Name: Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Öğrenin, bitki yaprak dokusundan sağlam guard hücreleri izole etme ve zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, fizyolojik ve biyokimyasal analizler için yüksek kaliteli örnekler hazırlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Daniel Chen üzerinden Dijital Video üretim ekibi, Buchholz lise video düzenleme konusunda yardım almak için teşekkür ederiz. Bu araştırma stomatal gardiyan hücreleri, proteomik ve metabolomics Chen laboratuarında hibe bize Ulusal Bilim Vakfı (0818051, 1158000 ve 1412547) tarafından desteklenmiştir. Wenwen Kong Çin burs Konseyi tarafından desteklenir. Dr. Qiuying Pang Çin burs Konseyi ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31570396) tarafından desteklenmektedir.

1. bitki yetiştirme
<ol><li>Karışımı çömlekçilik içinde tohum çimlenme. Bitkilerde büyüme odası ile 140 µmol fotonlar m−2 s – 1 ışık yoğunluğu ve bir photoperiod 8 h ışık 22 ° C ve 16 h 18 ° C'de 2 hafta boyunca karardığını.</li>
	<li>Fidan benzer boyutlarda tek tek toprak içeren 4" çapında tencere nakli ve ek 3 hafta aynı koşullarda 1.1. adımda açıklanan için büyür. Not: musluk suyu ile bitkilerin toprak nemli tutmak için haftada iki kez su.</li>
</ol>2. zenginleştirilmiş stoma bantlı hazırlanması
<ol><li>Bir neşter ile bireysel 5 - hafta eski A. thaliana bitkilerin yaprakları çıkarın.</li>
	<li>Her yaprak açık kapaklar, iki adet abaxial (alt) tarafına kalarak tek parça ve yaprak adaxial (üst) tarafına kalarak diğer parça ile ekleyin. Yaprak 5 için teybi çıkarma s.</li>
	<li>Kabuğu ayrı kasetleri işaret parmağı ve başparmak her yandan abaxial yan kaldırım ve nöbetçi hücreleri ve mesophyll hücreleri adaxial tarafını ile ayırarak iki adet hafif.</li>
	<li>Toplanan oldukları gibi açılış stoma bantlı 60 mL yapraklarında abaxial tarafındaki kabukları (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2 1 M KOH ile düzeltilmiş) 40 mm × 12 mm boyutunda Petri arabellek yer yemekleri.<ol>
<li>Tüm örnek kabukları toplanan kadar yukarıdaki adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.1. adımda belirtilen ışık koşulları altında büyüme odasına kabukları içeren Petri yemekler yerleştirin. Kabukları tam stoma bantlı açık 2 h için ışık altında bırakın.</li>
	<li>150 mm x 20 mm Petri kabına hücre duvarı enzim karışımı (%0,7 cellulase R-10% 0,025 macerozyme R-10, % 0,1 (w/v) polyvinylpyrrolidone-40 ve % 0.25 (w/v) Sığır serum albümin % 55 temel çözüm (0.55 M sorbitol, 0,5 mM sindirerek 50 mL içeren içine yer kabuğu CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM askorbik asit, 10 µM KH2PO4, pH 5.7 5 mM 4-morpholineethanesulfonic asit (MES) 1 M KOH ile ayarlanır).</li>
	<li>Kabukları bir petri 50 devirde karşılıklı bir shaker 20 dk için salla.</li>
	<li>50 mL su içeren 150 x 20 mm boyut Petri kabına için kabukları 20 dk. aktardıktan sonra kabukları cımbızla enzim çözümden kaldırmak.</li>
	<li>Bir aktarım pipet kullanarak, durulama kabukları 15 10 mL su herhangi bir kalıntı enzim çözümü kaldırmak için bir iki kez iyimsersin.</li>
	<li>150 x 20 mm boyut Petri kabına 50 mL taze stoma bantlı 2.4 adımda kullanılan arabellek açılış ile kabukları yerleştirmek için cımbız kullanın. 1.1-e doğru kurtarmak stoma bantlı izin adımda belirtilen ışık koşullarında 1 h için kuluçkaya.</li>
</ol>3. Absisik asit (ABA) tedavi ve stoma bantlı hareket tahlil
<ol><li>Bir 150 x 20 mm boyut kabında. 30 ° c 15 dk 50 mL stomatal açılış arabellek veya stomatal açılış arabellek 50 mL 10 µM ABA son bir konsantrasyon için uygun tedavi süresi ile zenginleştirilmiş stoma bantlı kabukları kuluçkaya.</li>
	<li>Kabukları 5, 15 ve 30 dk 50 rpm bir shaker yerleştirin. Her zaman aralığından sonra cımbızla bir kabuğu kaldırmak ve adım 3.3 görüntüleme adımları izleyin.</li>
