Name: Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a dirigir fármacos a macrófagos de larvas de pez cebra mediante liposomas cargados con drogas y microinyección. Este método permite evaluar funciones inmunitarias y estudiar mecanismos inflamatorios in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a C.J.H. (Consejo de Investigación de la Salud de Nueva Zelanda y Fondo Marsden, Royal Society of New Zealand) y Z.W. (Faculty Research Development Fund de la Universidad de Auckland). Los autores agradecen a Alhad Mahagaonkar por la gestión experta de las instalaciones de pez cebra, la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas, la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland por su ayuda con las imágenes confocales y Graham Lieschke por regalar la línea de reporteros Tg(mpeg1:EGFP).

1. Preparación de liposomas con etiqueta azul Marina con carga farmacológica
NOTA: Los liposomas que llevan el tinte fluorescente azul, Marina Blue y el medicamento se preparan utilizando un método de hidratación de película delgada con la inserción posterior del poloxámero 188. Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Los liposomas de control solo llevan marina azul y PBS. El ejemplo aquí describe la carga de liposomas con un fármaco antioxidante dirigido a las mitocondrias25 que se utiliza en los resultados representativos como prueba de concepto.
<ol><li>Para preparar liposomas, disolver 16,4 mg (22,2 émol) de los fosfolípidos 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (ver Tabla de Materiales),4.3 colesterol mg (11,1 émol) (ver Tabla de Materiales) y 2,8 mg (3,7 omol) 1,2-diseteroyl-sn-glicero-3-fosfocolina (ver Tabla de Materiales, en 3 ml de cloroformo:metanol (3:1 v/v) en un matraz de fondo redondo de 25 ml.</li>
	<li>A la mezcla anterior, añadir 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoethanolamine (ver Tabla de Materiales)y 300 nmol de un fármaco inhibidor de mROS (ver Tabla de Materiales)y sonicar brevemente para disolver completamente. Para los liposomas de control, sólo añadir Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoetanolamina. NOTA: Para evitar el fotoblanqueo del colorfluorescente sensible Marina Blue, proteja todos los procedimientos de la luz, siempre que sea posible. Esto también es importante si el medicamento a cargar es sensible a la luz.</li>
	<li>Retire el disolvente lentamente sobre un evaporador rotatorio (ver Tabla de Materiales)sobre un baño de agua con temperatura controlada ajustado a 45 oC girando a 75 rpm bajo presión de vacío (200 mbar durante 15 min y luego 0 mbar durante 20 min). Esto forma una película lipídica delgada seca dentro de las paredes de vidrio del matraz que se seca aún más durante 45 minutos bajo N2 para facilitar la eliminación completa del disolvente orgánico.</li>
	<li>Después de la formación de la película delgada, ajuste la presión de vacío a 40 mbar durante 15 minutos, luego purgue con gas nitrógeno durante 30 minutos para asegurar la eliminación del disolvente residuo.</li>
	<li>Hidratar la película delgada usando 1 ml de solución salina con fosfato (PBS, pH 7.4) y sellar con parafilm antes de agitar el matraz usando un evaporador rotativo sobre un baño de agua de 60 oC durante 20 minutos para formar vesículas.</li>
	<li>Sujeto la suspensión hidratada a 7 ciclos de congelación y descongelación por congelación en líquido N2 durante 3 min seguido de inmersión en un baño de agua de 45oC durante 7 min.</li>
	<li>Extruir liposomas a través de una membrana utilizando un mini-extrusor (ver Tabla de Materiales)y membranas de policarbonato grabado en pista de 1,0 m (ver Tabla de Materiales)para 2-6 ciclos con el fin de obtener grandes vesículas unilamelares. NOTA: Con el fin de lograr una orientación más favorable hacia los macrófagos, manipule los ciclos de extrusión hasta que el diámetro de los liposomas sea de aproximadamente 1 m26,27,28.</li>
	<li>Condensar los liposomas frescos en un pellet por ultracentrifugación a 186.000 x g e incubar con 1 ml de 1% de poloxámero 188 (ver Tabla de Materiales) solución (10 mg/ml en PBS) a 45 oC y 750 rpm durante 30 min utilizando un termomezclador con un tubo de microcentrúgila de 2 ml (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Ultracentrifur la mezcla a 186.000 x g durante 1 h a 4 oC y retirar el sobrenadante para eliminar cualquier polímero o medicamento no unido. Almacenar los gránulos liposomas a 4oC, protegidos de la luz.</li>
</ol>2. Caracterización del tamaño del liposoma y el potencial Zeta
<ol><li>Diluir la formulación de liposomas con agua ultrapura (1:100) y medir el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta de los liposomas utilizando un analizador dinámico de dispersión de luz (ver Tabla de Materiales),en triplicado a 25oC. NOTA: El PDI es una medida de la distribución del tamaño de la población de nanopartículas. Los valores PDI < 0.05 indican una distribución más uniforme, mientras que los valores más cercanos a 1 indican una distribución de mayor tamaño. El potencial zeta es la carga general de la superficie.</li>
</ol>3. Cálculo de la eficiencia del atrapamiento y la carga de fármacos en liposomas
NOTA: Para determinar la eficiencia de atrapamiento de fármacos en liposomas, se mide el contenido de fármacos contenidos en el pellet sobrenadante y liposoma.
