Name: 免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习从免疫细胞分离细胞外囊泡的方法，用于研究神经突起生长和胶质瘤细胞侵袭调控。该技术结合超速离心和尺寸排阻色谱，为神经免疫相互作用研究提供可靠方案。

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本研究工作由教育部资助&#768;法国国家教育和高等教育与研究部&#769;感谢里尔大学、里尔科研与高等教育中心以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）的支持。我们衷心感谢BICeL- Campus Scientific City技术平台提供仪器使用机会和技术指导。我们衷心感谢Jean-Pascal Gimeno、Soulaimane Aboulouard和Isabelle Fournier在质谱分析方面的协助。我们衷心感谢Tanina Arab、Christelle van Camp、Francoise le Marrec-Croq、Jacopo Vizioli和Pierre-Eric Sautière在科学与技术开发方面所做出的重要贡献。

1. 小胶质细胞/巨噬细胞的原代培养
<ol>
	<li>小胶质细胞的原代培养
	<ol>
		<li>将商品化的大鼠原代小胶质细胞（2 × 106 个细胞）（参见材料表）在添加了10%无外泌体血清、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和9.0 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下进行培养。</li>
		<li>培养48小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巨噬细胞的原代培养
	<ol>
		<li>将商品化的大鼠原代巨噬细胞（1 × 106 个细胞）在供应商提供的培养基中（参见材料表），添加无外泌体血清，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>培养24小时后收集条件培养基，并进行细胞外囊泡（EVs）的分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 外泌体的分离
<ol>
	<li>从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）
	<ol>
		<li>将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移至锥形管中。</li>
		<li>在室温（RT）下以 1,200 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>将上清液转移至新的锥形管中，在室温下以 1,200 × g 离心 20 分钟，以去除凋亡小体。</li>
		<li>将上清液转移至 10.4 mL 聚碳酸酯管中，并将该管放入 70.1 Ti 转子中。在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 90 分钟，沉淀 EVs。</li>
		<li>弃去上清液，将含有 EVs 的沉淀重悬于 200 µL 经 0.20 µm 滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞外囊泡（EVs）的分离
	<ol>
		<li>自制尺寸排阻色谱柱（SEC）的制备
		<ol>
			<li>取一支玻璃色谱柱（长度：26 cm；直径：0.6 cm）（见材料表），清空内容物，清洗并灭菌。</li>
			<li>在色谱柱底部放置一个 60 µm 滤膜。</li>
			<li>用交联琼脂糖凝胶过滤基质填充色谱柱，形成直径为 0.6 cm、高度为 20 cm 的固定相。</li>
			<li>用 50 mL 经 0.20 µm 滤膜过滤的 PBS 冲洗固定相。如需后续使用，可于 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将重悬后的 EV 沉淀加样至 SEC 柱固定相顶部。</li>
		<li>在持续向固定相顶部添加经 0.20 µm 滤膜过滤的 PBS 以防止柱体干燥的同时，依次收集 20 个 250 µL 的组分。如有需要，将组分储存于 -20 °C。 
		注意：若需储存超过一周，建议在 -80 °C 下保存，以维持 EV 的完整性用于分子分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SEC 组分的基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱分析
	<ol>
		<li>按照第 2.2 节所述进行 EV 的分离。</li>
		<li>用 200 µL 肽段校准混合液（见材料表）重悬 EV 沉淀。</li>
		<li>按照第 2.2.1 至 2.2.3 节所述进行 EV 的收集。</li>
		<li>使用真空浓缩仪将组分完全干燥。</li>
		<li>用 10 µL 0.1% 三氟乙酸（TFA）重新溶解各组分。</li>
		<li>取 1 µL 重悬后的组分与 1 µL α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质混合，点样于 MALDI 抛光钢靶板上。</li>
		<li>使用 MALDI 质谱仪分析所有组分。</li>
