Name: 蝙蝠组织收集 -细胞分析和原细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 学习蝙蝠组织采集与人道捕获方法，用于基因组学、转录组学和蛋白质组学研究。该方案通过非致死性采样获取脑、心脏、肝脏等多种组织，并利用RNA稳定液保存样本，同时建立原代成纤维细胞培养体系，为蝙蝠生态学与分子生物学研究提供可再生的遗传材料资源。

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我们感谢秘鲁的生物多样性和生态中心（Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO）、Erika Paliza、Miluska Sánchez、Jorge Carrera、Edgar Rengifo Vásquez、Harold Porocarrero Zarria、Jorge Ruíz Leveau、Jaime Pecheco Castillo、Carlos Tello、Fanny Cornejo 以及 Fanny Fernández Melo，他们使在秘鲁开展组织采集成为可能。在哥伦比亚，我们感谢 Colciencias 和亚历山大·冯·洪堡生物资源研究所（Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt），以及 Alexandra Buitrago、Mailyn González、Andrés Julián Lozano Florez、Darwin M. Morales Martinez、Ana Maria Ospina、Adrian Pinzon、Paola Pulido-Santacruz 和 Danny Rojas，他们在后勤、旅行、蝙蝠捕获和拍摄方面提供了支持。我们还感谢多米尼加共和国的 Grupo Jaragua 全体成员和 Yolanda León，使在该国开展组织采集成为可能；同时感谢哥斯达黎加 La Selva 生物研究站的 Bernal Rodriguez Hernandez、Bernal Matarrita 及所有工作人员，使样本采集得以实现；并感谢 Kasia Sawicka 在出行前协助准备实验操作和试剂。我们感谢 Ella Lattenkamp &amp;#38; Lutz Wiegrebe 提供 Phyllostomus discolor 蝙蝠的翼部穿孔样本，用于原代细胞培养。Phyllostomus discolor 蝙蝠源自慕尼黑路德维希-马克西米利安大学（Ludwig-Maximilians-University）生物系 II 的繁殖种群。饲养和繁殖蝙蝠的许可由慕尼黑地区兽医办公室批准。LMD、SJR、KTJD 和 LRY 的研究由美国国家科学基金会（NSF-DEB 1442142）资助。LMD 还获得 NSF-DEB 1838273 资助。LRY 获得 NSF-PRFB 1812035 资助。SCV 和 PD 获得马克斯·普朗克研究小组奖以及人类前沿科学计划（HFSP）研究资助（RGP0058/2016）的支持。SJR、JHTP 和 KTJD 的研究由欧洲研究理事会（ERC）授予 SJR 的启动基金（ERC Starting grant 310482 [EVOGENO]）资助。ECT 获得欧洲研究理事会资助（ERC-2012-StG311000）支持。

