Overview
שחזור הוא תהליך של החזרת ביומולקול מבודד לצורה או לתפקוד המקורי שלו. זה שימושי במיוחד לחקר חלבוני ממברנה, המאפשרים תפקודים תאיים חשובים ומשפיעים על התנהגותם של שומנים סמוכים. כדי לחקור את הפונקציה של חלבוני ממברנה מטוהרים במקום, הם חייבים להיות מחדש על ידי שילובם לתוך קרום שומנים מלאכותי.
וידאו זה מציג מושגים ליקום חלבון ממברנה ונהלים נלווים, כגון בידוד חלבונים באמצעות חומר ניקוי, היווצרות שלשלות מלאכותיות באמצעות שומנים, שילוב של החלבון המבודד לתוך הזרם המלאכותי, והפרדת חומר הניקוי מהפתרון. לבסוף, שני יישומים מכוסים: שחזור של חלבוני הובלת ממברנה ושיקום חלבונים קצירת אור.
שחזור הוא תהליך של שחזור ביומולקול מבודד לצורה או לפונקציונליות המקורית שלו. גישה זו משמשת לעתים קרובות בעת לימוד חלבונים ממברנה, המאפשרים תהליכים תאיים חשובים רבים ומשפיעים על התנהגותם של שומנים שכנים. עם זאת, המורכבות של סביבת התא מקשה על פונקציות חלבון הממברנה במקום. החלבונים ניתן לחלץ ולטהר, אבל הפונקציות בפועל שלהם לא ניתן להעריך ללא ממברנה. לכן, חלבונים ממברנה מבודדים הם מחדש על ידי שילוב לתוך קרום שומנים מלאכותיים, כגון ליפוזום. וידאו זה יציג את העקרונות של שחזור חלבון ממברנה, הליך שיקום כללי, וכמה יישומים בביוכימיה.
קרום התא מורכב בעיקר פוספוליפידים וחלבוני ממברנה. הפוספוליפידים יוצרים דו-שכבתית שבה ראשי הפוספט ההידרופיליים מתקשרים עם הפנים והחיצוניות המ מימיות של התא, בעוד זנבות חומצת השומן ההידרופובית מתקשרים זה עם זה בשכבת הדו-שכבתית.
חלבונים מסוימים ממברנה אינטראקציה רק עם הממברנה על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות או לאcovalent. אחרים, הנקראים "חלבונים אינטגרליים", מוטבעים בשכבת השומנים.
כמו הדו-שכבתי, חלבונים אינטגרליים יש קצוות הידרופיליים ומרכז הידרופובי, והם מוחזקים במקום על ידי אינטראקציות הידרופוביות. חלבונים אינטגרליים המשתרעים על פני הממברנה כולה ידועים בשם 'חלבוני טרנס-מברן'.
האינטראקציות בין חלבונים אלה לבין הממברנה כל כך חזקות שאפילו ליסת התאים לא תפריד ביניהם. חומר פעילי שטח מיוחד הנקרא חומר ניקוי משמש לחילוץ החלבונים. בדומה לפוספוליפידים, לדטרגנטים יש ראשים הידרופיליים וזנבות ליפופיליים, והם יכולים להיכנס לממברנה בחופשיות.
בתוך הממברנה, הזנבות הליפופיליים של חומר הניקוי מתקשרים עם ליבת החלבון ההידרופובית. זה מקיף את החלבון עם קליפה של ראשי דטרגנט הידרופילי, אשר משבש את אינטראקציות חלבון שומנים.
קומפלקס החלבון-דטרגנט מופרד כעת בקלות מהקרום. חומר הניקוי הופך את המתחם למסיס בפתרונות מימיים, ומוכן לחזרה בקרום מלאכותי.
חלבונים הם לעתים קרובות reconsuted בממברנות של ליפוזומים, שהם שלל מלאכותי. כדי להכין ליפוזומים, שומנים מיובשים הם hydrated ונסער כדי לגרום היווצרות ארסיות. כאשר חומר ניקוי מתווסף, הוא משולב לתוך ממברנות ליפוזום.
כדי לשחזר את החלבון, חלבונים solubilized וליפוזומים משולבים, ולאחר מכן דטרגנט מוסר מן הפתרון על ידי דיאליזה או ספיחה כימית. החלבונים והליפוזומים מתאספים במהירות לפרוטוליפוזומים, כך שרק הקבוצות ההידרופיליות חשופות. החלבונים מתפקדים כפי שהם פועלים בקרום התא, וניתן לחקורם בבידוד.
עכשיו שכיסינו את היסודות של שחזור חלבונים, בואו נעבור על פרוטוקול לחזרת חלבוני הממברנה בליפוזומים.
כדי להתחיל לבודד את חלבוני הממברנה, התאים הם lysed. תאים לא שבורים מוסרים עם צנטריפוגה.
סופר-נט הוא צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר כדי כדורי הממברנות. הכדור מושעה מחדש ומתווסף חומר ניקוי כדי לחלץ את החלבונים.