<ol><li>Resuspenda el pellet de liposomas en 1 ml de PBS.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, diluya 10 x con agua ultrapura y analice mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).</li>
	<li>Para determinar la concentración de fármacos dentro de los liposomas, añadir 100 l de suspensión de liposomas a 900 l de solución de 10% triton-X100 (para destruir la membrana lipídica, liberar el fármaco atrapado y prevenir la acumulación de lípidos dentro de la columna HPLC) y vórtice durante 3 minutos antes del análisis.</li>
	<li>Inyectar 20 ml de muestra en un sistema HPLC que consiste en una bomba cuaternaria, un termomuestreador automático de termostato y una columna de 3 mm de 250 x 4,6 mm. Ajuste la velocidad de flujo de fase móvil (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrilo y metanol (30:40:30, v/v/v)) a 0,9 ml/min y obtenga perfiles espectrales utilizando un detector de matriz de diodos de 230 mM.</li>
	<li>Calcule la eficiencia de atrapamiento (EE) y la carga de fármacos (DL) utilizando las siguientes ecuaciones: EE (%) á [Yo / Mt] x 100 DL (%) á [Me / Mlip] x 100 Donde Me es la masa de fármaco encapsulado, Mt es la masa total de la droga utilizada durante la formulación y Mlip es la masa total de los lípidos (incluyendo el colesterol) y la droga encapsulada.</li>
</ol>4. Preparación e inyección de liposomas
<ol><li>Preparar agujas de microinyección de borosilicato insertando un capilar de vidrio de borosilicato de pared delgada (1 mm D.O. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de longitud) en un dispositivo de extracción de micropipeta (ver Tabla de materiales)con los siguientes ajustes genéricos de extracción (calor 680, tire 75, velocidad 40, tiempo 55 y presión 530) para producir una aguja de microinyección cónica.</li>
	<li>Coloque las agujas en una placa Petri sobre la arcilla de modelado y coloque de una manera que el extremo tirado no toque la parte inferior del plato. Mantenga la tapa del plato Petri cerrada para evitar la contaminación por polvo hasta que esté lista para su uso.</li>
	<li>Diluir las formulaciones de liposomas recién preparados 1:1 en PBS estéril (pH 7.4) y brevemente vórtice (2-3 s) para mezclar. NOTA: Proteja los liposomas de la luz hasta que las larvas estén listas para la microinyección.</li>
	<li>Establecer parejas adultas de cría de peces cebra la noche anterior y recoger embriones como se describió anteriormente por Rosen et al.29.</li>
	<li>Transfiera los embriones a una placa Petri (estilo 100 mm x 20 mm con aproximadamente 60 embriones por plato) que contenga un medio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4)complementado con 0,1% de azul de metileno para inhibir el crecimiento de hongos. Retirar todos los embriones muertos o no fecundados e incubar durante la noche a 28,5 oC.</li>
	<li>Para facilitar la toma de imágenes en vivo, añada 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) al medio E3 cuando los embriones alcancen las 24 horas de desarrollo para prevenir la formación de pigmentos (melanización).</li>
	<li>Decorionar manualmente los embriones a aproximadamente 30 h después de la fertilización (hpf) utilizando fórceps de punta fina. NOTA: No utilice tratamiento enzimático para desicoquinizar embriones, ya que esto puede causar daño epitelial e inflamación local, lo que influye en los estudios inmunológicos</li>
	<li>Dejar que los embriones se desarrollen a 28,5 oC hasta los 2 días posteriores a la fertilización (dpf).</li>
	<li>Preparar una placa de inyección vertiendo suficiente 3% de celulosa metil (en soporte E3) en la tapa de un pequeño plato de cultivo de 35 mm para formar una película delgada que cubra toda la superficie. NOTA: Al preparar 3% de celulosa metilenente en medios E3, la celulosa metilo tarda varios días en disolverse con agitación suave en un agitador orbital.</li>