	<li>Görüntü stoma bantlı ABA tedavi öncesi ve çeşitli zaman noktalarda ABA tedaviden sonra hafif bir mikroskopla alabilir.<ol>
<li>Bir kabuğu almak ve cam mikroskop slaytta yerleştirin.</li>
		<li>Slayt mikroskop sahnesinde yerini ve kabuğu görüntüsü görüntülenir sahne ayarlayın.</li>
		<li>İnce ayarlamak ve muhafız hücre net bir görüntü elde etmek için mikroskop odak ders.</li>
		<li>Birden çok stoma bantlı birkaç görüntü 40 X büyütme oranında alabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 stomatal diyafram ImageJ8kullanarak ölçmek.</li>
	<li>Standart hata ve önemi, bir p-değeri < 0,05 60 stomatal diyafram ölçüm hesaplayın.</li>
</ol>4. protein çıkarma ve SDS-sayfa ayırma
<ol><li>15 kabukları eziyet bir soğutulmuş harç ve havaneli kullanarak kabukları karşılamak için yeterli sıvı azot s.</li>
	<li>50 kabukları 3 mL doymuş Tris fenol (pH 8.8) ekleyin ve 3 mL protein ayıklama tampon (0.9 M sukroz, 0.1 M Tris-HCl, 0.01 M EDTA, %0,4 2-Mercaptoethanol, 1 mM fosfataz ve proteaz inhibitörü 10 µL) harç için bir pipet ile ve sonra kabukları 5 kenan için eziyet bir duman hood dakikada varmıdır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak özü aktarmak ve bir Oakridge için metal Cımbız kullanarak kabukları tüp santrifüj kapasitesi ve 50 rpm bir shaker 4 ° C'de 1 h için kışkırtmak</li>
	<li>Kabukları Oakridge santrifüj tüpü çıkarması ve 5000 x g 10 dk de özü santrifüj kapasitesi. Ardından üst bakalit faz bir pipet kullanarak yeni bir temiz mikro santrifüj tüpü aktarın.</li>
	<li>Çökelti fenol proteinlerin % 100 metanol içinde buz gibi 0.1 M amonyum asetat 5 cilt ekleyerek ayıklanır. Kısaca girdap ve gecede-20 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>20.000 x g 20 dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi, yavaş yavaş dışarı tüp dökerek süpernatant dikkatle boşaltmak ve tüp içinde protein Pelet korumak.</li>
	<li>Protein Pelet 0.1 M amonyum asetat ile iki kere metanol içinde yıkayın ve sonra % 80 aseton ile iki kez ve bir kez % 100 soğuk aseton ile. Not: 10 mL belirtilen reaktif protein tüp ekleyerek yıkama yapılır. Bir shaker 50 RPM Santrifüjü 15.000 x g 10 dk 4 ° C'de, ardından 5 min için tahrik. Sonra sadece protein Pelet istinat tüp dışında reaktif dökün.</li>
	<li>1 mL % 100 soğuk aseton için Pelet ekleyin ve yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipetting tarafından yeniden askıya alma.</li>
	<li>Protein süspansiyon pipet ile 2 mL mikro-santrifüj tüpü daha sonra 20.000 x g 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Aseton tüpünden decanting tarafından kaldırmak ve Pelet duman başlıklı 10 min için kuru.</li>
	<li>Çözünme arabelleği (8 M üre, % 0.5 SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) 200 µL bir mikro-santrifüj tüpü protein geçiyoruz ve için 30 dk santrifüj 20.000 x g 20 dk ve toplamak yeni bir tüp süpernatant için 15 ° C'de, girdap.</li>
	<li>Protein miktar Protokolü9takip protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
	<li>Protein örnekleri10protokolü takip jel elektroforez tarafından protein ayrılması için kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Gardiyan hücreleri sinyal iletim mekanizmaları tesislerinde çalışmak için bir model sistem ve çalışmada kullanılan örnekleri hazırlanması Biyolojik sorulara cevap için en uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Gardiyan hücreleri bitki araştırma topluluğu içinde artan ilgi rağmen nasıl stomatal hareketi ve Fizyoloji sağlayacak stomatal gardiyan hücreleri hazırlamak için evrensel bir yöntem yoktur işte birinde incelenecektir için moleküler değişikliklerinin yanı sıra sistem. Onları ayırmak için sorun büyük ölçüde onların k...

