vereinfachen , bis auf die IVD Organ ermöglicht mechanistische Feinabstimmung der kausalen Variablen und Prüfung ihre nachgelagerten Effekte 5. Das System wird nur die nativen Zellpopulation reduziert und extrazelluläre Matrix umgibt, wodurch die direkte Interpretation der Auswirkungen von äußeren Reizen auf IVD-Degeneration zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglichen die niedriger Kosten und die Skalierbarkeit von murinen Modellen, sowie die große Anzahl von gentechnisch veränderten Tieren 7, für ter rasch gezielte Screening von IVD degenerative Mechanismen und mögliche Therapien. Hier beschreiben wir ein Maus-Organkultursystem, in der IVD Zell- und Gewebestabilität über 21 Tage gehalten wird, mit besonderem Schwerpunkt auf den IVDs gegeben homeostatic, mechanische, strukturelle und entzündliche Muster. Mit dieser Methode überwachen wir die funktionellen Veränderungen IVDs in einem Stich induziertes Verletzungsmodell 8 , die Mechanismen hinter Scheibendegeneration zu verstehen. Weiterhin beschreiben wir mehrere Anwendungen dieser Organkulturverfahren weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Modellierung des IVD zu leiten.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92096</td><td>Für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet 24-Well-Platte</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92024</td><td>Für Organkulturen</td></tr><tr><td>verwendet 25-ml-Pipetten</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94024</td><td>Für Organkulturen</td></tr><tr><td>verwendet 10-ml-Pipetten</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94010</td> Für <td>Organkulturen</td></tr><tr><td>verwendet 5-ml-Pipetten</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94005</td><td>Wird für Organkulturen</td></tr><tr><td>verwendet 500 mL Flaschenaufsatzfilter, 22 & Mikro; m</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99505</td><td>Wird für Filtermedien</td></tr><tr><td>10 & Mikro verwendet; L Pipettenspitzen</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140098</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet 200 & Mikro; L Pipettenspitzen</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140900</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>1.000 & Mikro; L-Pipettenspitzen</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140920</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td>Wird für Nährmedien</td></tr><tr><td>verwendet Optiray 350</td><td>Guebert</td><td>19133341</td><td>Verwendet für kontrastmittelverstärkte microCT</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Wird für Nährmedien</td></tr><tr><td>verwendet Penicillin Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Wird für Nährmedien verwendet</td></tr><tr><td>Tetrazoliumblauchlorid</td><td>Sigma</td><td>T4375</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet D-Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6152</td><td>Wird für die Biolumineszenzbildgebung</td></tr><tr><td>verwendet Chondroitinsulfat</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td>Wird für biochemische Assays verwendet</td></tr><tr><td>10% Phosphomolybdsäurelösung</td><td>Sigma</td><td>HT152</td><td>Wird für Kontrastmittel verwendet enhanced microCT</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma</td><td>S8884</td><td>verdünnt auf 0,1% Konzentration (in Wasser)</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FCF Sigma</td><td>F7258.001</td><td>% Konzentration</td></tr><tr><td>Papain aus Papaya-Latex</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3125</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Nukleinsäurefärbung</td></tr><tr><td>Cyanoacrylat-Kleber</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Klebstoff&nbsp;</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fischer Scientific</td><td>S348903</td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr> verwendet<tr><td>Big Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioDent</td><td>ActiveLife</td><td></td><td>Für mechanische Tests</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>AxioCam503</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>VivaCT40</td><td>Scanco</td><td></td><td>MicroCT</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Denver Instrument Company</td><td>A-200DS</td><td>Analysenwaage</td></tr><tr><td>Inkubator HERAcell 150i</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr> Organkultur-Dissektions-Oszilloskop <tr><td></td><td>VistaVision</td><td></td><td>Wird bei der Dissektion</td></tr><tr><td>verwendet Lasermikrometer</td><td>Keyence</td><td>LK-081</td><td>Messscheibenhöhe</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Wird für biochemische Assays</td></tr><tr><td>verwendet Mikrotom</td><td>Leica &nbsp;</td><td>RM2255</td><td>Wird für histology</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>für Statistik</td></tr><tr><td>verwendet MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Für die Modellierung</td></tr><tr><td>Osiri-LXIV</td><td>Pixmeo</td><td></td><td>Open</td></tr><tr><td>Source MeshLab v1.3.3</td><td>Visual Computing Lab - ISTI - CNR</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>PreView/FEBio 2.3</td><td>Utah MRL & Columbia MBL</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Federschere&nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp; &nbsp;</td><td>15000-02</td><td>Oder eine schöne Federschere</td></tr><tr><td>Feine Schere - Scharf (klein)</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp; &nbsp;</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere - scharf & (größer)</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp; &nbsp;</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>Fine Science Werkzeuge&nbsp; &nbsp;</td><td>11252-40</td><td>Mindestens 2; kann auch #3&nbsp; verwenden</td></tr><tr><td>Extra feine Graefe-Pinzette, gezahnt</td><td>Fine Science Tools&nbsp; &nbsp;</td><td>11150-10</td><td>Mindestens 2</td></tr><tr><td>Micro-Adson-Pinzetten, gezahnt</td><td>World Precision Instruments</td><td>503719-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson-Pinzetten, Zähne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501244</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #3</td><td>Fine Science Tools&nbsp; &nbsp;</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #4</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge&nbsp; &nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen - #23</td><td>Fine Science Tools&nbsp; &nbsp;</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Insektennadeln, Gr. 000</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadel</td><td>BD PrecisionGlide Nadeln</td><td>BD305109</td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in vitro</em&gt; organ culture modell der murine bandscheiben