本文所述所有方法均已获得纽约州立大学石溪分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号：2013-2034-NF-4.15.16-BAT、2014-2090-NF-1.20.17-Bat、2014-2119-NF-Bat - 6.16.17 和 2018-NF-11.12.19-Bat）。
1. 安乐死
<ol>
	<li>用异氟烷麻醉剂或其他可用的麻醉剂浸湿一个棉球。</li>
	<li>将棉球放入可密封的密闭塑料袋中。该塑料袋应足够大，以便舒适地容纳一个装有蝙蝠的布质蝙蝠袋。</li>
	<li>等待数分钟使麻醉气体充分扩散至袋内后，将装有蝙蝠的蝙蝠袋放入该塑料袋中。</li>
	<li>再等待数分钟，直至蝙蝠被安乐死。体重约 20 g 或更轻的蝙蝠通常需要 5–10 分钟；更大的蝙蝠可能需要长达 20 分钟。请注意，所需时间也可能取决于蝙蝠袋材料的通透性，建议使用尽可能薄的布料以最大化麻醉剂的扩散效率。</li>
	<li>在开始解剖前，检查蝙蝠的呼吸和心跳，以确认其已死亡。</li>
</ol>
2. 解剖准备
<ol>
	<li>每次解剖之间均需按照以下步骤清洁所有器械。</li>
	<li>先用清水和洗洁精清洗器械，然后在远离解剖区域的位置用10%次氯酸钠擦拭，避免次氯酸钠降解核酸。</li>
	<li>再用70%乙醇擦拭。</li>
	<li>接着用RNA酶去污染试剂擦拭。</li>
	<li>每次解剖后均需重复上述步骤。</li>
</ol>
3. 准备组织样本的样品瓶
<ol>
	<li>用于RNA：
	<ol>
		<li>在开始任何解剖操作之前，预先准备好所有离心管，以避免延误。</li>
		<li>为每个样本预留所需数量的离心管。在每根管子上标记将要采集的组织类型，以及标准的样本标识信息。向管中加入RNA稳定液至50%满，并最好预冷至4 °C。</li>
		<li>注意不要将离心管完全充满RNA稳定液，否则在放入液氮（LN2）时可能导致管子爆裂。取样时需注意，大块组织无法被RNA稳定液充分渗透。因此，应将组织切成单边尺寸不超过0.5 cm的小块，并保持RNA稳定液与组织的体积比至少为10:1。</li>
		<li>最低要求是，解剖所得的组织必须置于RNA稳定液中保存，即使无法获得液氮或低温储存条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于DNA： 
	注意：几乎所有组织的核DNA含量均相同，因此取样具有较大灵活性。但需注意，肌肉组织中线粒体密度较高，可能导致核基因组测序读长减少38。
	<ol>
		<li>对于低分子量DNA，可取翼膜的一个或多个重复样本用于硅胶干燥保存，和/或取肌肉组织用于RNA稳定液或组织稳定液中保存。</li>
		<li>对于超长HMW DNA，应直接在液氮（LN2）中速冻，不使用任何保存试剂，随后转移至-80 °C或更低温度进行长期保存。在颅部解剖中，脑组织是最适合获取超长HMW DNA的组织类型39；而在颅后解剖中，肝脏或肌肉组织更为合适40。</li>
		<li>进行颅部解剖时，部分组织应使用5 mL离心管（而非标准的2 mL管）盛装RNA稳定液。所有离心管均应为耐冻型。解剖过程中应将离心管置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于RNA的颅骨解剖
<ol>
	<li>安乐死后立即使用大剪刀或骨剪将标本断头（图3）。</li>
	<li>用镊子用力摘除眼球，确保视神经被完全分离。将眼球放入装有2 mL RNA稳定液的离心管中。</li>
	<li>使用合适的工具去除颅骨上的毛发、筋膜和颅骨肌肉，包括鼻部皮肤。注意不要破坏鼻部前端。</li>
	<li>用剪刀从颈部开始，在颅骨腹侧进行矢状切口（图3），注意不要损伤脑组织。</li>
	<li>用镊子轻轻向两侧掀开颅骨，直至颅骨裂开并暴露脑组织。</li>
	<li>在颅骨尾端，耳蜗现在应可在头部两侧横向可见。它们是位于左右两侧、紧邻颈部前方和咬肌后方的小型球形骨结构。用镊子轻轻取出耳蜗，并放入一个装有2 mL RNA稳定液的离心管中。</li>
	<li>用镊子轻轻刮取脑组织（脑组织非常柔软），嗅球将随之显露，位于颅骨内部腹侧区域。尽量保持嗅球完整附着。</li>
	<li>若嗅球尚未被移除，可轻轻刮除周围组织，筛板将逐渐显现。筛板是帮助研究者定位方向的关键骨骼结构，可识别为颅骨最前部具有多个孔道的区域，以及嗅球所处的两条沟槽所在位置。</li>
	<li>尽可能保持脑组织形态完整，并立即置于干冰上以维持其形状，或放入5 mL RNA稳定液离心管中。若需对脑组织进行免疫组织化学分析，可将其置于4%多聚甲醛溶液中（如有条件）。</li>
	<li>在上下颌连接处做两个切口，取下下颌骨。</li>
	<li>下颌骨移除后，从颅骨剩余部分取下吻部（上颌）。确保上颌包含筛板。</li>
	<li>将鼻部放入RNA稳定液中，并在4 °C下过夜保存。由于该组织较为致密，需一定时间使RNA稳定液充分渗透整个组织。</li>
	<li>鼻部在RNA稳定液中浸泡过夜后，将其离心管放入液氮（LN2）中保存。</li>
	<li>从下颌骨取出舌头，用剪刀剪下后放入2 mL RNA稳定液离心管中以备后续使用。</li>
	<li>本方案将舍弃大部分颅骨。牙齿（尤其是来自下颌骨的牙齿）可回收保存，可能对物种鉴定具有价值。骨组织可保存于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
</ol>
5. 用于RNA的躯干解剖
<ol>
	<li>使用解剖刀刺穿腹腔，沿纵轴切开至肋骨处（图3）。此操作将破坏骨骼结构。若需保留骨骼，应在剥离皮肤后小心分离肌肉组织，并在软组织解剖完成后将其保存于1×PBS中。</li>
	<li>剥离皮肤以暴露胸肌，至少采集两份肌肉样本，一份置于RNA稳定液中，另一份保持冷冻状态用于高分子量DNA（HMW DNA）提取，立即放入冻存管并投入液氮（LN2）中。</li>
	<li>切开胸骨并掀开肋骨，以采集肺组织样本。</li>
	<li>采集心脏，可整体取出，但应将其切成两半，以便RNA稳定液充分浸透。</li>
	<li>采集肝脏样本。至少采集两份肝组织，其中一份保持冷冻用于高分子量DNA（HMW DNA）提取，立即放入空冻存管并投入液氮（LN2）中。肝脏酶活性较高，因此需将样本切得足够小，以确保RNA稳定液能够完全渗透。</li>