Stoma bantlı Genel Fizyoloji ve fitness bitkilerin önemli bir rol oynamaktadır. Bu küçük bitki belirli yapılara guard hücreler olarak bilinen iki özel epidermal hücre tarafından kurulur ve en bol yaprakları abaxial yüzeyinde bulunur. Stoma bantlı gazlar terleme ile su kaybı kontrolünü yanı sıra bitki ve atmosfer arasındaki alışverişi için gereklidir. Gardiyan hücreleri düzenleyen stoma bantlı diyafram farklı dış (Örneğin, ışık, nem, patojen iletişim, karbondioksit düzeyleri) tümleştirme yoluyla ve iç (Örn., endojen hormonlar) uyaranlara1,2. Son 20 yıl içinde bu hücre tipi eğitim hücre süreçleri bitkilerde sinyal için bir model sistemi haline gelmiştir. Bu hücreler bir yaprak toplam hücrelerde küçük bir kısmını oluşturur; Böylece, kendi benzersiz cep araştırmak için biyokimyasal ve moleküler özelliklerini bir tek hücreli şekilde bu diğer yaprak hücre türlerinden yalıtmak gereklidir. Geçmişte, guard hücre çalışmaları bu hazırlık guard hücre önceki (GCP)3,4,5kez işe. Bu genellikle hücre duvarı aşağılayıcı enzimler ve/veya karıştırma ile mekanik kesintileri büyük miktarda kullanımı gerektirir ve genellikle GCP örnek kez hazırlamak için saatlerce sürer gibi pahalı ve zaman alıcı olması ile küçük verim kez kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, çünkü gardiyan hücreleri stoma bantlı diyafram düzenleyen tam çiftleri olarak hareket, GCP kullanımı guard hücre sinyallemesi eğitimi için yapay bir sistem olarak görülebilir.
Burada, sağlam koruma hücreleri zenginleştirilmiş ve fizyolojik yanıt uyaranlara karşı korumak stoma bantlı hazırlamak için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem mesophyll hücre önceki6,7ayırmak için kullanılan bir yöntem tarafından ilham kaynağı oldu. Bizim Yöntem, stoma bantlı ilk mesophyll hücreleri çoğunluğu ayırmak için bant kaldırım ve nöbetçi hücreleri içeren abaxial katmandan yaprak adaxial katmana bağlı NET kullanılarak hazırlanır. Bu bant yaprak her tarafına bir parçası yapıştırılması ve onları ayrı peeling yapılır. Abaxial katman hücrelerden stoma bantlı-açılış arabellekte ışık altında kurtarmak için izin verilir. Daha sonra kalan kaldırım hücreleri hücre duvarı enzimler, kasette zenginleştirilmiş guard hücre bırakarak aşağılayıcı küçük bir miktar kullanarak kaldırılır.
Basit bu yöntemde, uygun ve duyarlı stomatal gardiyan hücreleri hızlı ve verimli bir şekilde 50 kabukları minimum maliyet ile zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri almak için bir saat almaya hazır olun. İşte Yöntem bitki hücreleri için önceki nerede hazırlanan önceki yöntemlerine göre daha az zarar getirir. Buna ek olarak, malzeme bu yöntem verim arzu protein tutarlardan toplanan. En önemlisi, yaprak karıştırma için tabi tutulur değil veya uzun Sindirim süreleri ve nöbetçi hücreleri korunacak çünkü, çalışmaların sonuçları daha yakından bir muhafız hücrenin doğal biyoloji ilgili olacak. Bu yöntemle, stomatal hareketleri gerçek zamanlı olarak moleküler seviyede değişikliklerle ilişkili olabilir. Böylece, bu hazırlık yöntemi kullanarak çalışmalardan elde bilgi koruma hücre sinyallemesi daha kapsamlı bir anlayış için önemli olacaktır.
Bitki Arabidopsis thaliana bir model olarak kullanılan; Ancak bu iletişim kuralı stomatal guard hücrelerinde diğer bitki türleri Brassica napus gibi küçük değişiklikler ile zenginleştirme sindirim zaman uygulanabilir. Kavramının bir kanıtı olarak stomatal gardiyan hücreleri bu yöntemle zenginleştirilmiş uygun ve floresein diacetate (FDA) tahlil ve bitki hormon Absisik asit (ABA), sırasıyla kullanan çalışmalar tarafından gösterildiği gibi uyaranlara karşı duyarlı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, yüksek kaliteli protein bu bekçi hücrelerden ayrılmış olabilir göstermiştir. Burada, bu sürecin detaylı bir protokol açıklayın.

