Neuroscience
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Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo
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Summary June 2nd, 2019
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Das Ziel dieses Artikels ist es, die Schritte zu skizzieren, die für die Herstellung von Fibrillen aus monomem Alpha-Synuclein, anschließende Qualitätskontrolle und die Verwendung der vorgeformten Fibrillen in vivo erforderlich sind.
Transcript
Das Alpha-Synuclein Preformed Fibril Modell wird von Labors weltweit verwendet, um Synukleinopathien zu untersuchen. Obwohl das Modell erfolgreich von vielen Labors verwendet wurde, haben einige Gruppen Inkonsistenzen erlebt, die Fibrillen erzeugen und konsistente Alpha-Synuclein-Pathologie erzeugen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll, das die Entstehung von Fibrillen aus Alpha-Synuclein-Monomeren und die Verwendung von vorgeformten Fibrillen in vivo beschreibt, Fragen beantworten kann, die Forscher über die Verwendung des Modells haben.
Das Alpha-Synuclein Preformed Fibril Modell rekapituliert Schlüsselmerkmale der Parkinson-Krankheit, wie Alpha-Synuclein Pathologie und Neurodegeneration. Und es hat sich gezeigt, dass es zu bescheidenen motorischen Beeinträchtigungen in einigen Tiermodellen führt. Die Bildung von Einschlüssen, die phosphoryliertes Alpha-Synuclein enthalten, und ein langwieriger Zeitverlauf in Richtung Neurodegeneration bietet Forschern verschiedene Stadien während des fortschreitenden Fortschreitens der Synukelosepathie, um potenzielle therapeutische Interventionen zu untersuchen und zu zielen.
Unser Labortechniker Christopher Kemp demonstriert die Herstellung von kundenspezifischen Glasnadeln. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauen Alpha-Synuclein-Monomere auf Eis. Die aufgetauten Monomere wurden durch sanftes Streichen auf die Röhre wieder aufgewirflimmert.
Und Zentrifuge bei 15 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann übertragen Sie den Überstand auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und erfassen Sie die übertragene Menge. Die Monomere mit 1x dPBS auf eine Endkonzentration von 5 mg pro ml verdünnen.
Kurz Wirbel zu mischen, und kurz Zentrifuge, um die gesamte Flüssigkeit an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Als nächstes verwenden Sie Klebefolie, um den Mikrozentrifugenrohrdeckel geschlossen zu befestigen. Legen Sie das Rohr in einen Orbital-Thermomischer mit deckel für sieben Tage bei 37 Grad Celsius, während bei 1 000 U/min schütteln.
Am Ende von sieben Tagen sollte der Inhalt der Röhre trüb erscheinen. Zuerst alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen einschließlich Handschuhe, einen Labormantel und ein Gesichtsschild. Befestigen Sie dann in einer Zellkulturhaube eine Sonde mit einem Durchmesser von 3,2 mm am Konverter.
Stellen Sie die Verstärkeramplitude der Beschallungsgeräte auf 30% und den Puls auf eine Sekunde und eine Sekunde aus und die Zeit auf eine Minute. Die Fibrillen bei Raumtemperatur auftauen und noch in der Kulturhaube verdünnen, die Fibrillen mit sterilen dPBS verdünnen. Als nächstes dämpfen Sie ein Laborgewebe mit 70% Ethanol und verwenden Sie dieses, um die Sonde des Beschallungsators zu wischen, um es zu reinigen.
Untertauchen Sie die Spitze der Sonde in doppelt destilliertes Wasser und pulsieren Sie 10 Mal, um die Sonde weiter zu reinigen. Danach die Sonde mit einem Laborgewebe trocknen lassen. Legen Sie die gereinigte Sondenspitze in das Rohr von verdünnten Fibrillen und positionieren Sie die Spitze an der Unterseite des Rohres.
Beschallen Sie die verdünnten Fibrillen unter Verwendung der zuvor eingestellten Parameter, während Sie die Sonde während jedes Pulses nach oben und unten bewegen, um sicherzustellen, dass alle Fibrillen in der Flüssigkeit beschallt werden. Nach der Beschallung kurz zentrifugieren für eine Sekunde bei 2.000 g, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Rohres zu sammeln. Untertauchen Sie die Sondenspitze in 1%SDS und pulsieren Sie 10 Mal, um die Sonde zu reinigen.
Entfernen Sie dann die Spitze aus dem SDS, und tauchen Sie sie in doppelt destilliertes Wasser und pulsieren Sie 10 Mal. Wischen Sie die Sonde mit einem mit 70% Ethanol gedämpften Laborgewebe ab und wischen Sie sie mit einem trockenen Laborgewebe trocken. Lösen Sie die Sonde vom Konverter und speichern Sie sie.
Danach alle Oberflächen in der Haube mit 1%SDS gefolgt von 70% Ethanol abwischen. Zunächst legen Sie ein silikonisiertes Glaskapillarrohr in einen Glasnadelzieher. Schalten Sie das Heizelement ein und lassen Sie die angeschlossenen Gewichte das beheizte Glaskapillarrohr dehnen.
