Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Beredning av nyfödda råtta hjärn vävnad för ultrastrukturella Morphometric analys av synaptic Vesicle distribution på Nervterminaler
Chapters
Summary June 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver förfaranden för behandling av nyfödda råtta hjärn vävnad att få högupplösta elektronmikrografer för morfometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid nervterminaler. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan också användas för att studera morfologin hos ett antal andra cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer.
Transcript
Bland flera befintliga protokoll för vävnad förberedelse för överföring elektronmikroskopi, vi valt metoder som ger optimala strukturella bevarande och hög upplösning mikrografer att utföra morphometric analys av synaptic vesicles distribution vid presynaptic terminaler. De höga kontrastbilder som erhålls med dessa metoder gör det möjligt att kvantifiera parametrar såsom avstånd av synaptiska vesiklar från presynaptiska membran antalet vesiklar dockade vid presynaptiska membranet och inter vesikel avstånd. Alla dessa parametrar är indikativt för synaptisk funktion.
Eftersom förändringar i den rumsliga organisationen av synaptiska vesiklar kan associeras med störningen av synaptisk funktion, har dessa metoder använts för att undersöka effekterna av generella anestetika på synaptisk utveckling. Dessa metoder skulle också kunna användas för att undersöka effekterna av något läkemedel eller behandling på detaljerad morfologi av synapser för att ge insikt i deras funktion. Börja med att förbereda osmium tetroxid för post fixering av råtta hjärnsektioner som tidigare fastställts med paraformaldehyd och glutaraldehyd via vaskulär perfusion.
Sektioner blir stela efter behandling med osmiumtetroxid. Därför kräver vävnadshantering uppmärksamhet från och med då. Också, innan du lägger osmium, se till att dina sektioner är tillplattad som någon lucka kommer sannolikt att resultera i vävnadsfraktur.
Öppna en fem milliliter glas ampule av 4%osmium tetroxid och vatten och släpp den inuti en brun glasflaska. Tillsätt fem milliliter 0,2 molarfosfatbuffert och tillsätt sedan ytterligare 10 milliliter 0,1 molarfosfatbuffert för att uppnå en 1%slutlig lösning. Använd en 20 milliliter spruta utrustad med en lång nål för att dra upp 1%osmium-tetroxiden och tillsätt sedan osmiumtetroxiden till en brun glasburk täckt med aluminiumfolie.
Efter att ha sett till att preparatet har vecklats ut och tillplattats, tillsätt 1%osmium tetroxid och 0,1 molar PB till provflaskan. Inkubera preparatet i osmiumtetroxid i en timme i rumstemperatur. Extrahera osmiumtetroxiden med ett mikropipet efter inkubationen är klar och skölj sektionerna enligt beskrivningen i protokollet.
För att förbereda uranylacetat, placera en 200 milliliter volymetrisk glaskolv som innehåller 100 milliliter 70%etanol på en omrörningsplatta. Tillsätt fyra gram uranylacetat i kolven, linda in en aluminiumfolie för att förhindra utfällning med ljus och rör om kontinuerligt. Torka ut sektionerna i 50%etanol.
Fläck med den beredda 4%uranylacetat i en timme och följ upp med serieuttorkande och sköljning enligt beskrivningen i manuskriptet. Ta bort sprutkolven från en 60 milliliter sondmatningsspruta och locket den med en säkerhetsnål. Placera sprutan med den öppna sidan uppåt och tillsätt varje ingrediens i hartsblandningen en efter en.
Avsluta med att lägga till 525 mikroliter av DMP30 med en pipet. Flytta kolven i pipet mycket långsamt som DMP är mycket trögflytande. Sätt tillbaka kolven i sprutan.
Invertera sprutan några gånger för att blanda innehållet. Färgen kommer att ändras från gult till bärnsten. Evakuera luften inuti sprutan.
Placera den sedan på en vipp med kontinuerlig skakning i minst 30 minuter. Tillsätt en volym epoxiharts och en volym aceton till en scintillationsflaska och skaka för att blanda. Applicera denna en till en harts till aceton blandning på vävnaden avsnitt efter den sista aceton skölj hålla i täckt för att undvika aceton avdunstning.