		<li>使用专用软件分析所获得的质谱图（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞外囊泡（EVs）的表征
<ol>
	<li>纳米颗粒跟踪分析（NTA） 
	注意： NTA 分析使用纳米颗粒追踪分析仪进行（参见 材料表）和自动注射泵。
	<ol>
		<li>将步骤 2.2.3 中的每个 SEC 组分用 0.20 进行稀释（稀释倍数范围为 1:50 至 1:500） &#181;m 过滤的 PBS</li>
		<li>涡旋溶液以消除细胞外囊泡聚集体。</li>
		<li>将稀释后的溶液放入1 mL注射器中，并将注射器置于自动注射泵内。</li>
		<li>调节 相机设置 增益水平（3）和相机水平（13）</li>
		<li>点击 运行 并运行以下脚本。
		<ol>
			<li>将样品加载至分析室（灌注速率：1,000，持续15秒）。</li>
			<li>降低并稳定流速以进行视频录制（灌注速率为25，持续15秒）。连续采集三段60秒的颗粒流动视频。</li>
			<li>调整摄像头水平（13）和检测阈值（3），然后进行视频分析。点击 设置 | 确定 开始分析并点击 导出 分析完成后。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每次组分分析之间，用1 mL的0.20 &#181;m 过滤的 PBS</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电子显微镜（EM）分析
	<ol>
		<li>按照第2节所述分离EVs。 
		注意： 无需无菌条件。</li>
		<li>重复第3.1节以定量分析细胞外囊泡（EVs）。 
		注意： 仅使用阳性组分进行电子显微镜分析。</li>
		<li>使用50 kDa离心过滤器（参见 材料表) 以浓缩含有EV的SEC组分。</li>
		<li>将浓缩的EVs重悬于30 &#181;2% 多聚甲醛（PFA）溶液</li>
		<li>加入10 &#181;将样品的 L 加到覆有碳膜的铜网上。</li>
		<li>在湿润环境中孵育20分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.2.5 和 3.2.6，以确保样品在载网上充分吸附。</li>
		<li>将载网转移至含有1%戊二醛的PBS溶液中，室温下孵育5分钟。</li>
		<li>用超纯水洗涤样品数次。</li>
		<li>在冰上用4%醋酸铀酰和2%甲基纤维素（体积比1:9）的混合液对样品进行反差染色10分钟。用滤纸吸除多余的混合液。</li>
		<li>干燥样品，并在200 kV下使用透射电子显微镜观察（参见 材料列表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western印迹分析
	<ol>
		<li>蛋白质提取
		<ol>
			<li>重复步骤 3.2.1 至 3.2.3，以分离和浓缩 EVs。</li>
			<li>混合 50 &#181;L of RIPA缓冲液（150 mM 氯化钠 [NaCl]，50 mM Tris，5 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 [EGTA]）&#8242;，N&#8242;四乙酸[EGTA]，2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]，100 mM 氟化钠[NaF]，10 mM 焦磷酸钠，1% Nonidet P-40，1 mM 苯甲基磺酰氟[PMSF]，1×蛋白酶抑制剂）与EV样本（25 &#181;在冰上孵育5分钟以提取蛋白质（由滤膜上浓缩的EV导致的L）。</li>
			<li>在冰上以500 W振幅、20 kHz频率超声处理5秒，重复3次。</li>
			<li>通过20,000 x g离心去除囊泡状碎片 g 4℃下，10分钟 &#176;C.</li>
			<li>收集上清液，采用Bradford蛋白测定法测定蛋白浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与蛋白质印迹法
		<ol>
			<li>混合蛋白提取物（30 &#181;g) 加入5倍体积的Laemmli上样缓冲液（v/v）。</li>
			<li>将蛋白质混合物上样至12%聚丙烯酰胺凝胶中。</li>
			<li>使用TGS缓冲液（25 mM Tris pH 8.5，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS），在70 V电压下电泳15分钟，随后在120 V电压下电泳45分钟，使凝胶中的蛋白质迁移。</li>
			<li>使用半干式转膜系统在230 V条件下将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，持续30分钟。</li>
			<li>室温下用封闭液（0.05% Tween 20 w/v，5% 脱脂奶粉 w/v 溶于 0.1 M PBS，pH 7.4）孵育膜 1 小时。</li>
			<li>4℃下孵育膜过夜 &#176;用封闭缓冲液按1:100稀释的小鼠单克隆抗人热休克蛋白90（HSP90）抗体在C中孵育。</li>
			<li>用 PBS-Tween（PBS，0.05% Tween 20 w/v）洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。</li>