	<li>Anestetiza las larvas incubando en medios E3 complementado con 200 g/ml de Tricaína.</li>
	<li>Recoger un grupo de aproximadamente 20-25 larvas utilizando una pipeta de transferencia de plástico y permitir que los embriones se concentren en la punta de la pipeta por gravedad. Teniendo cuidado de transferir las larvas con un líquido mínimo, colóquelas en el medio de la tapa del plato de cultivo de 35 mm.</li>
	<li>Usando un cargador microcapilar, organizar las larvas de las siguientes maneras: anterior hacia la parte superior de la placa de inyección con la superficie dorsal mirando hacia la aguja de microinyección, para inyectar en el ventrículo del cerebro trasero(Figura 2A-D); o, anterior a la izquierda de la placa de inyección (cuando se inyecta desde la derecha) con la superficie ventral mirando hacia la aguja de microinyección para inyectar en el venoso sinusal(Figura 2I). NOTA: Cuando se inyecta de esta manera, se pueden apuntar a los macrófagos residentes en ventrículos hindbrain(Figura 2E)y tejido hematopoyético caudal (CHT)(Figura 2J),respectivamente. La región CHT de pez cebra larvario es un sitio hematopoyético análogo al hígado fetal de los mamíferos. Preste especial atención a no dañar los embriones durante la organización, ya que esto puede causar inflamación local que influye así en los estudios inmunológicos.</li>
	<li>Tomar liposomas recién preparados (del paso 4.3) y llenar una aguja de inyección con aproximadamente 5 ol de la mezcla de inyección de liposomas utilizando un cargador microcapilar (ver Tabla de Materiales). NOTA: Al evaluar la localización de liposomas en los compartimentos fagolysososomal de los macrófagos(Figura 2H),complementar esta mezcla de inyección con 200 g/ml de un marcador fluorescente rojo de fagosomas (ver Tabla de Materiales)y 100 nM de un marcador fluorescente de color rojo lejano de los lisosomas (ver Tabla de Materiales)para marcar los fagosomas30,31 y los sisomas32,respectivamente.</li>
	<li>Monte la aguja en un micromanipulador (ver Tabla de Materiales)conectado a un soporte magnético y a un inyector de presión (ver Tabla de Materiales). Coloque bajo un estereomicroscopio y ajuste el inyector a una duración de pulso de aproximadamente 50 ms y una presión de inyección de aproximadamente 40 psi.</li>
	<li>Corte la punta de la aguja de microinyección con fórceps limpios de punta fina para generar una abertura de aproximadamente 5 m de diámetro.</li>
	<li>Calibre el volumen a inyectar inyectando un bolo en una gota de aceite mineral colocada sobre las líneas de la rejilla de un hemocitómetro. Ajuste la duración del pulso y/o la presión de inyección hasta que el diámetro del bolo cubra 2,5 de las líneas de rejilla más pequeñas (esto corresponde a un volumen de aproximadamente 1 nL).</li>
	<li>Inyectar cuidadosamente 1 nL de la mezcla de inyección de liposoma en el ventrículo trasero de cada larva. NOTA: Al inyectar en el ventrículo del cerebro trasero, tenga cuidado de no penetrar demasiado ventralmente (más allá del cerebro trasero) ya que esto puede interrumpir la vasculatura subyacente que conduce a hemorragias. Al inyectar en el venoso sinusal, se debe tener cuidado para asegurarse de que la punta de la aguja está justo dentro del pericardio y no penetrar la yema.</li>
	<li>Después de la inyección, transfiera inmediatamente las larvas inyectadas de nuevo a los medios E3 añadiendo medios E3 a la placa de inyección y agitando suavemente las larvas fuera de la celulosa de metilo utilizando una pipeta de transferencia de plástico.</li>
	<li>Incubar las larvas a 28,5 oC (protegidas de la luz) hasta el análisis por imágenes confocales vivas.</li>
</ol>5. Imágenes confocales y análisis de imágenes para confirmar la segmentación de macrófagos de liposomas
<ol><li>Calentar un baño de agua a 50 oC.</li>