שאר פסולת התאים מוסרת על-ידי צנטריפוגה נוספת. החלבון מטוהר מן supernatant עם כרומטוגרפיה עמודה ולאחר מכן מרוכז או מטוהר עוד יותר לפי הצורך.
כדי להתחיל להכין את הליפוזומים, השעיה של פוספוליפידים בממס אורגני מיובש תחת חנקן או ארגון.
הפוספוליפידים הם hydrated עם חוצץ הידרציה, ואת התערובת הוא sonicated כדי לסיים את יצירת ליפוזומים.
חומר ניקוי מתווסף solubilize ליפוזומים, אשר לאחר מכן משולב עם החלבונים.
חומר הניקוי מוסר לאחר מכן על-ידי ספיחה על חרוזי פוליסטירן, דיאליזה או עמודת כריכת חומר ניקוי. הפרוטאוליפוזומים המתקבלים מוכנים לטיהור ולהשתמש בהם בניסויים הבאים.
עכשיו שאתם מכירים את היסודות של הליך שחזור חלבונים ממברנה, בואו נסתכל על כמה יישומים של שחזור חלבונים בביוכימיה.
חלבון הובלת ממברנה הוקם מחדש כדי לקבל הבנה ברורה יותר של מנגנון ההובלה שלו. תפקידו לאחר שחזור אומת עם שפכים של יונים יוד. לאחר מכן, פעילות התחבורה נחקרה בנוכחות מעכבי ערוץ יונים מולקולות קטנות שונות ו potentiators. בדרך זו, ניתן ללמוד את האינטראקציות הישירות של מולקולות קטנות אלה עם חלבון התחבורה.
חלבוני ממברנה מחייבי כלורופיל וקרוטנואידים בצמחים קוצרים אור, מקדמים הפרדת מטען ומפחיתים נזקי אור. על ידי שחזור חלבונים אלה קצירת אור, הדינמיקה המתקפלת שלהם אינטראקציה עם פיגמנטים ניתן ללמוד. לחלבונים שצורפים אור שהוחזרו בטכניקה זו היו תכונות אופטיות דומות מאוד לחלבונים המקומיים. ספקטרוסקופיית פליטת פלואורסצנטיות יכולה לשמש לחקר העברת אנרגיה מפיגמנטים לחלבונים לקציר אור משוחזרים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על שחזור חלבוני הממברנה. שחזור הוא דרך להעביר חלבונים חשובים לחיקוי תאים להמשך חקירה. וידאו זה כיסה את העקרונות של שחזור חלבונים, פרוטוקול שחזור, וכמה יישומים בביוכימיה. תודה שצפיתם!
Procedure
שחזור הוא תהליך של החזרת ביומולקול מבודד לצורה או לתפקוד המקורי שלו. זה שימושי במיוחד לחקר חלבוני ממברנה, המאפשרים תפקודים תאיים חשובים ומשפיעים על התנהגותם של שומנים סמוכים. כדי לחקור את הפונקציה של חלבוני ממברנה מטוהרים במקום, הם חייבים להיות מחדש על ידי שילובם לתוך קרום שומנים מלאכותי.
וידאו זה מציג מושגים ליקום חלבון ממברנה ונהלים נלווים, כגון בידוד חלבונים באמצעות חומר ניקוי, היווצרות שלשלות מלאכותיות באמצעות שומנים, שילוב של החלבון המבודד לתוך הזרם המלאכותי, והפרדת חומר הניקוי מהפתרון. לבסוף, שני יישומים מכוסים: שחזור של חלבוני הובלת ממברנה ושיקום חלבונים קצירת אור.
שחזור הוא תהליך של שחזור ביומולקול מבודד לצורה או לפונקציונליות המקורית שלו. גישה זו משמשת לעתים קרובות בעת לימוד חלבונים ממברנה, המאפשרים תהליכים תאיים חשובים רבים ומשפיעים על התנהגותם של שומנים שכנים. עם זאת, המורכבות של סביבת התא מקשה על פונקציות חלבון הממברנה במקום. החלבונים ניתן לחלץ ולטהר, אבל הפונקציות בפועל שלהם לא ניתן להעריך ללא ממברנה. לכן, חלבונים ממברנה מבודדים הם מחדש על ידי שילוב לתוך קרום שומנים מלאכותיים, כגון ליפוזום. וידאו זה יציג את העקרונות של שחזור חלבון ממברנה, הליך שיקום כללי, וכמה יישומים בביוכימיה.
קרום התא מורכב בעיקר פוספוליפידים וחלבוני ממברנה. הפוספוליפידים יוצרים דו-שכבתית שבה ראשי הפוספט ההידרופיליים מתקשרים עם הפנים והחיצוניות המ מימיות של התא, בעוד זנבות חומצת השומן ההידרופובית מתקשרים זה עם זה בשכבת הדו-שכבתית.
חלבונים מסוימים ממברנה אינטראקציה רק עם הממברנה על ידי אינטראקציות אלקטרוסטטיות או לאcovalent. אחרים, הנקראים "חלבונים אינטגרליים", מוטבעים בשכבת השומנים.