	<li>肝管负责将胆汁从肝脏排出，连接肝脏与胰腺及小肠。可通过探查肝脏下部/后部并沿后向追踪该管道来识别肝管。该管道通常呈淡绿色。沿肝管走向可定位胰腺和胆囊，并分别采集，置于相应的RNA稳定液冻存管中。</li>
	<li>采集胃组织，其基部附近呈不同深浅的紫色、形似羽毛的结构为脾脏。胰腺在此处也可见，呈白色结构（图3）。将各组织分别放入含有RNA稳定液的冻存管中。</li>
	<li>采集小肠和大肠的小块样本，分别置于含有RNA稳定液的冻存管中。肠道也可用于内寄生虫筛查。若现场有寄生虫学专家，可立即进行寄生虫检查；若需后续分析，可将整段肠道放入5 mL冻存管中保存。</li>
	<li>取一个肾脏并沿其输尿管追踪至膀胱，将组织分别放入相应的RNA稳定液冻存管中。</li>
	<li>利用另一侧肾脏作为解剖参照，寻找睾丸（雄性个体）或子宫并由此定位卵巢（雌性个体）。如条件允许，采集一个或两个性腺。</li>
	<li>将翼部皮肤不同区域的样本（肌肉部分与非肌肉部分）分别保存于不同的冻存管中。</li>
</ol>
6. 组织培养物的收集与制备
<ol>
	<li>通过配制含有20%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和50 µg/mL庆大霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），制备细胞生长培养基。生长培养基的分装液应在实验方案的每一天新鲜配制。</li>
	<li>采集后，翅组织活检穿孔样本必须直接放入装有1 mL冷生长培养基的密封良好的1.5 mL离心管中。用封口膜包裹管子以确保密封。</li>
	<li>随后，应将离心管置于带有冷却元件的聚苯乙烯盒中运输，以保持样本温度在4 °C。运输应尽快完成；尽管如此，以这种方式保存长达6天的样本仍可获得健康细胞，但效果较理想状态差23。</li>
	<li>一旦样本运抵组织培养实验室，可采用以下方案建立细胞培养。后续操作均应采用标准无菌技术41。</li>
</ol>
7. 第1天组织培养：组织解离
<ol>
	<li>将试管内的内容物（含有翅膜活检组织的培养基）转移至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>小心移除培养基，用500 μL无菌PBS轻柔洗涤活检组织两次。</li>
	<li>向管中加入500 µL IV型胶原酶（1 mg/mL），以使组织消化为单个细胞。</li>
	<li>于37 °C孵育过夜（最长16小时），期间不进行振荡。</li>
</ol>
8. 第2天组织培养：细胞接种
<ol>
	<li>配制新鲜的生长培养基，并预热至 37 °C。</li>
	<li>准备一个 6 孔组织培养板，向每个待使用的孔中加入 2 mL 新鲜且已预热的生长培养基（每 3 mm 翼部活检组织使用 1 个孔）。将该培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中备用（步骤 8.7）。</li>
	<li>从培养箱中取出含有细胞的 15 mL 离心管，通过加入 1 mL 预热至 37 °C 的新鲜生长培养基来终止消化反应。</li>
	<li>使用 P1000 移液器吸头轻轻吹打溶液，使细胞重悬，获得单细胞悬液。</li>
	<li>在台式离心机中以 300 × g 离心 3 分钟，轻柔地沉淀细胞。 
	注意： 悬液中或 15 mL 离心管管壁上可能仍可见少量组织碎片，但这不影响细胞悬液的制备。</li>
	<li>用 P1000 移液器小心吸除上清液，去除 80%–90% 的液体。 
	注意： 若组织碎片仍可见，请勿丢弃，下一步（8.7）中应轻柔吹打处理。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 500 µL 预热的生长培养基中，轻柔吹打悬液，确保沉淀或大的沉淀碎片不再可见，且细胞充分分散。由于细胞的存在，培养基可能呈现浑浊状。 
	注意： 此时可进行活细胞计数，以评估细胞悬液的质量及从翼部剪取组织中获得的细胞产量（详见步骤 10.11）。</li>
	<li>将全部细胞悬液轻柔地移入 6 孔板中的一个孔内。 
	注意： 上述操作应立即进行，避免细胞在步骤 8.7 后沉降。使用移液器以逐滴方式轻柔地将细胞悬液分布在孔的表面，切勿将全部溶液直接加入孔的中央，以免细胞在孔中央聚集成团。 
	注意： 若组织碎片仍可见，则不应将其转移至培养孔中。</li>
	<li>轻柔地将培养板左右、前后晃动 2–3 次，以帮助细胞在孔表面均匀分布成单层。</li>
	<li>在显微镜下观察已接种的细胞，此时细胞应为单个、呈圆球状、漂浮但密度较高的状态。</li>
	<li>小心将培养板放入已预设为 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。</li>
	<li>约 24 小时后，在显微镜下观察细胞，以评估培养状态。此时细胞应已贴附于培养板表面，并呈现扁平形态（图 4A）。在显微镜下观察时，可能可见多种不同类型的细胞。</li>
	<li>培养孔中可能仍存在一些未贴壁的漂浮细胞，其中部分为死亡细胞。若漂浮细胞比例较高，应更换培养基。此时，小心吸除约 50% 的旧培养基，并从孔壁侧边轻柔加入 1 mL 预热的生长培养基，避免扰动已贴壁的细胞。</li>
	<li>将细胞维持在已预设为 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中。应定期（但每日不超过一次）在显微镜下观察细胞，以判断是否需要更换培养基或进行传代。 
	注意： 细胞刚接种时分裂较快，应每天检查一次。随着培养时间延长，细胞生长速度减慢，可每 48–72 小时检查一次。</li>
</ol>
9. 更换培养基
<ol>
	<li>定期在显微镜下观察细胞，以评估其生长状况和培养质量。通过培养基的颜色变化来监测其质量。细胞在同一批培养基中最多保留3天，或在需要传代时提前更换，以先到者为准。
	<ol>
		<li>若细胞生长迅速并消耗培养基，肉眼也可观察到此现象，表现为培养基颜色由红色变为黄色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>必要时，小心吸出孔中约50%的培养基，并沿孔壁缓慢加入等量的预热生长培养基，避免扰动细胞。</li>