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Bandscheibe (IVD) Degeneration ist ein wichtiger Faktor für Schmerzen im unteren Rücken. Der IVD ist ein fibrocartilagineum Gelenk, das in der Wirbelsäule Lasten zu übertragen und dämpfen dient. Der IVD besteht aus einem Proteoglycan reichen Nukleus pulposus (NP) und einem kollagenreichen Anulus fibrosus (AF) von knorpeligen Endplatten sandwichartig angeordnet. Zusammen mit den benachbarten Wirbeln, bildet die Wirbel-IVD-Struktur mit einer funktionellen Wirbelsäuleneinheit (FSU). Diese Mikrostrukturen enthalten einzigartige Zelltypen sowie einzigartige extrazellulären Matrix. Ganz Organkultur der FSU bewahrt die native extrazellulären Matrix, Zelldifferenzierung Phänotypen und zelluläre-Matrix-Interaktionen. Somit sind Organkultur-Techniken besonders nützlich für die komplexen biologischen Mechanismen des IVD zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen High-Throughput-Ansatz zur Kultivierung gesamte Lendenwirbel Maus FSU, die für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Therapien für die IVD eine ideale Plattform zur Verfügung stellt. Darüber hinaus beschreiben wir siele Anwendungen, die diese Organkulturverfahren nutzen weitere Studien einschließlich kontrastverstärkte microCT Bildgebung und dreidimensionale hochaufgelöste Finite-Elemente-Modellierung des IVD zu leiten.

Figuren 2-3 zeigen repräsentative Ergebnisse von Proteoglycan Verteilung, NF &amp; kgr; B Expression, Steifigkeit, Viskosität, Scheibenhöhe und Naßgewicht für kultivierte Maus IVDs. Wenn sie richtig kultiviert, werden die IVD Parameter der Kontrollgruppe nicht signifikant verschieden von der Frische-Gruppe. Wenn die Kultur infiziert ist oder auf andere Weise beeinträchtigt, wird die Kontrollgruppe aus der Frischen Gruppe unterschiedlich sein, vor allem in NF-kappaB-Expression und Proteoglykan Verteilung...

Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Das übergeordnete Ziel dieser in-vitro-Organkultur-Methode besteht darin, die Homöostase aufrechtzuerhalten und die entzündliche Reaktion der Bandscheiben in ihrer nativen Anatomie zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Bandscheibendegeneration und zum chronischen Kreuzschmerz zu beantworten und könnte bei der Entdeckung neuer Arzneimittel und Therapien unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass sie schnell durchgeführt werden kann, während gleichzeitig die Anatomie der Bandscheibe und anderer Gewebe erhalten bleibt.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die Sterilität aufrechtzuerhalten, und jede Kontamination die Versuchsergebnisse beeinträchtigen kann. Aufgrund der geringen Größe der Bandscheiben von Mäusen ist eine visuelle Demonstration der Dissektionsschritte und der Organkultur unerlässlich. Bevor mit diesem Protokoll begonnen wird, sollten zwei Stämme von zehn Wochen alten Mäusen beschafft werden: BALB/c und transgene Tiere, in denen das Luciferase-Gen unter Kontrolle des Promotors des nukleären Faktors kappa B exprimiert wird und die auf dem genetischen Hintergr

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel...

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kultivierung von Rinderbandscheiben in Bioreaktoren, um ein dreidimensionales Organkulturmodell zu entwickeln. Spezifische nährstoffarme Medien und degenerative Druckbedingungen werden auf die Bandscheiben angewendet, die die proinflammatorische und degenerative Mikroumgebung nachahmen, die bei Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium beobachtet wird. Die Scheibenhöhen werden nach der Behandlung gemessen, um die Auswirkungen von Nährstoffmangel und...

Generierung eines pro-inflammatorischen Organkulturmodells zur Simulation einer frühen Bandscheibenerkrankung

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines proinflammatorischen und degenerativen Organkulturmodells für Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium (IVD) unter Verwendung von TNF-α. Es wird das Verfahren zur Injektion von TNF-α in die Bandscheibe beschrieben und die Mechanismen erläutert, durch die TNF-α Entzündungen und Abbau der IVD induziert.

Generierung eines Organkulturmodells zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium

Intervertebrale Scheibendegeneration ist ein bedeutender Beitrag zu Rückenschmerzen und eine führende Ursache für Behinderung weltweit. Es gibt zahlreiche Tiermodelle der Bandscheibendegeneration. Wir zeigen ein Schafmodell der Bandscheibendegeneration, wobei ein Bohrer verwendet wird, der eine gleichbleibende Scheibenverletzung und ein reproduzierbares Niveau der Plattendegeneration erreicht.

Schaf-Lendenwirbelsäulen-Degenerationsmodell mit einer lateralen Retroperitoneal-Bohrer-Verletzung

Wir entwickelten ein Lumbar-Bandscheibendegeneration Maus-Modell durch Resektion von L3–L5 Spinnprozesse zusammen mit supra- und inter-spinous Bänder und Ablösung von paraspinous Muskeln.

Ein Mausmodell der Lumbar Spine Instability

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges experimentelles Modell der proinflammatorischen, degenerativen Rinderorgankultur vor, um die Bandscheibendegeneration im Frühstadium zu simulieren.

Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium.

Wir stellen eine Methode vor, um die räumliche Chondrozytenorganisation im Anulus fibrosus der Bandscheibe mit einer optischen Schnittmethode zu untersuchen.

Optische Schnittung und Visualisierung der Bandscheibe von der Embryonalentwicklung bis zur Degeneration

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Dieser Artikel und das dazugehörige Video präsentieren unser Protokoll zur Erzeugung von Tissue-Engineering-Darm der Maus, mit einem organoiden Einheiten-on-Gerüst Ansatz.

Tissue Engineering des Darms in einem Mausmodell

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Belichtungsverfahren von Zellkulturen zu inhalierenden toxischen Chemikalien zeigen. Exposition der differenzierten Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Kulturen von Epithelzellen der Luftwege bietet eine einzigartige Modell von Atemwegs Exposition gegenüber toxischen Gasen, wie Chlor. In dieser Handschrift beschreiben wir Wirkung von Chlor-Exposition auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzkulturen von Epithelzellen und Tauchkultur der Herzmuskelzellen.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Lernen Sie die Organ-Kulturmethode für murine Bandscheiben zur Untersuchung entzündlicher Reaktionen und Degenerationsmechanismen. Diese Technik ermöglicht die Erhaltung der nativen Anatomie und unterstützt die Arzneimittelforschung.

Ein

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