כמו הדו-שכבתי, חלבונים אינטגרליים יש קצוות הידרופיליים ומרכז הידרופובי, והם מוחזקים במקום על ידי אינטראקציות הידרופוביות. חלבונים אינטגרליים המשתרעים על פני הממברנה כולה ידועים בשם 'חלבוני טרנס-מברן'.
האינטראקציות בין חלבונים אלה לבין הממברנה כל כך חזקות שאפילו ליסת התאים לא תפריד ביניהם. חומר פעילי שטח מיוחד הנקרא חומר ניקוי משמש לחילוץ החלבונים. בדומה לפוספוליפידים, לדטרגנטים יש ראשים הידרופיליים וזנבות ליפופיליים, והם יכולים להיכנס לממברנה בחופשיות.
בתוך הממברנה, הזנבות הליפופיליים של חומר הניקוי מתקשרים עם ליבת החלבון ההידרופובית. זה מקיף את החלבון עם קליפה של ראשי דטרגנט הידרופילי, אשר משבש את אינטראקציות חלבון שומנים.
קומפלקס החלבון-דטרגנט מופרד כעת בקלות מהקרום. חומר הניקוי הופך את המתחם למסיס בפתרונות מימיים, ומוכן לחזרה בקרום מלאכותי.
חלבונים הם לעתים קרובות reconsuted בממברנות של ליפוזומים, שהם שלל מלאכותי. כדי להכין ליפוזומים, שומנים מיובשים הם hydrated ונסער כדי לגרום היווצרות ארסיות. כאשר חומר ניקוי מתווסף, הוא משולב לתוך ממברנות ליפוזום.
כדי לשחזר את החלבון, חלבונים solubilized וליפוזומים משולבים, ולאחר מכן דטרגנט מוסר מן הפתרון על ידי דיאליזה או ספיחה כימית. החלבונים והליפוזומים מתאספים במהירות לפרוטוליפוזומים, כך שרק הקבוצות ההידרופיליות חשופות. החלבונים מתפקדים כפי שהם פועלים בקרום התא, וניתן לחקורם בבידוד.
עכשיו שכיסינו את היסודות של שחזור חלבונים, בואו נעבור על פרוטוקול לחזרת חלבוני הממברנה בליפוזומים.
כדי להתחיל לבודד את חלבוני הממברנה, התאים הם lysed. תאים לא שבורים מוסרים עם צנטריפוגה.
סופר-נט הוא צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר כדי כדורי הממברנות. הכדור מושעה מחדש ומתווסף חומר ניקוי כדי לחלץ את החלבונים.
שאר פסולת התאים מוסרת על-ידי צנטריפוגה נוספת. החלבון מטוהר מן supernatant עם כרומטוגרפיה עמודה ולאחר מכן מרוכז או מטוהר עוד יותר לפי הצורך.
כדי להתחיל להכין את הליפוזומים, השעיה של פוספוליפידים בממס אורגני מיובש תחת חנקן או ארגון.
הפוספוליפידים הם hydrated עם חוצץ הידרציה, ואת התערובת הוא sonicated כדי לסיים את יצירת ליפוזומים.
חומר ניקוי מתווסף solubilize ליפוזומים, אשר לאחר מכן משולב עם החלבונים.
חומר הניקוי מוסר לאחר מכן על-ידי ספיחה על חרוזי פוליסטירן, דיאליזה או עמודת כריכת חומר ניקוי. הפרוטאוליפוזומים המתקבלים מוכנים לטיהור ולהשתמש בהם בניסויים הבאים.
עכשיו שאתם מכירים את היסודות של הליך שחזור חלבונים ממברנה, בואו נסתכל על כמה יישומים של שחזור חלבונים בביוכימיה.
חלבון הובלת ממברנה הוקם מחדש כדי לקבל הבנה ברורה יותר של מנגנון ההובלה שלו. תפקידו לאחר שחזור אומת עם שפכים של יונים יוד. לאחר מכן, פעילות התחבורה נחקרה בנוכחות מעכבי ערוץ יונים מולקולות קטנות שונות ו potentiators. בדרך זו, ניתן ללמוד את האינטראקציות הישירות של מולקולות קטנות אלה עם חלבון התחבורה.
חלבוני ממברנה מחייבי כלורופיל וקרוטנואידים בצמחים קוצרים אור, מקדמים הפרדת מטען ומפחיתים נזקי אור. על ידי שחזור חלבונים אלה קצירת אור, הדינמיקה המתקפלת שלהם אינטראקציה עם פיגמנטים ניתן ללמוד. לחלבונים שצורפים אור שהוחזרו בטכניקה זו היו תכונות אופטיות דומות מאוד לחלבונים המקומיים. ספקטרוסקופיית פליטת פלואורסצנטיות יכולה לשמש לחקר העברת אנרגיה מפיגמנטים לחלבונים לקציר אור משוחזרים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על שחזור חלבוני הממברנה. שחזור הוא דרך להעביר חלבונים חשובים לחיקוי תאים להמשך חקירה. וידאו זה כיסה את העקרונות של שחזור חלבונים, פרוטוקול שחזור, וכמה יישומים בביוכימיה. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