			<li>在室温下用封闭缓冲液按1:10,000比例稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗孵育膜1小时。 
			注意： 使用二抗单独进行阴性对照实验。</li>
			<li>重复洗涤步骤（步骤 3.3.2.7）。</li>
			<li>使用增强型化学发光（ECL）Western印迹底物试剂盒显影膜（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质组学分析
	<ol>
		<li>蛋白质提取与凝胶内消化
		<ol>
			<li>重复步骤 3.2.1 至 3.2.3 以分离和浓缩 EVs。重复步骤 3.3.1 进行 EV 蛋白提取。</li>
			<li>在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质电泳迁移。</li>
			<li>在室温下用考马斯亮蓝固定凝胶中的蛋白质，持续20分钟。</li>
			<li>切除每块有色凝胶，并将其切成 1 mm 的小块3.</li>
			<li>依次用 300 &#181;每种溶液各 L：超纯水 15 分钟，100% 乙腈（ACN）15 分钟，100 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）4HCO3）15 分钟，乙腈：100 mM NH₄HCO₃4HCO3 (1:1，v/v) 溶液中孵育15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。</li>
			<li>使用真空浓缩仪将凝胶碎片完全干燥。</li>
			<li>使用100进行蛋白质还原 &#181;100 mM NH₄L4HCO3 含10 mM二硫苏糖醇，56℃孵育1小时&#176;C.</li>
			<li>使用100进行蛋白质烷基化处理 &#181;100 mM NH₄⁺ 的 L4HCO3 含 50 mM 碘乙酰胺，室温避光孵育 45 分钟。</li>
			<li>依次用 300 &#181;每种溶液的体积：100 mM NH₄HCO₃ 溶液4HCO3 15 分钟，乙腈：20 mM NH₄HCO₃4HCO3 (1:1，v/v) 溶液中搅拌反应15分钟，再用100%乙腈处理5分钟，持续搅拌。</li>
			<li>使用真空浓缩仪将凝胶小块完全干燥。</li>
			<li>使用50进行蛋白质消化 &#181;胰蛋白酶（12.5 L） &#181;g/mL）于 20 mM NH4HCO3 37℃过夜 &#176;C.</li>
			<li>从凝胶中用50提取消化后的蛋白质 &#181;37℃下用100%乙腈处理30分钟 &#176;C，然后在室温下持续搅拌15分钟。</li>
			<li>重复以下提取步骤两次：50 &#181;20 mM NH₄OAc 溶液中的 5% TFA4HCO3 持续搅拌下孵育20分钟。</li>
			<li>加入100 &#181;100%乙腈（ACN）中搅拌10分钟。</li>
			<li>用真空浓缩仪将消化后的蛋白质干燥，并重悬于20 &#181;0.1% TFA 的 L</li>
			<li>使用10脱盐样品 &#181;L型移液器吸头，内含C18反相介质，用于肽段的脱盐与浓缩（参见 材料表) 并用乙腈:0.1% 甲酸（FA）（80:20, v/v）洗脱肽段。</li>
			<li>使用真空浓缩仪将样品完全干燥，并重悬于20 &#181;用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的乙腈：0.1% 甲酸溶液（2:98，v/v）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>LC-MS/MS 分析
		<ol>
			<li>将消化后的肽段上样至液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仪器，并依据 elsewhere 详细描述的参数进行样品分析和数据处理42.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>原始数据分析
		<ol>
			<li>使用定量蛋白质组学软件包和标准参数处理质谱数据，以鉴定蛋白质，并比较各样本中鉴定出的蛋白质。</li>
			<li>使用标准参数，在预测蛋白质网络和生物过程的软件中导出EV阳性样本中特有且富集的蛋白质列表。</li>
			<li>将各组分中鉴定出的蛋白质列表与 Exocarta 开放获取数据库中的前 100 种细胞外囊泡标志物进行比较（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 外泌体功能效应检测
<ol>
	<li>PC-12 细胞系的神经突生长实验
	<ol>
		<li>在完全 DMEM 培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、10% 无外泌体胎马血清（FHS）、5% 无外泌体胎牛血清（FBS）、100 UI/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素）中培养 PC12 细胞系。 
		注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。</li>
		<li>将盖玻片（所有孔）放入 24 孔板中，用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）包被，并以每孔 260,000 个细胞接种。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞。</li>