<table><tbody><tr><td>Paslanmaz Çelik Cerrahi Neşter</td><td>Tüyü&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Bant (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult İlaç Sanayi A.Ş.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Makrozyme R-10</td><td>Yakult İlaç Sanayi A.Ş.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteylleri</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge Yüksek Hızlı PPCO Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein Kantitasyon Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Floresein Diasetat (FDA)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Absisik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Şirketleri&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-Güvenli Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpü (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>Cımbız&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>%12 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stoma bantlı teyp-kabuğu: guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Gardiyan hücreleri belirli katkıları bitkilerin genel işlevi için bu hücre tür bilgi için önemli bir çalışmadır. Ancak, genellikle izole etmek zordur ve böylece kez üstlerinde bir meydan okuma sağlar.
Bu çalışmada stomatal guard hücre zenginleştirme yöntemi oluşturur. Protokol bant koruma hücreleri izole ve proteinler hücrelerden ayıklamak için kullanır. Bu yöntem sırasında yalıtım bütünlüğü ve muhafız hücre verimini artırır ve hücre sinyal gönderme süreçleri ve nasıl onlar için stomatal hareketi fenotipleri ilişkilendirmek için güvenilir bir örnek sağlar. Bu yöntemde, bitki yaprakları teyp iki bölümleri arasında bölümlenmiş ve ayrı abaxial yan kaldırmak için soyulmuş. Bu iletişim kuralı Arabidopsis yaprak dokusu ile nöbetçi hücreleri izole etmek için uygulandı. Hücreleri Absisik asit (ABA) stoma bantlı hareketi yanıt ABA olarak değerlendirmek için ile floresein diacetate canlılığı belirlemek için (FDA) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, bu iletişim kuralını zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama ve protein izole için yararlı olmaktadır. Hücreleri ve protein kalitesini burada etkinleştir fizyolojik ve biyolojik diğer çalışmalar elde.

Bir temsili resim Arabidopsis guard hücre önce ve sonra sindirim mesophyll ve epidermal hücre Şekil 1' de gösterilen. Guard hücre canlılığı önce ve sonra mesophyll ve epidermal hücrelerin enzimatik aktivite ve hücre zarının bütünlüğü (Şekil 1B ve 1 D) ölçmek için FDA kullanarak görülebilmektedir. Şekil 2 Arabidopsis stomatal hareketi yanıt ABA tedavi olarak gösterilmektedir. Stomatal...