	<li>将细胞放回37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养。</li>
</ol>
10. 细胞传代
<ol>
	<li>传代细胞是指将现有的细胞培养物分种到新的孔中。当细胞融合度约为80%时应进行传代（即细胞占据孔底表面约80%，仅有约20%的塑料表面作为间隙仍可见（图4B））。</li>
	<li>小心吸除并弃去约90%的生长培养基。</li>
	<li>通过将1 mL无菌PBS沿孔壁加入，轻柔地清洗细胞，避免扰动细胞层。轻轻前后及左右摇动培养板2–3次。小心吸除并弃去板内所有PBS。</li>
	<li>重复步骤10.3，再次清洗细胞。</li>
	<li>向孔中轻柔加入250 µL胰蛋白酶-EDTA（Sigma Aldrich，货号 #T4049），于室温孵育1.5分钟。 
	注意：通过轻轻摇动培养板，确保胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖整个孔底表面。</li>
	<li>加入1 mL新鲜预热的生长培养基以终止反应。</li>
	<li>用移液器轻柔吹打约5次，使细胞从培养板表面脱落，并确保细胞处于单细胞悬液状态。 
	注意：由于细胞的存在，溶液应变得浑浊。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在台式离心机中以300 × g 离心3分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>用P1000移液器小心移除80%–90%的上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL预热的生长培养基中，并轻柔吹打混匀。确保沉淀或大的团块不再可见，细胞呈单细胞悬液状态。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪进行细胞计数（方法见此处），或按照参考视频中详细描述的方法使用血细胞计数板进行手动计数42。取10 μL细胞悬液，与台盼蓝按1:1比例混合，用于检测活细胞。</li>
	<li>孵育1分钟后，取10 μL混合液加入计数载片，将载片插入自动细胞计数仪，使用适当设置进行细胞计数。从一个融合的6孔板单孔中获得的细胞数量通常约为100万至200万个，但具体数值可能因细胞大小和物种而异。若细胞未充分分散为单细胞悬液，计数结果将不准确。</li>
	<li>此类细胞培养通常可耐受1:2的传代比例（即一个融合的细胞孔可分种至两个新孔中（总计））。操作时，再次轻柔吹打细胞悬液，然后将细胞悬液均分为两份（每份约730 µL），以逐滴方式分别加入两个含有750 µL预热生长培养基的新孔中。 
	注意：2–3天后，新孔中的细胞应达到融合状态，可再次进行传代。此时建议采用活细胞冻存方案（第11节）保存其中一个孔的细胞。后续传代过程中可根据需要继续冻存更多细胞储备。 
	注意：经过约6次传代后，细胞通常会进入衰老状态，不再分裂。这表明细胞已无法继续传代或扩增以增加数量，同时也提示细胞活力将无法长期维持。</li>
</ol>
11. 冻存有活力的活细胞
<ol>
	<li>通过将DMEM与20% FBS、10% DMSO、1% P/S和50 µg/mL庆大霉素混合，制备冻存培养基。</li>
	<li>冻存操作采用传代过程中收集的细胞沉淀。细胞沉淀应来自6孔板中一个汇合度为80%–90%的孔（相当于约1–2百万个细胞），具体步骤参照8.1–8.9。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1.5 mL冻存培养基中。</li>
	<li>将约750 µL细胞悬液分别加入两个独立的冻存管中。</li>
	<li>将冻存管放入程序降温冻存盒中，以实现细胞缓慢冷冻，从而维持细胞活力。立即置于-80 °C环境中。</li>
	<li>24–48小时后，将细胞冻存管转移至液氮（LN2）中进行长期保存。以此方式储存的细胞可复苏并保持多年活性。</li>
</ol>
12. 解冻冻存细胞
<ol>
	<li>准备一个6孔板，每孔中加入2 mL预热的生长培养基（每个冻存管使用一孔）。将6孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中备用。</li>
	<li>从液氮（LN2）中取出一个细胞冻存管，放入37 °C温水浴中快速解冻细胞，约需2–3分钟。 
	注意：解冻时间不得超过3–5分钟，因为冻存液中的DMSO在细胞解冻后对细胞具有毒性。</li>
	<li>一旦冻存管内溶液完全解冻，立即轻柔吹打混匀，并将全部溶液（约750 µL）转移至6孔板的一个孔中（该孔已在步骤12.1中预先准备好）。</li>
	<li>轻轻左右及前后摇动6孔板2–3次，使细胞均匀分布于孔底表面，形成单层。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养24–48小时。</li>
	<li>按照上述方法对细胞进行观察和传代。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案介绍了针对蝙蝠进行各种高通量分子分析的最佳采样实践。所有成功的组学研究均依赖高质量的组织样本，但蝙蝠以及其他非模式生物的组织采样通常在野外条件下进行，无法达到受控实验室环境的同等标准。采样常在偏远地区开展，资源极为有限，包括电力和冷冻设备的获取受限。确保完全无菌的采样条件十分困难，且常常无法实现。因此，本文列出了在多种采样地点和野外条件下被证实最为有效的采样方案。为了使Bat1K计划及相关工作和项目具备标准化的采样方法，建议蝙蝠生物学家在规划野外考察时，在条件允许的范围内遵循这些方案。
实验方案建议 
尽管胸部按压在过去是常用的安乐死方法，但不建议使用胸部按压法采集用于-组学分析的蝙蝠样本。该方法在美国已不再被视为可接受的安乐死方式46，且此方法可能导致多种组织发生酶降解，无论所研究物种为何47。若动物将被实施安乐死，建议同时采集基因组和转录组分析所需的组织样本。两者均需采集新鲜组织，理想情况下应使用液氮（LN2）...