		<li>培养 24 小时后，更换为 DMEM 分化培养基（含 2 mM L-谷氨酰胺、0.1% FHS、100 UI/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素），并加入 1 × 106 个小胶质细胞外泌体（来自步骤 1.1.2）。 
		注意：对照组在分化培养基中不添加小胶质细胞外泌体。</li>
		<li>接种后第 4 天，向所有孔中加入 100 µL 完全 DMEM 培养基。</li>
		<li>接种后第 7 天，用 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 20 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>用罗丹明标记的鬼笔环肽在 4 °C 下染色 30 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>用稀释的 Hoechst 33342（1:10,000）在室温下染色 30 分钟，并用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>使用荧光封片剂将盖玻片封固于载玻片上（参见 材料表）。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜观察载玻片，并对每张载玻片随机采集 5 张图像。</li>
		<li>使用自动定量软件（总神经突长度）测量神经突生长，具体方法详见 elsewhere43。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠原代神经元的神经突生长实验
	<ol>
		<li>用聚-D-赖氨酸（0.1 mg/mL）和层粘连蛋白（20 µg/mL）包被 8 孔玻璃载片。</li>
		<li>将商品化的大鼠原代神经元接种于适当的培养基中（参见 材料表），每孔接种 50,000 个细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。 
		注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。</li>
		<li>向神经元培养基中加入 1 × 106 个小胶质细胞外泌体，继续在 37 °C、5% CO2 条件下培养 48 小时。 
		注意：对照组在神经元培养基中不添加小胶质细胞外泌体。</li>
		<li>按照步骤 4.1.6 至 4.1.9 固定并染色细胞。</li>
		<li>按照步骤 4.1.10 和 4.1.11 分析载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胶质瘤细胞侵袭实验
	<ol>
		<li>将 C6 大鼠胶质瘤细胞重悬于含 5% 胶原的完全 DMEM 培养基（含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1× 抗生素）中，终浓度为每 20 µL 含 8,000 个细胞。 
		注意：整个实验过程中所用血清均为无外泌体血清。</li>
		<li>在 60 mm 组织培养皿底部加入 5 mL PBS。将皿盖倒置，并将 20 µL（含 8,000 个细胞）细胞悬液滴加至皿盖底部。</li>
		<li>将皿盖倒扣于盛有 PBS 的底部培养室上，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 72 小时，直至形成细胞球体。</li>
		<li>将 1 × 108 个巨噬细胞外泌体（来自步骤 1.2.2）加入 2.2 mg/mL 的胶原混合液中（由 2 mL 牛 I 型胶原溶液 [3 mg/mL]、250 µL 10× 最小必需培养基（MEM）和 500 µL 0.1 M 氢氧化钠组成）。 
		注意：对照组在胶原混合液中不添加巨噬细胞外泌体。</li>
		<li>将含外泌体的胶原混合液分配至 24 孔板中，用于包埋细胞球体。</li>
		<li>将新形成的细胞球体植入每孔中央。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟，使凝胶固化。</li>
		<li>随后，向每孔胶原基质上覆盖 400 µL 完全 DMEM 培养基。</li>
		<li>将整个体系在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养共 6 天。 
		注意：使用倒置光学显微镜配备 4x/0.10 N.A. 物镜，通过数字摄影监测细胞从球体向外侵袭的情况。</li>
		<li>每天采集每孔的图像。</li>
		<li>使用软件处理图像，并如前所述详细方法42定量分析细胞球体的侵袭面积。 
		注意：每天的侵袭面积和球体面积均以第 0 天测得的侵袭面积和球体面积进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+early+brain+development%3A+An+intimate+journey%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microglia and early brain development: An intimate journey.</a> Science. 362 (6411), 185-189 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