Ta bort en till en blandning av harts och aceton efter två till fyra timmar och ersätta den med full harts och inkubera i fyra timmar. Lägg allt hartsavfall i en uppsamlingsbehållare under huven för att polymerisera och som ska kasseras senare. Skär två rektangulära bitar av klar polyklotrifluoreten film och torka dem med 70%etanol.
Trimma dem så att det finns minst 1,5 centimeter vävnadsfri plast på varje sida av sektionen, se till att de har samma bredd men höjden på arket på toppen är ungefär 2/3 av bottenarket. Luta långsamt injektionsflaskan och använd en fin kamelpensel och en flexibel mikrospatel för att mycket försiktigt lyfta upp preparatet från botten. Flytta sedan försiktigt sektionen längs injektionsflaskans väggar och överför på det nedersta PCTFE-arket.
Avlägsna överskottsharts med en mikrospata och täck försiktigt preparatet med det översta arket. Tryck försiktigt ut eventuella fångade luftbubblor utan att applicera direkt tryck på vävnadsdelen och utplåna överskottshartsen. Använd en lösningsmedelsresistent penna för att märka arken och placera i en ugn vid 60 grader celsius i två till tre dagar för att polymerisera.
Dra försiktigt isär de inklämda PCTFE-arken för att öppna dem. Använd en lösningsmedelsresistent penna för att markera sidan av arket som innehåller den adhering avsnitt som markerar den nära vävnaden. Använd en skivstans för att få ett cirkelprov av sektionen och se till att pennmärket är en del av den stansade vävnaden.
Pennmärket glimmar när ljus glänser på preparatet. Placera locket på en inbäddningskapselsida uppåt på en kapselhållare. Placera en droppe harts på locket och sätt in den stansade disken inuti locket med vävnadsdelen uppåt.
Sätt in en kapsel i locket med hjälp av en skonsam korkskruvsrörelse. Använd fin pincett för att rulla och sänka en tryckt två centimeter lång pappersetikett i kapseln, se till att den passar till krökningen av sidoväggarna av kapseln. Häll inbäddning harts inuti kapseln, fyll upp till kanten av kapseln och använda en spetsig träpinne för att driva vävnaden exemplaret ner till botten.
Placera kapseln i ugnen på 60 grader celsius i två till tre dagar för polymerisering. Och fortsätt sedan med snittning och färgning som beskrivs i protokollet. Elektron mikrograf av tillfredsställande bevarande av neuronal cell struktur visar lager cellmembran utan pauser.
Cytoplasman är slutligen granulat och utan tomma utrymmen. Mitokondrierna är varken svullna eller krympta med ett bevarat yttre dubbelmembran och intakt inre cristae. Optimal bevarande av neuronala ultrastructure och fina morfologiska detalj är viktigt för att visualisera synaptiska vesiklar och mäta deras avstånd från presynaptiska membranet.
Synaptiska vesiklar bör vara distinkta och kantad av ett obrutet enda membran. För att underlätta morphometric analys av synaptisk vesikel distribution, presynaptiska och postsynaptiska membran bör vara parallella i sin kontinuitet bevaras. Elektron mikrograf av defekta bevarande av vävnad struktur visar snedvridning och brott av neuronala cellmembran och förekomsten av markant utvidgade extracellulära utrymmen.
Mitokondrierna verkar utspänd och har svullen cristae. I ett annat exempel på defekt vävnad struktur bevarande, fanns det stora vita tomma utrymmen inom cytoplasman i stället för fint granulat cytoplasmatiskt ämne med utvidgade extracellulära utrymmen. En konstgjord membran som forall sannolikt resulterat från mobilisering av lipider under fixering med glutaraldehyd.
När du arbetar unga hjärnvävnaden använda 1 molar fosfat buffert som lösningsmedel för alla din lösning så att du håller tonicity så nära som möjligt att nyfödda råtta hjärna och minimera artefaktuell vävnad krympning och eller svullnad. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan användas för att studera de detaljerade morfologi och dimensionella strukturella relationer av ett antal cellulära komponenter än synaptiska vesiklar. Till exempel mitokondrier, golgiapparat och kärnkromatin.
Flera steg i detta protokoll kräver kemikalier som kan vara giftiga. Arbeta alltid under draghuv och använd personlig skyddsutrustning vid hantering av aldehyder, osmium, uran och blyföreningar.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