Bu iletişim kuralı fizyolojik ve diğer biyolojik araştırmaları için yararlıdır zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama yöntemi açıklanır.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Bu deneyin genel amacı, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler analizler için yüksek kaliteli zenginleştirilmiş stoma koruyucu hücreleri hazırlamaktır. Merhaba, benim adım Sheldon Lawrence. Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nde Dr. Chen'in laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim.Bugün size, stomaların hem fizyolojisini hem de biyolojisini incelemek için yararlı bir materyal olan bitki yaprak dokusundan koruyucu hücrelerin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bu yöntem, koruyucu hücreleri izole etmek için yeni bir yöntem olarak kabul edilir. Özellikle sağlam koruyucu hücrelerin zenginleştirilmesine izin verir ve stoma hücresi sinyalleme süreçlerinin incelenmesi için güvenilir numuneler sağlar.Bu yöntemin uygulanması, protokolde sadece küçük bir değişiklikle Brassicaceae bitkilerine ve diğer bitki türlerine kadar uzanabilir. Gösteri önemlidir, çünkü koruma hücrelerini zenginleştirmek için ana adım zor olabilir. Başlamak için olgun, beş haftalık Arabidopsis bitkilerini seçin.Bir yaprağı neşterle dikkatlice çıkarın, yaprağı tabanda kesin. İki parça bant alın ve eksize edilen yaprağı aralarına yerleştirin. Bant parçalarının ucunun yapışmadığından emin olurken her iki tarafa da nazikçe baskı uygulayın.Bu, aralarına bir parmak sokarak yapılabilir. İki bant parçasını nazikçe birbirinden ayırın ve yaprağın abaksiyal tarafından alınan kabuğu hemen stoma açma tamponuna kaydırın. Tüm kabuklar toplandıktan sonra ışık altına koyun.Onları iki saat orada bırakın. Birkaç kabuk alın ve bunları mikroskop slaytlarına yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, koruyucu hücreleri görmek için lensleri ayarlayın ve açık olduklarından emin olun.Kabukları 50 ml hücre duvarı sindirim enzimi çözeltisine yerleştirin. Onları 26 santigrat derecede yüzdürün ve inkübe edin. 20 dakika sonra, kabukları enzim çözeltisinden çıkarın ve deiyonize su ile iki kez kısa bir süre durulayın ve taze stoma açma tamponuna koyun.Kabukları bir havanda sıvı azot ile bir havanda öğütün, bir havaneli ile. Ardından metinde anlatıldığı gibi fenol ekstraksiyonu gerçekleştirin. Kabukları havanda öğüttükten sonra, özü kabuklarla birlikte bir Oak Ridge santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.% 100 metanol içinde beş hacim buz gibi soğuk 0.1 mol amonyum asetat ekleyerek fenol ekstrakte edilen proteinleri çökeltin. Proteini gece boyunca 20 santigrat derecede çökelttikten sonra, proteini santrifüjleme ile hasat edin ve metinde açıklandığı gibi pelet yıkamaları yapın. Peleti bir mililitre soğuk aseton içinde yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Santrifüjlemeden sonra, aseton süpernatantını atın ve peleti on dakika kurutun. Protein örneğini bir çözünme tamponu içinde çözün. Vorteks ve santrifüjlemeden sonra, süpernatanı toplayın ve protein konsantrasyonunu ölçün.Bir SDS-PAGE jeli çalıştırın. Ayrı protein bantlarını görselleştirin ve nispi protein kalitesini gözlemleyin. Bu, mezofil ve epidermal hücrelerin enzim sindiriminden önce ve sonra Arabidopsis koruyucu hücrelerinin temsili bir görüntüsüdür.Mezofil ve epidermal hücrelerin çıkarılmasından önce ve sonra koruyucu hücre canlılığı, enzimatik aktiviteyi ve hücre zarı bütünlüğünü ölçen floresein diasetat kullanılarak gözlemlenebilir. Gördüğünüz gibi, koruyucu hücreler soyulma ve enzim sindiriminden sonra hala canlı. Bu örnek, ABA tedavisine yanıt olarak Arabidopsis'in stoma hareketini göstermektedir.Koruyucu hücreler tedaviye yanıt verir ve ABA ile 30 dakikalık tedaviden sonra stoma açıklığı %50'den fazla azalır. İşte stoma hareketinin bir zaman seyri. Ek olarak, her zaman noktasında stoma açıklığının temsili bir görüntüsü gösterilir.Protein tespiti, ayrılması ve nispi bolluk SDS-PAGE tarafından gözlemlenir. Bantlar açık ve belirgindir. Bu yöntemden protein ekstraksiyonunun tekrarlanabilirliğini vurgulamak için dört biyolojik kopya dahil edilmiştir.Bu yöntem için ilk olarak, koruyucu hücre moleküler değişikliklerini gerçek zamanlı olarak stoma hareketi ile ilişkilendirmeye çalıştığımızda aklımıza geldi. Bir kez ustalaştıktan sonra, stoma koruyucu hücrelerden bir protein örneği birkaç saat içinde hazırlanabilir ve birden fazla deneyde kullanılabilir. Soyma ve kullanım sırasında koruyucu hücrelere büyük miktarda zarar vermemeyi unutmamak önemlidir.Bu yöntemi takiben, normal ve stres koşullarında bitkilerdeki proteinlerin redux tepkisini incelemek için izobarik etiketleme gibi koruyucu hücre sinyalizasyonunu araştırmak için başka teknikler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sağlam ve canlı koruyucu hücrelerin nasıl izole edileceğini ve zenginleştirileceğini ve ayrıca aşağı akış çalışmaları için uygun yüksek kaliteli proteinin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Biz canlı bakteri stoma yanıt erişmek için basit ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem daha önce bildirdiği epidermal peeling kullanımı ile karşılaştırıldığında yaprak yaralama ve manipülasyona en aza indirir.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Bu makalede, tropik yanıtı sırasında plasmodesmal geçirgenliği ve oksin gradyanı kontrol eden genlerin taranması için yöntemler açıklanmaktadır. Bu hipokotil içinde tropik yanıtın derecesi ölçümü içerir   Arabidopsis thaliana ve 8-hydroxypyrene-1,3,6-trifülfonik asit (HPTS) yükleme ve nihayet kaloz seviye değerlendirme ile plasmodesmal geçirgenliği kontrol edilmesi.