中枢神经系统（CNS）是一种复杂的组织，其细胞间的通讯调控着维持稳态所必需的正常神经元功能30。目前，细胞外囊泡（EVs）被广泛研究，并被认为是介导细胞间通讯的重要分子载体31。EVs 可特异性地将多种介质递送至受体细胞，从而在生理和病理条件下影响其功能32。近期研究表明，EVs 在中枢神经系统中发挥关键作用24,33,34，尤其是来源于脑内免疫细胞的 EVs35,36。促炎与抗炎免疫反应之间的平衡至关重要，它有助于在突触发育及终生神经元活动中维持脑组织的完整性。本研究探讨了两种不同的免疫反应情境：（i）小胶质细胞与神经元之间的关系，以及（ii）浸润性巨噬细胞与胶质瘤细胞之间的关系。首先，小胶质...

许多神经病理学疾病与神经炎症状态相关，这是一种复杂的机制，尽管日益受到关注，但由于免疫过程具有多样性且依赖于细胞环境，目前仍知之甚少。事实上，中枢神经系统（CNS）疾病并不总是涉及相同的激活信号和免疫细胞群体，因此难以评估促炎或抗炎反应是病理的起因还是结果。被称为“小胶质细胞”的脑内常驻巨噬细胞似乎处于神经系统与免疫系统之间的交界面1。小胶质细胞起源于髓系，在原始造血过程中由卵黄囊产生并定植于大脑；而外周巨噬细胞则在定型造血期间由胎肝发育而来，最终成为外周巨噬细胞2。小胶质细胞可与神经元以及神经元来源的胶质细胞（如星形胶质细胞和少突胶质细胞）进行通讯3。近年来多项研究表明，小胶质细胞不仅参与中枢神经系统发育过程中的神经可塑性及成年组织稳态维持，也参与与神经退行性疾病相关的炎症状态4,5。此外，在其他中枢神经系统疾病中，血脑屏障的完整性可能受到破坏。特别是在多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme）等癌症中，免疫反应不仅仅由小胶质细胞介导，因为血脑屏障通过血管生成过程以及淋巴管的存在而发生重构6,7。因此，大量骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）通过肿瘤依赖性的血管生成机制浸润至脑肿瘤组织中8。肿瘤细胞显著影响浸润的BMDMs，使其获得免疫抑制特性并促进肿瘤生长9。因此，由于免疫细胞的来源和激活信号具有异质性，免疫细胞与其脑内微环境之间的相互作用仍难以理解10,11。因此，研究免疫细胞相关分子特征在生理条件下的功能具有重要意义。在此背景下，可通过细胞释放的细胞外囊泡（EVs）来研究免疫细胞与其微环境之间的细胞间通讯。
在健康状态和病理状态下，细胞外囊泡（EVs）在免疫功能调控中的作用正受到越来越多的关注12,13。其中可考虑两类主要群体：外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles）。这两者在生物发生机制和尺寸范围上有所不同。外泌体是直径约为30–150 nm的囊泡，由内体系统产生，并在多泡体（MVBs）与细胞质膜融合时释放。微囊泡的直径约为100–1,000 nm，通过细胞质膜向外出芽的方式生成14。由于目前仍难以根据大小和分子特征明确区分外泌体与微囊泡，因此本报告中统一使用“EVs”这一术语。中枢神经系统（CNS）中与EVs相关的细胞间通讯是一种古老的机制，已有研究显示其在无脊椎动物（如线虫、昆虫和环节动物）中亦存在15,16。此外，研究结果表明EVs能够介导不同物种细胞之间的通讯，说明该机制类似于“钥匙-锁”系统，首先依赖于囊泡与靶细胞之间表面分子的识别，进而实现信号分子的摄取16,17。事实上，EVs含有多种分子，包括蛋白质（如酶类、信号转导分子、生物发生因子）、脂质（如神经酰胺、胆固醇）和核酸（如DNA、mRNA或miRNA），这些分子可作为受体细胞活动的直接或间接调节因子14。正因如此，已有方法学研究针对免疫细胞开展，旨在分离EVs并全面表征其蛋白质特征18,19。
早期研究证明，原代培养的大鼠小胶质细胞在Wnt3a或5-羟色胺依赖性激活后，可诱导释放外泌体20,21。在中枢神经系统（CNS）中，小胶质细胞来源的细胞外囊泡（EVs）通过调节神经元突触前末梢的突触囊泡释放，参与调控神经元兴奋性22,23。小胶质细胞来源的EVs还可在大脑广泛区域传播由细胞因子介导的炎症反应24,25。重要的是，Toll样受体家族的多种配体可能激活小胶质细胞中特定类型的EVs产生26。例如，体外研究表明，脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞BV2细胞系可产生包含促炎性细胞因子在内的不同EV内容物27。因此，可通过分析中枢神经系统中免疫细胞亚群（包括小胶质细胞和浸润的骨髓来源巨噬细胞BMDMs）各自释放的EV群体，及其对受体细胞的影响和EV内容物的特征，来评估这些细胞亚群的功能多样性。
我们此前已描述了在分离小胶质细胞和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）来源的细胞外囊泡（EV）后，评估其功能特性的方法16,19。在本报告中，我们拟分别评估小胶质细胞来源EV对神经突生长的影响，以及巨噬细胞来源EV对胶质瘤细胞聚集体的调控作用。本研究还拟对EV组分进行广泛的蛋白质组学分析，以验证EV分离流程，并鉴定具有生物学活性的蛋白质特征。EV的有益效应及其内容物的分子解析，可能有助于未来对EV进行改造，并将其作为脑部疾病治疗剂加以应用。