高通量测序（HTS）技术在效率上迅速提升，成本持续降低，现已能够将这些方法扩展至数百乃至数千个样本。这些技术的应用已在多个科学领域产生巨大影响，从生物医学到进化与生态学1,2,3。然而，许多HTS应用严重依赖于来自活体来源的高质量核酸。随着基于长读长分子的第三代测序技术的发展，这一限制可能变得愈发突出4。因此，有必要集中精力制定在实验室外从野生生物采集新鲜组织样本的最佳实践，以最大化样本的利用价值，并减少所需采集的个体数量。
Bat1K 是一个由科学家组成的国际联盟，致力于对每一种蝙蝠物种进行染色体水平的基因组测序5。蝙蝠占哺乳动物多样性的20%，具有独特的适应性，对研究衰老、疾病生态学、感觉生物学和代谢具有重要意义5,6。许多蝙蝠由于人类开发活动而面临威胁或濒临灭绝7，或因病原体感染而数量迅速下降8,9，因此基因组水平的测序对这些物种的保护至关重要。尽管 Bat1K 目前的目标是测序所有蝙蝠物种的基因组，但在生物学家群体中，用于高质量基因组测序的组织样本采集标准化仍然是一个关键挑战。除了基因组数据外，要功能上理解蝙蝠适应性的多样性，还需要组织特异性的转录组和蛋白质分析，这通常需要独立的样本采集方案。此外，与其他所有分类群一样，尽管最佳的组织采集与保存对于获得高质量的组学分析数据至关重要，但由于技术快速发展以及多个研究团队独立工作，最佳实践的交流往往十分困难。
鉴于许多蝙蝠物种稀有或面临威胁，采用蝙蝠-组学研究最佳实践的需求尤为紧迫。与啮齿类和鼩鼱等其他小型哺乳动物不同，蝙蝠寿命较长，这归因于其卓越的DNA修复机制10和缓慢的繁殖速度11，大多数物种每年仅产一胎，少数情况下产两胎。由于这些原因，蝙蝠种群在受到干扰后恢复速度较慢，从野外大量采集个体既不可取也不可行。换句话说，必须优化实验方案，以从单个样本中获取最大量的数据，从而减少不必要的重复采样。
本文所述方案重点针对蝙蝠组织样本的采集与取样，旨在为基因组学、转录组学测序以及蛋白质分析提供标准化操作方法。其首要目标是确保蝙蝠组织的采集符合伦理与负责任的原则，涵盖从采集许可申请、组织样本出口，到最大限度减少动物应激反应以及长期储存条件等各个环节。本方案设计了详尽的解剖流程，以确保所采集的不同材料在未来研究中仍具有高度可用性。本文提供了一套逐步操作指南，指导如何以人道方式采集蝙蝠样本，力求将对种群的影响降至最低，同时最大化其科学价值。尽管本方案主要针对蝙蝠，但其中许多步骤同样适用于其他脊椎动物类群，尤其是哺乳动物。
组织采集概述 
组织采集的流程，包括储存温度和保存剂的选择，将取决于计划进行的下游分析的性质。然而，强烈建议在可能的情况下，采用多种方法采集组织，以最大限度地提高其未来的可用性，即使尚未计划进行特定分析。通常，采集和保存组织是为了后续分析核酸（DNA 和 RNA）或蛋白质。对于这些应用中的每一项，均可通过液氮（LN2）直接速冻来实现组织的最佳保存。但在野外，立即浸入液氮并不总是可行。随着技术的进步，能够在常温下保存 DNA 和 RNA 的专用小瓶等资源正变得越来越容易获得。尽管我们在此方案中尚未验证所有此类材料，但我们鼓励其他研究人员将新材料的性能与本文所述方法进行比较分析。我们确实提供了在无法获取液氮的情况下理想保存组织的方法，例如在亚马逊地区因需乘坐小型飞机进入现场而导致无法运输液氮时。此外，我们还提供了一种可培养和扩增活细胞的组织采集方法。下文将概述针对每种具体用途采集样本时的关键考虑因素，并在表1中给出了采集方法的概览。
用于DNA提取的组织 
对于所有采集的组织样本，其保存介质将决定是否可用于标准分子量或高分子量（HMW）DNA的提取。长读长测序以及目前生成染色体水平的基因组组装（即“铂金标准”基因组）均需要HMW DNA。低分子量（LMW）DNA可从快速冷冻、AllProtect（以下简称“组织稳定溶液”）或甚至RNAlater（以下简称“RNA稳定溶液”）保存的样本中提取（尽管快速冷冻样本仍是最佳选择）。通过标准实验室方法（如硅胶膜离心柱法、苯酚-氯仿法）提取的DNA，仍可能获得长达约20千碱基（kb）的DNA片段。因此，只要产量足够，此类提取的DNA可用于单插入片段文库构建，其中插入片段大小通常约为500碱基对（bp），并产生约100 bp的短读长序列12。这类DNA特别适用于“重测序”项目或无需全长染色体数据的研究。HMW DNA（10–150 kb）的获取更具挑战性，仅能通过在组织采集后迅速在液氮（LN2）中快速冷冻，并在提取前始终保存在不超过-80 °C条件下的组织样本可靠获得。
低分子量或片段化的DNA通常足以满足靶向分析的需求，包括通过PCR进行基因扩增和短读长测序13。利用低分子量DNA、仅针对一个或少数几个基因的基于PCR的研究，在理解蝙蝠感觉生物学的适应性与分子进化6,14、生理学15、系统发育学5,16以及保护生物学17,18方面已提供了大量信息。针对低分子量和片段化DNA的成功靶向序列捕获技术也已在包括蝙蝠在内的多种脊椎动物类群中得到验证19。这些方法通常成本较低，且对蝙蝠的侵扰极小，因为粪便样本以及通过口腔拭子或翼膜活检穿孔获取的非致死性组织样本也是获得用于低分子量DNA分析的常见途径20,21。
然而，样本质量在很大程度上取决于其保存所用的介质类型22。在对颊拭子和翅膜活检打孔进行系统性和定量比较后发现，翅膜活检打孔所获得的DNA含量始终更高，且在采样过程中对蝙蝠造成的应激更小22。这些比较还表明，当翅膜打孔样本保存于指示型硅胶（即由硅胶颗粒制成的一类干燥剂，在吸收水分后会变色）中时，效果最佳，优于乙醇或DMSO等其他常用的保存介质22；不过，其他保存介质（如组织稳定溶液）尚未被纳入研究。翅膜打孔样本还可用于体外培养成纤维细胞，例如Kacprzyk等人的研究23以及下文所述方法（见第6节）。采用这些方法时，应轻柔地展开蝙蝠的翼膜或尾膜，使用洁净的活检打孔器（通常直径为3 mm）获取样本。该方法似乎不会造成持久性损伤，大多数情况下疤痕可在数周内愈合24。
高分子量DNA（10-150 kb）的提取更具挑战性，目前仅能通过在组织收获后迅速用液氮（LN2）速冻并保存在不超过-80 °C的条件下直至提取，才能可靠获得。高分子量DNA（10-150 kb）对于长读长DNA测序以及从头基因组组装至关重要。事实上，尽管大多数商业试剂盒可用于分离一定标准的高分子量DNA，但所得分子大小往往无法满足第三代测序技术的要求［例如Pacific Biosciences（PacBio）、Oxford Nanopore Technologies和10x Genomics公司推出的技术，或Bionano Genomics与Dovetail Genomics提供的基因组组装方法］。因此，目前对“超长高分子量DNA”（&#62;150 kb）的需求日益增加。在从蝙蝠中获取超长高分子量DNA时，肝脏、脑或肌肉的新鲜样本均适用，但必须在不使用任何储存缓冲液或冷冻保护剂的情况下立即用液氮速冻。这些步骤的完整描述超出本文范围，但可在其他文献中获取25。
用于RNA的组织 
RNA是一种单链分子，其稳定性低于DNA。尽管存在多种类型的RNA，组学分析通常聚焦于mRNA（信使RNA）和小RNA（例如microRNA）。转录完成后，mRNA会经过剪接形成成熟的转录本，其中不含内含子，并代表基因/基因组的编码区域。编码基因仅占基因组大小的极小部分（1%–2%），因此靶向mRNA是获取基因序列数据的一种经济高效的方法。microRNA是一类调控mRNA翻译成蛋白质过程的RNA分子，因此在基因表达调控中发挥着重要的调节作用。RNA转录本可以单独进行测序，但在组学分析中更常见的做法是作为转录组的一部分进行测序26,27,28,29,30，即对特定样本中存在的全部RNA转录本进行整体分析。
测序可通过多种方法进行（例如，短读长RNA测序或长读长全长异构体测序），从而实现对RNA丰度和异构体使用情况的分析。由于mRNA转录本的数量和多样性在不同细胞和组织之间存在差异，RNA测序使得研究和比较不同样本间的基因表达与调控成为可能。随着小RNA测序和全长异构体测序方法在生物学信息方面的日益丰富，人们对这些测序技术的兴趣正在增长。针对不同类别RNA的组织样本制备可按照本文所述方法进行，仅后续的提取方法有所不同31,32。最后，由于转录组提供了蛋白质编码基因组的高覆盖度子集，所构建的数据集可能对基因组组装与注释具有重要价值，因此在不同组织中收集RNA测序数据已成为Bat1K计划的重要组成部分。
与DNA不同，RNA在化学上不稳定，且易受RNase酶的降解作用影响，而RNase在组织裂解液中普遍存在，是机体针对RNA病毒的一种防御机制。因此，细胞和组织中的RNA组分在采样或处死动物后不久即开始降解。为保存RNA，必须采取措施防止其降解。通常的做法是将新鲜采集的组织在4 °C条件下置于稳定剂（如RNA稳定溶液）中保存，以灭活组织中天然存在的RNase，随后进行冷冻以实现长期储存。作为优选的替代方法，可将组织在液氮（LN2）中快速冷冻；但如上所述，将液氮运往野外并持续补充以防止组织解冻，在实际操作中可能面临较大的后勤挑战。