Bir Strateji Tropic Tepkisi kaloz aracılı Plasmodesmal Gating Rolü doğrulamak için

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Bu iletişim kuralının amacı Arabidopsis thaliana fidan cotyledons içindeki kümelenmiş stoma bantlı daldırma tedavi şeker içeren orta solüsyonu tarafından teşvik ve kloroplast gibi hücre içi yapılar dikkat göstermektir ve confocal kullanarak kümelenmiş guard hücrelerdeki mikrotübüller mikroskobu lazer.

Kümelenmiş stoma bantlı şeker çözüm daldırma tedavisinde Arabidopsis thaliana fidan tarafından için bir indüksiyon sistemi

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bu protokol, epidermal peeling, temizleme teknikleri ve yapay zeka destekli görüntü analizi kullanarak iki farklı türde stoma ve epidermal özellikleri değerlendirmek için karşılaştırmalı bir yöntem sunmaktadır. Amaç, tarımsal uygulamalar ve geniş bitki araştırmaları için stoma fonksiyonunun altında yatan hücresel yapıların yüksek verimlilik, tekrarlanabilir niceliklendirilmesini sağlamaktır.

Stomatal ve Epidermal Özelliklerin Peeling, Clearing ve AI Tabanlı Görüntü Analizi Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Öğrenin, bitki yaprak dokusundan sağlam guard hücreleri izole etme ve zenginleştirme yöntemini. Bu protokol, fizyolojik ve biyokimyasal analizler için yüksek kaliteli örnekler hazırlar.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

Daha fazla video keşfet