<table><tbody><tr><td>12% Mini-PROTEAN&amp;nbsp;TGX 预制蛋白凝胶</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>4561045EDU</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A955-1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa 离心滤膜</td><td>默克</td><td>UFC505024</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HSP90 &amp;alpha;/&amp;beta; 抗体（RRID: AB_675659）</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-13119</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B27 Plus 添加剂</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BenchMixer V2 旋涡混合器</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1003</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液（Bradford）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>5000006</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>C18 ZipTips</td><td>默克密理博</td><td>ZTC18S096</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>C6 大鼠胶质瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-107</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>标准管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5804000010</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM880</td><td>卡尔·蔡司</td><td>LSM880</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 液相色谱仪</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电子显微镜 JEM-2100</td><td>JEOL</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Exo-FBS</td><td>Ozyme</td><td>EXO-FBS-50A-1</td><td>无外泌体胎牛血清</td></tr><tr><td>ExoCarta数据库（Evs的前100种蛋白质）</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>http://www.exocarta.org/</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎马血清</td><td>Biowest</td><td>S0960-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Q500 超声波破碎仪（探头式）</td><td>Fisherbrand</td><td>12893543</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FlexAnalysis</td><td>布鲁克尔</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>荧光封片剂</td><td>安捷伦</td><td>S3023</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Formvar-碳支持膜铜网</td><td>Agar scientific有限公司</td><td>AGS162-3</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Euromedex</td><td>17535-AAT</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>InstantBlue 考马斯亮蓝蛋白质染色液</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>倒置光学显微镜 CKX53</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LabTek II 8 孔板</td><td>&amp;nbsp;Nunc</td><td>154534</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Laemmli 2x</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610737</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>康宁</td><td>354232</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MaxQuant 软件（蛋白质鉴定软件）</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>https://maxquant.net/maxquant/</td></tr><tr><td>MBT 波兰星状体</td><td>布鲁克尔</td><td>8268711</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MEM 10x</td><td>Gibco</td><td>21090-022</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6385-100G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MiliQ 水</td><td>默克密理博</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛奶</td><td>Regilait</td><td>REGILAIT300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini PROTEAN 垂直电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MonoP FPLC 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>&amp;nbsp;</td><td>不再提供</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>马尔文帕纳科</td><td>NS300</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NanoSight NTA 软件 v3.2</td><td>马尔文帕纳科</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NanoSight 注射泵</td><td>马尔文帕纳科</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Fluka</td><td>56741</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 24孔多孔培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>82.1473</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学</td><td>15713</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PC-12 细胞系</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1721</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肽段校准混合物</td><td>LaserBio Labs</td><td>C101</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>115-035-003</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Perseus 软件（已鉴定蛋白质的处理）</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-四甲基罗丹明偶联物</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-362065</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14190094</td><td>无钙，无镁</td></tr><tr><td>pluriStrainer M/60 &amp;micro;m</td><td>pluriSelect</td><td>43-50060</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>聚碳酸酯离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>355651</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830-20TAB</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol</td><td>细胞系统</td><td>5005</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Q-Exactive 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rapifleX 质谱仪</td><td>布鲁克尔</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大鼠皮层神经元</td><td>细胞应用</td><td>R882N-20</td><td>细胞来源：源自第18天胚胎Sprague Dawley大鼠脑的大脑皮层</td></tr><tr><td>大鼠巨噬细胞 &amp;和小胶质细胞培养基</td><td>细胞应用</td><td>R620K-100</td><td>细胞来源：正常健康大鼠骨髓</td></tr><tr><td>大鼠原代巨噬细胞</td><td>细胞应用</td><td>R8818-10a</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>大鼠原代小胶质细胞</td><td>Lonza</td><td>RG535</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Dustsher</td><td>100204</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Scharlau</td><td>SO0227</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920-100G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Scharlab</td><td>SO0420005P</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6422-100G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>STRING 软件（功能蛋白关联网络）</td><td>&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;</td><td>https://string-db.org/</td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura 延长作用时间底物</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.0 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>8SS01H1</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD 半干式转印槽</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1703940</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Interchim</td><td>UP031657</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸</td><td>Euromedex</td><td>EU0550</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A95765</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心机转子 70.1 Ti</td><td>贝克曼库尔特</td><td>342184</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Agar Scientific Ltd</td><td>AGR1260A</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10347510</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020-25G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