用于蛋白质分析的组织 
蛋白质的组成和相对丰度在不同细胞和组织间的差异与RNA类似；然而，蛋白质平均而言比RNA更稳定。利用蛋白质组学进行蛋白质鉴定通常只能匹配部分而非完整的蛋白质序列，但可提供跨组织表达的信息，并能鉴定存在的病原体。由于许多蛋白质序列在哺乳动物间具有保守性，蝙蝠样本在进行蛋白质组学分析时容易受到保守的人源蛋白质污染，因此在样本采集过程中需要采用无菌操作（例如使用手套、镊子）。虽然在液氮（LN2）中快速冷冻是防止蛋白质降解的最佳方法，但在缺乏其他条件时，使用干冰、-20 ˚C 冰箱甚至冰块也是可行的。随着温度升高，蛋白质发生差异性降解的风险也随之增加。组织稳定液等稳定剂可在室温下有效保存组织中的蛋白质组分，适用于无法实施快速冷冻时的短期保存（最长一周）。
特定组织的酶谱特征直接影响其中蛋白质的保存效果。酶活性较低的组织（如肌肉）即使在普通冰箱的较高温度下，也能较好地维持其蛋白质谱。相比之下，肝脏组织具有较高的酶活性，其蛋白质在制备过程中更易发生降解。目前已有越来越多的实验方案致力于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中获取人类蛋白质组谱，这表明当采集后无法立即冷冻时，使用多聚甲醛固定组织可能是一种低成本保存蛋白质的有效方法33,34。尽管蛋白质的保存效果高度依赖于固定时间和保存条件，已有研究通过免疫组织化学方法从福尔马林固定、乙醇保存的蝙蝠标本中成功鉴定出蛋白质35。该方法虽难以推广应用于蛋白质组水平的大规模取样，但表明在无法进行速冻且其他稳定剂成本过高的情况下，福尔马林固定的蝙蝠组织仍具有获取蛋白质谱的潜力。
用于细胞培养的组织 
采集组织并进行快速冷冻可获得有限量的材料，且一旦使用后便不可再获取。相比之下，细胞培养可提供可立即使用或长期保存以供后续研究的活细胞。当组织样本量较小时，培养还可实现细胞扩增，提高细胞产量。在组织获取受限的情况下，这种方法尤为有用，例如在对稀有物种开展非致死性取样的实验中，该方法对物种保护具有广泛意义。本文描述了一种可通过翼膜组织非致死性取样实现细胞培养的方案，但该培养方法也可适用于多种其他类型的组织36,37。本方案所采用的方法主要筛选贴壁细胞。结合所用的组织来源与培养基，本方案适用于筛选和培养成纤维细胞；但如需要，也可采用其他方案筛选不同类型的细胞。在 Bat1K 项目背景下，预计对于稀有和濒危物种而言，通过翼膜非致死性取样并结合细胞培养扩增样本，是获得多种技术所需足量 DNA 的关键步骤5。
蝙蝠捕捉 
所有操作蝙蝠的人员均须接受具备蝙蝠研究资质的研究人员培训，并完成狂犬病疫苗的暴露前系列接种。若被蝙蝠咬伤，仍需进一步接受暴露后系列疫苗注射。捕捉蝙蝠的标准方法包括雾网法（图1）和竖琴状陷阱法（图2）。雾网法最为常用，适用于活动量较低至中等的区域，但需格外注意以最大程度减少蝙蝠的应激反应。小型蝙蝠尤其脆弱，若未及时处理，可能因应激而死亡。频繁检查雾网可减少蝙蝠受伤和死亡，同时也能保护雾网免受损坏。这一细节至关重要，因为组织样本的采集要求组织保持新鲜，而对雾网管理不当可能导致蝙蝠不必要的死亡，或在研究人员完成样本处理前发生过早死亡。由于多个蝙蝠可在竖琴状陷阱中停留且应激程度较低，该方法特别适用于蝙蝠活动频繁的区域，例如洞穴附近或大型栖息地。有关正确捕捉蝙蝠及采集形态学与人口统计学数据的详细操作步骤，参见补充方法部分。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf Safelock 离心管</td><td>Fischer Scientific</td><td>10509691</td><td>细胞培养实验流程中使用的 1.5 mL 无菌离心管</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,002</td><td>细胞培养实验流程中使用的 15 mL 无菌离心管</td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Thomas Scientific</td><td>1154P75</td><td>用于在液氮中保存组织的低温冻存管</td></tr><tr><td>3 mm 活检打孔器</td><td>Medline</td><td>MIL3332</td><td>用于细胞培养的翼状活检打孔器</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Greiner</td><td>83,392</td><td>培养容器</td></tr><tr><td>Allprotect 组织试剂</td><td>Qiagen</td><td>76405</td><td>用于粪便样本；组织稳定溶液</td></tr><tr><td>TC10/TC20 细胞计数器用细胞计数载片，双腔</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>用于 Bio-Rad TC20 自动细胞计数器进行细胞计数的计数室</td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7909</td><td>用于原代细胞的解离</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td>防止细胞冷冻过程中水结晶形成</td></tr><tr><td>DMEM&amp;ndash;Dulbecco 改良 Eagle 培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>12491-015</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>用于洗涤细胞的平衡盐溶液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td>真核细胞体外培养用血清补充剂</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264-250MG</td><td>培养基用抗生素</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty 冻存盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0050</td><td>提供 1 &amp;deg;C/min 冷却速率的冷冻容器</td></tr><tr><td>PARAFILM 封口膜</td><td>Sigma</td><td>P7793</td><td>用于管子等物品的密封包裹</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（青-链），100 倍浓缩液</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td>培养基用抗生素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）10×，pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>用于骨组织洗涤和保存的盐缓冲液；使用去离子水稀释至 1×</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7021</td><td>RNA 稳定溶液</td></tr><tr><td>RNAse away</td><td>Genetech</td><td>83931-250mL</td><td>降解导致 RNA 降解的酶</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Fisher Scientific</td><td>7631-86-9</td><td>干燥剂</td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数器</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>自动细胞计数器</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td>用于评估细胞活力的细胞染料</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>用于细胞传代过程中的细胞解离</td></tr></tbody></table>