	<li>Las larvas inyectadas con liposomas anestetizas mediante la transferencia a una nueva placa Perti que contiene medios E3 complementados con 0,003% de PTU y 200 g/ml de tricaína.</li>
	<li>Preparar el medio de montaje de imágenes en vivo disolviendo 1% de agarosa de bajo punto de fusión en medios E3, complementado con 0.003% PTU, en un microondas. Colocar en el baño de agua y una vez que la solución se haya enfriado a 50 oC, añadir 200 g/ml de tricaína.</li>
	<li>Conservar el medio de montaje en el baño de agua de 50oC para evitar la polimerización prematura de la agarosa.</li>
	<li>Para tomar una imagen de la superficie dorsal del cerebro trasero en un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua(Figura 2E),incruste las larvas de la siguiente manera: Llene un plato de cultivo de 35 mm con el medio de montaje (a una profundidad de aproximadamente 5 mm) y déjelo polimerizar. Excava rinde una pequeña zanja en la agarosa que es de tamaño suficiente para acomodar el saco de yema.</li>
	<li>Llene una pipeta de transferencia de plástico con un medio de montaje fundido, expulse una pequeña cantidad y utilícela para recoger las larvas anestesiadas. Transfiera inmediatamente las larvas al plato de cultivo y oriente los sacos de yema, lado ventral hacia abajo, en los agujeros excavados, utilizando un cargador microcapilar. Manténgalos periódicamente en esta posición hasta que la agarosa se polimerice. Superposición con medios E3 complementados con 200 g/ml de tricaína. NOTA: Al transferir y colocar larvas, tenga cuidado de no causar daño epitelial e inflamación local que puede influir en los estudios inmunológicos. Para el posicionamiento de las larvas a la imagen viva de la región CHT(Figura 2J), montar como se describió anteriormente, pero colocar las larvas dentro del agujero excavado lateralmente.</li>
	<li>Al tomar imágenes en un microscopio confocal invertido, incruste las larvas, sin el lecho de agarosa, directamente en la parte inferior de un plato inferior de vidrio. Colóquelos en la superficie dorsal hacia abajo (o lateralmente) y después de la polimerización, cubra toda la superficie del plato con una capa uniforme de medio de montaje. Una vez polimerizado, añadir una capa delgada de medios E3 complementado con 200 g/ml de tricaína.</li>
	<li>Para ver en vivo el ventrículo hindbrain en un microscopio confocal, utilice los siguientes ajustes: 512 x 512 píxeles; 40 x 3 ám de z-pilas (que se extienden desde la superficie dorsal más dorsal del cerebro trasero); Objetivo 20x; Zoom de 2.5x. NOTA: Al comparar las intensidades de la señal entre muestras (por ejemplo, al tomar imágenes de la adopción de liposomas con etiqueta Marina Blue inyectados dentro de líneas de reportero que marcan macrófagos [Tg(mpeg1:EGFP)33] o neutrófilos [Tg(lyz:EGFP)34]),es esencial que la configuración del láser se mantenga igual (por ejemplo, diámetro del agujero, voltaje láser, desplazamiento y ganancia) para ayudar a asegurar que las diferencias no son un artefacto de ajustes alterados de adquisición de imágenes.</li>
	<li>Utilice el software de análisis de imágenes 3D para cuantificar la captura de macrófagos o neutrófilos de liposomas etiquetados por Marina Blue. Para cuantificar el número de células que contienen liposomas(Figura 2F) dentro de una pila Z, desplácese por las secciones Z individuales y cuente el número de células individuales que contienen liposomas etiquetados en azul marina. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia de los liposomas dentro de las células(Figura 2G),dibuje una región de interés alrededor de cada célula (en las dimensiones X, Y y Z) para cuantificar la intensidad total o media de fluorescencia del azul marina intracelular.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no existen intereses financieros en competencia.