中枢神经系统（CNS）的神经炎症状态在生理和病理条件下均发挥关键作用。小胶质细胞作为脑内的常驻免疫细胞，有时还包括浸润的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），可调控其在中枢神经系统中微环境的炎症特征。目前公认，免疫细胞释放的细胞外囊泡（EV）群体可作为免疫介质发挥作用。因此，分离和纯化这些囊泡不仅有助于鉴定其内容物，还可评估其对受体细胞的生物学效应。本文数据强调了从小胶质细胞或血液巨噬细胞中分离EV所需的时间流程，包括超速离心和尺寸排阻色谱（SEC）步骤。非靶向蛋白质组学分析可用于验证EV标志物的蛋白特征，并表征具有生物活性的EV内容物。此外，小胶质细胞来源的EV在原代神经元培养中被功能性地用于评估其作为免疫介质在神经突起生长中的重要性。结果显示，小胶质细胞来源的EV可在体外促进神经突起的生长。同时，血液巨噬细胞来源的EV在C6胶质瘤细胞球状体培养中被用作免疫介质，结果表明这些EV可在体外调控胶质瘤细胞的侵袭行为。本研究强调了评估EV介导的免疫细胞功能的可能性，同时有助于理解此类细胞间通讯的分子基础。这一解析过程有望推动天然囊泡的应用，或促进体外制备治疗性囊泡，以模拟中枢神经系统疾病微环境中的免疫特性。