用于组学分析和原代细胞培养的蝙蝠组织采集

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

随着高通量测序技术的进步，高质量组织获取与保存的标准化方法使得这些技术能够扩展应用于非模式生物。目前已针对一系列高通量测序方法，建立了一套优化蝙蝠组织采集的实验方案。本文概述了蝙蝠捕获方法、每只蝙蝠应采集的种群统计学信息，以及在组织采集过程中最大限度减少蝙蝠应激的优化操作。具体包括用于获取（i）适用于高分子量基因组分析的DNA、（ii）用于组织特异性转录组分析的RNA，以及（iii）用于蛋白质组水平分析的蛋白质的组织采集与处理方法。最后，还介绍了一种通过翼膜剪取建立可存活的原代细胞培养的方法，以避免致死性取样。这些方法的核心目标是最大化每只蝙蝠所能提供的分子与形态学数据量，并建议采用最佳组织保存方式，以确保其在未来新技术发展过程中仍具有研究价值。随着全球范围内针对各类物种开展染色体水平、无误差基因组测序计划的推进，此类标准化操作变得尤为重要；目前多个科研团队正在主导不同分类群的测序工作。本文所述方案为Bat1K联盟制定了理想的组织采集与保存标准，该联盟致力于完成所有蝙蝠物种的基因组测序。

DNA 
用于标准的低分子量（LMW）分析，从三种新热带蝙蝠物种中提取了DNA。组织样本按照本文所述方案，于多米尼加共和国和哥斯达黎加的野外采集。解剖后，取小块组织（&lt;0.5 cm（最薄处）的混合组织（脑、肝和肠）置于RNA稳定溶液中，迅速冷冻后储存在-80 °C采用标准的DNA提取方案进行提取，并使用RNase处理。43使用自动化电泳工具评估DNA完整性，得到以下具有代表性的片段大小峰：物种1（两次独立提取）分别为22 kb和20 kb；物种2为25 kb；物种3为24 kb（图5, 表2).
用于第三代测序的DNA提取物需具有高浓度且片段化程度最低。本研究获取了在加纳采集的旧大陆果蝠（Eidolon helvum）的速冻脑组织样本，并从中提取了高...