Als nächstes verwenden Sie eine Schere, um das gezogene Glaskapillarrohr an der dünnsten Stelle in der Mitte zu schneiden und die Glasnadel aus dem Glasnadelzieher zu entfernen. Dann verwenden Sie eine Schere, um eine Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm zu schneiden. Schieben Sie die Schrumpffolie über die Metallnadel einer 10-Mikroliter-Abgeschrägtenspritze.
Verwenden Sie eine offene Flamme, um zu erhitzen und haften Sie die Schrumpffolie an der Nadel, während Sie sicherstellen, dass die Nadel gedreht wird, um die Wärme gleichmäßig aufzutragen. Schieben Sie das größere Ende der gezogenen Glasnadel vorsichtig über die Metallnadel der Spritze. Danach eine Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm schneiden und vorsichtig über die Glasnadel schieben, um die Basis der Glasnadel und die Metallnadel der Spritze zu überlappen.
Verwenden Sie eine offene Flamme, um die Schrumpffolie zu erhitzen, um die Glasnadel an der Metallnadel zu befestigen. Um die Nadel weiter zu sichern und mögliche Leckagen zu vermeiden, schneiden Sie eine zusätzliche Länge von Schrumpfwickelschläuchen auf ca. 40 mm, und schieben Sie sie vorsichtig über die Glasnadel, um die Basis der Glasnadel und die Metallnadel der Spritze zu überlappen. Verwenden Sie eine offene Flamme, um die Schrumpffolie zu erhitzen, um die Glasnadel an der Metallnadel zu befestigen.
Dann verwenden Sie eine Schere, um die Glasnadel so zu trimmen, dass die Spitze ca. 8 mm lang ist. Um die Nadel zu testen, füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer angeschlossenen 26-Spur-Nadel mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie den Metallkolben aus der benutzerdefinierten Glasnadelspritze und legen Sie die Nadel der mit Wasser gefüllten Spritze in die Basis der benutzerdefinierten Spritze ein.
Prüfen Sie die Schnittstelle der Glasnadel und der Metallnadel auf Leckagen und bestätigen Sie einen stetigen Wasserfluss. Dann füllen Sie ein Mikrozentrifugenrohr mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie die benutzerdefinierte Glasnadelspritze, um das destillierte Wasser zu zeichnen.
Prüfen Sie die Nadel, um zu bestätigen, dass Flüssigkeit in die Spritze aufgenommen wird und keine Blasen vorhanden sind. Wenn es Blasen gibt, oder wenn das Wasser nicht in die Nadel gezogen wird, kann das Trimmen der Nadel helfen, den Druck zu lindern. Danach die Spritze mit den beigefügten Glasnadeln vorsichtig in den Spritzenkästen aufbewahren, bis sie für Operationen benötigt werden.
Die Untersuchung mit Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt das Vorhandensein von langen Fibrillen. Im Vergleich dazu sind Alpha-Synuclein-Monomere Gerste sichtbar und haben keine erkennbare Form. Analoide Bestätigung der Fibrillen wird dann mit einem Thioflavin T Assay bestätigt.
Ein repräsentativer Test zeigt, dass die dPBS- und Mausmonomere ein geringeres Signal in relativen Mehlesent-Einheiten erzeugen als Maus-PFFs. Menschliches Alpha-Synuclein-Monomer erzeugt ein ähnliches Signal wie Mausmonomer. Während die menschlichen PFFs ebenfalls ein höheres Signal erzeugen als Monomere.
Um das Vorhandensein von Pelitiblenfibrillen zu beschwichtigen, wird ein Sedimentationstest durchgeführt. Sowohl in der Maus als auch in menschlichen PFF-Proben sollte die supernate Verletzung mehr Protein im Pellet haben als der Überstand. Im Gegensatz dazu ist der Großteil des Proteins aus der Maus und menschlichen Monomeren im Überstand vorhanden, wobei wenig im Pellet vorhanden ist.
Sowohl Maus- als auch menschliche PFFs werden beschallt, um PFFs von geeigneten Längen für die Aussaat von Alpha-Synuclein-Einschlüssen zu erzeugen. Eine umfassende Untersuchung von ca. 500 Fibrillen zeigt, dass die durchschnittliche Länge von Mausfibrillen etwa 44 Nanometer beträgt. Mit 86,6 % der PFFs, die 60 Nanometer oder weniger messen.
Humane PFFs haben jedoch eine durchschnittliche Länge von etwa 55,9 Nanometern mit 69,6 % der PFFs, die 60 Nanometer oder weniger messen. Die In-vivo-Untersuchung der PFF-Wirksamkeit wird mit Hilfe der Immunhistochemie bestätigt. Einschlüsse, die in der Substantia nigra gebildet werden, haben ähnliche Eigenschaften wie Lewy-Körper, da sie phosphoryliertes Alpha-Synuclein enthalten, aminloyed Strukturen enthalten und mit Thioflavin S flecken und resistent gegen Proteinase-K-Verdauung sind.
Die Beschallung kann die individuelle Beschallung aerosolisierten vorgeformten Fibrillen aussetzen. Daher sollte die richtige Sicherheitskleidung getragen und die Beschallung in einer Kapuze durchgeführt werden, um das Risiko einer Exposition zu minimieren.
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