将生物效应归因于细胞外囊泡（EVs）的主要挑战之一，是能够从完整的培养基中分离出EVs。本报告中，我们介绍了一种结合超速离心（UC）和尺寸排阻色谱（SEC）的方法，并将其与大规模蛋白质特征分析相结合，以验证EV标志物并鉴定生物活性化合物。巨噬细胞或小胶质细胞来源的EVs分别从培养24小时或48小时后的条件培养基中分离获得（图1）。
<img alt="用于细胞外囊泡分离的尺寸排阻色谱示意图；纳米颗粒分析装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60118/60118fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：细胞外囊泡（EV）的收集与分离策略。 通过连续离心步骤，将凋亡小体和细胞碎片从小胶质细胞或巨噬细胞条件培养基中分离。从上清液中通过超速离心（UC）分离EV。将含有EV的UC沉淀加载到...

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。

中枢神经系统（CNS）的神经炎症状态在生理和病理条件下均发挥关键作用。小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻...

该方案能够有效保证细胞外囊泡的高质量分离，并检测到更多EBDF蛋白。与其他分离技术相比，该方法能更好地保持细胞外囊泡的完整性及其生物学活性。目前，细胞外囊泡在肺癌以及各种病理条件下的研究日益增多。该方法可应用于我们选择的任何用于表征和研究细胞外囊泡（EVs）的系统。在处理EVs时，特别是涉及细胞培养的后续实验中，必须对相关内容及生物伦理问题给予特别关注。对特定设备的可视化演示至关重要，例如自制的尺寸排阻色谱柱，以及纳米颗粒计数器和质谱仪的使用。来自实验室的Antonella Raffo-Romero将协助演示该实验步骤。首先从条件培养基中预先分离细胞外囊泡（EVs）。将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基转移至锥形管中，在1,200 ×g条件下离心10分钟，以沉淀细胞。将上清液转移至新的锥形管中，再离心20分钟，以去除凋亡小体。然后将上清液转移至10.4毫升的聚碳酸酯管中。将管子放入70.1 TI转子中，在4°C条件下以100,000 ×g超速离心90分钟，使细胞外囊泡（EVs）沉淀。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL经0.2 µm滤膜过滤的PBS中。为分离EVs，通过清洗并灭菌玻璃层析柱，并在底部放置一个60 µL滤器，自制尺寸排阻层析柱；然后用交联琼脂糖凝胶过滤基质填充层析柱，制备成直径0.6 cm、高20 cm的固定相。然后用 50 毫升 0.2 微米滤过的 PBS 冲洗该相。如有需要，可将层析柱于 4 摄氏度保存以备后续使用。将重悬的 EV 沉淀加至固定相顶部，并在持续向固定相顶部添加 PBS 的同时，收集 20 个连续的 250 微升组分。各组分可在零下20摄氏度保存。为进行纳米颗粒追踪分析，用0.2微米滤膜过滤的PBS对每份组分进行稀释，并涡旋震荡以消除聚集体。将溶液装入1毫升注射器中，并将其放入自动注射泵内。接下来，将相机设置调整至适当的屏幕增益水平和相机水平，然后点击“运行”。以1000的输注速率将样品注入分析室，持续15秒。随后降低流速并稳定流速，以进行视频记录，输注速率调整为25，持续15秒。连续采集三段每段60秒的颗粒流动视频。然后在视频分析前调整相机水平和检测阈值。点击“设置”中的“确定”开始分析，分析完成后点击“导出”。每次组分之间用一毫升0.2微米过滤的PBS冲洗系统。若进行透射电子显微镜分析，使用50千道尔顿的离心滤膜浓缩目标尺寸排阻色谱组分。进行蛋白质提取时，将50微升RIPA裂解液与EV样品在冰上混合5分钟。将样品以500瓦特、20千赫兹超声处理三次，每次五秒。然后在4摄氏度下以20,000 ×g离心10分钟，去除囊泡碎片。蛋白质分离后，在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质迁移。在室温下将凝胶中的蛋白质与考马斯亮蓝混合染色20分钟。然后切下每块有颜色的凝胶，并将其切成小块。按照文稿中的描述，对凝胶小块进行

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响

本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。...

从完整组织中提取细胞外囊泡

体内 肿瘤来源细胞外囊泡的免疫原性筛选：通过脾脏T细胞流式细胞术分析

直接随机光学重建显微镜（dSTORM）可用于突破光学显微镜的典型衍射极限，从而在纳米尺度下观察外泌体。该技术可在二维和三维条件下用于外泌体的表征。...

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

本方案描述了通过差速离心法从培养的人源间充质干细胞（MSCs）中分离和表征典型细胞外囊泡（EVs，包括外泌体和微囊泡）的方法。本文还介绍了这些细胞外囊泡的进一步应用。...

从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。...

低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）作为癌症生物治疗剂具有广阔的应用前景。本研究基于方法学，提出了一种可放大的封闭式生物制造工艺流程，旨在持续生产并分离出大量高纯度的NK-EVs。在整个生物制造过程中进行过程控制检测，确保所获得的EVs符合产品放行的质量标准。...

可扩展的生物制造工艺流程用于生产与分离自然杀伤细胞来源的基于细胞外囊泡的癌症生物治疗剂

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

该方案利用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，可视化并定量脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的分泌，并展示其被前体细胞摄取的过程，揭示了脂肪组织内的一种旁分泌通路。...

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

偏头痛及其向慢性偏头痛的转化是重大的医疗负担，亟需更有效的治疗方案。我们致力于阐明神经免疫信号如何调节偏头痛的易感性，通过体外建模 体外...

使用扩散性抑制建模发作性与慢性偏头痛的神经免疫信号传导 体外

学习从免疫细胞分离细胞外囊泡的方法，用于研究神经突起生长和胶质瘤细胞侵袭调控。该技术结合超速离心和尺寸排阻色谱，为神经免疫相互作用研究提供可靠方案。

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

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