本方案旨在为野外捕获蝙蝠的基因组学、转录组学和蛋白质组学分析提供最佳的组织制备方法。内容包括蝙蝠捕获与解剖、组织保存以及蝙蝠组织细胞培养的详细操作步骤。

随着高通量测序技术的进步，高质量组织获取与保存的标准化方法使得……得以拓展

在本视频中，我们提供了一种人道捕获蝙蝠的逐步操作指南，旨在尽量减少对种群的影响，并最大化其科学价值。本方法的优势在于：能够最大限度地获取每只蝙蝠潜在的分子与形态学数据，妥善保存组织以维持其未来的科研价值，并尽量减少对野生个体的采集。解剖操作流程难以仅通过语言描述清楚。我们在此介绍的许多组织制备技术，通过展示如何识别不同器官，以及如何正确地进行解剖和保存，能够得到最有效的传达。在开始任何解剖操作之前，应预先准备好所有小瓶，以避免延误。对于RNA提取，需为每个样本预留所需数量的小瓶。用将要采集的组织类型以及标准的样本标识信息标记每个试管。将RNA稳定液加入小瓶至50%满，并冷却至4摄氏度。注意不要将小瓶完全装满RNA稳定液，因为在放入液氮时可能导致试管爆炸。安乐死后立即按照文本方案所述对蝙蝠标本进行断头。去除头骨上的毛发、筋膜和头骨肌肉，包括鼻子上的皮肤。注意不要折断鼻子的前端。用镊子摘除眼睛，施加足够的力量以分离视神经。将眼睛放入含有2毫升RNA稳定溶液的离心管中。使用剪刀从颈部开始沿颅骨背侧做矢状切口，注意不要损伤脑组织。然后，用镊子轻轻向两侧拉开颅骨，直至颅骨裂开，暴露出脑组织。确保颅骨末端的颅骨已被去除，以便镊子能够轻松刮除脑组织。用镊子轻轻刮取脑组织。脑组织会非常柔软。嗅球将变得可见，位于颅骨内部的腹侧部分。尽量保持嗅球附着在脑组织上。如果可能，保持脑组织形态完整，并立即将其置于干冰上，或放入含有5毫升RNA稳定溶液的离心管中。在颅骨的尾端，耳蜗此时应从头部两侧横向可见。使用镊子轻轻牵拉耳蜗。然后，将它们放入一个含有2毫升RNA稳定溶液的离心管中。在上下颌连接处做两个切口，移除下颌骨。筛板将随之显现。这是保持研究者方向感的关键骨骼结构。可通过颅骨最前部区域加以识别，该区域具有多个孔洞以及两条容纳嗅球的沟槽。在去除下颌骨后，将吻突从颅骨其余部分分离。确保下颌包含筛板。将鼻部置于RNA稳定溶液中，并在4°C下保存过夜。从下颌骨下部用剪刀剪下舌头，放入含有RNA稳定溶液的2毫升小瓶中。将鼻管置于液氮中，此操作在RNA稳定溶液中过夜浸泡后进行。在冰上或冰箱中浸泡24小时后，将样品置于液氮中。使用解剖刀刺穿腹腔，沿纵轴切开至肋骨处。这将舍弃骨骼框架。剥离皮肤以暴露胸肌，并至少采集两份肌肉样本。在解剖过程中同时采集用于RNA和DNA分析的组织。将用于提取高分子量 DNA 的组织放入干燥的冻存管中，并在液氮中快速冷冻。将用于 RNA 的组织放入 RNA 稳定溶液中。剪开胸骨，并掀开肋骨。现在，取出肺和心脏。使用手术刀和镊子将心脏与肺分离。用手术刀将肺组织切碎，并放入RNA稳定溶液中。取出心脏，可完整获取，但应将其切成两半，以便RNA稳定溶液能够充分浸透。接下来，采集肝脏样本，至少取两份肝脏组织。将一份样品放入离心管中，保持冷冻以用于高分子量DNA提取，另一份样品放入

tissue-collection-of-bats-for-omics-analyses-and-primary-cell-culture

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

蝙蝠组织收集 -细胞分析和原细胞培养

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

本文介绍了一种从野生啮齿类动物皮肤和肺组织中分离并维持原代成纤维细胞培养物的实验方案。...

建立来自啮齿类动物的原代成纤维细胞培养物

我们提供了一种详细的方案，用于制备从Drosophila胚胎中分离的原代细胞。结合有效的RNAi干扰技术以及其他分子、生物化学和细胞成像方法，可在Drosophila原代细胞中研究多种科学问题。...

来自Drosophila原肠胚胚胎的原代细胞培养

哺乳动物皮肤及其附属结构含有可溶剂提取的脂质，这些脂质可提供具有物种特征性的化学组成。本文介绍了一种常规方法，利用薄层色谱法分离自皮肤及其附属组织中提取的各类主要脂质，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定其甘油三酯谱型。...

通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

我们介绍一种从实验小鼠耳朵和尾巴中分离原代成纤维细胞的简单且快速的实验方法。该方法无需特殊的动物操作训练，且可用于从室温下保存长达10天的耳组织中建立成纤维细胞培养。...

从小鼠耳部和尾部组织制备原代成纤维细胞培养物

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

本方案描述了为基于微滴的高通量单细胞RNA测序制备健康的成年哺乳动物单细胞所需的常规操作步骤及质量控制检测。同时提供了测序参数、序列比对以及下游单细胞生物信息学分析方法。...

基于液滴条形码的成年哺乳动物组织单细胞转录组学

本方案介绍了在中国台湾蝙蝠中进行狂犬病病毒属抗原诊断检测的标准实验室操作程序。...

中国台湾蝙蝠种群狂犬病毒属监测的标准操作规程

我们介绍一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。该实验设计通过监测细胞电阻抗的变化，采用实时细胞分析技术。可在复杂组织中捕获侵袭性癌细胞、免疫细胞、内皮细胞或间质细胞，并评估共培养的影响。...

共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获

本文介绍了一种准确且可靠地检测稀有细胞类型中代谢物的实验方案。通过技术改进，包括采用改良的鞘液进行细胞分选以及制备相应的空白对照样本，仅需每样本5000个细胞即可实现对代谢物的全面定量分析。...

稀有原代细胞的靶向代谢组学

学习蝙蝠组织采集与人道捕获方法，用于基因组学、转录组学和蛋白质组学研究。该方案通过非致死性采样获取脑、心脏、肝脏等多种组织，并利用RNA稳定液保存样本，同时建立原代成纤维细胞培养体系，为蝙蝠生态学与分子生物学研究提供可再生的遗传材料资源。

用于组学分析和原代细胞培养的蝙蝠组织采集

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