Aquí, hemos proporcionado un protocolo detallado para formular liposomas cargados con fármacos para apuntar específicamente a los macrófagos en peces cebra larvales. Este método se puede utilizar para diseccionar el papel de los macrófagos en ciertos modelos de enfermedades garantizando la administración directa dirigida de medicamentos específicamente a los macrófagos. Además, se puede utilizar cuando la toxicidad general de los medicamentos limita su uso cuando se administra por rutas más convencionales, como la inmers...

El sistema de fagocitos mononucleares proporciona una primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Este sistema consiste en monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos y macrófagos, que profanan activamente patógenos extraños, limitando así la propagación de patógenos. Además de estas funciones de efector fagocítico y microbicida, las células dendríticas y los macrófagos también son capaces de producir citoquinas y antígeno-presentación para activar el sistema inmune adaptativo1. De estas células, los macrófagos han recibido especial atención debido a su diversa heterogeneidad funcional y su implicación en múltiples enfermedades inflamatorias, desde la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas hasta el cáncer2,3,4,5,6,7. La plasticidad de los macrófagos y su capacidad para adaptarse funcionalmente a las necesidades de su entorno tisular requieren enfoques experimentales para observar e interrogar directamente estas células in vivo.
Los peces cebra larvaria son un organismo modelo ideal para estudiar la función y plasticidad de los macrófagos in vivo8. La transparencia óptica del pez cebra larval proporciona una ventana para observar directamente el comportamiento de los macrófagos, especialmente cuando se combina con líneas de reporterotransgénicos que marcan los macrófagos. La explotación del potencial de imagen en vivo y la tractabilidad experimental del pez cebra larval ha dado lugar a muchos conocimientos significativos sobre la función de los macrófagos que tienen relevancia directa para la enfermedad humana9,10,11,12,13,14,15. Muchos de estos estudios también han aprovechado la alta conservación de la actividad farmacológica en el pez cebra (un atributo que sustenta su uso como plataforma entera de descubrimiento de fármacos animales16,17,18), mediante la utilización de intervenciones químicas para manipular farmacológicamente la función de los macrófagos. Hasta la fecha, estos tratamientos farmacológicos se han suministrado en su mayoría ya sea a través de la inmersión, que requiere que el fármaco sea soluble en agua, o mediante la microinyección directa de fármaco libre(Figura 1A). Las limitaciones de estas estrategias de entrega pasiva incluyen efectos fuera del objetivo y toxicidad general que pueden impedir evaluar cualquier impacto en la función de los macrófagos. Además, al investigar los efectos farmacológicos en los macrófagos se desconoce si los fármacos están actuando sobre los propios macrófagos o a través de mecanismos más indirectos. Al realizar estudios de intervención química similares para investigar la función de los macrófagos, reconocimos que había una necesidad insatisfecha de desarrollar un método de administración económico y sencillo para dirigir fármacos específicamente a los macrófagos.
Los liposomas son vesículas bicapas microscópicas, biocompatibles y lipídicas que pueden encapsular proteínas, nucleótidos y carga de fármacos19. La estructura bicapa de lípidos unilamellar o multilamellar de liposomas forma un lumen interno acuoso donde se pueden incorporar fármacos solubles en agua, mientras que los fármacos hidrófobos se pueden integrar en las membranas lipídicas. Además, las propiedades fisicoquímicas de los liposomas, incluyendo el tamaño, la carga y las modificaciones de la superficie se pueden manipular para adaptar su orientación a células específicas20,21. Estas características de los liposomas los han convertido en un vehículo atractivo para suministrar drogas y mejorar la precisión de los regímenes de tratamiento actuales20. Como los liposomas son naturalmente fagocitos por macrófagos (una característica explotada por su uso rutinario en la entrega de clodronato específicamente a macrófagos para experimentos de ablación22), se presentan como una opción atractiva para la administración de fármacos específicos de macrófagos(Figura 1B).
Este protocolo describe la formulación de fármacos en liposomas fluorescentes azules recubiertos con el poloxámero de polímero hidrófilo 188, que forma una capa protectora en la superficie del liposomas y se ha demostrado que mejora la retención de fármacos y tiene una biocompatibilidad superior23. Poloxámero fue elegido para el recubrimiento superficial de liposomas como nuestra investigación anterior había demostrado que, en comparación con los liposomas modificados de polietilenglicol, liposomas modificados de poloxámero mostraron una mejor biocompatibilidad después de la inyección subcutánea de patas de rata y farmacocinética similar en conejos después de la perfusión intravenosa23. También se describen protocolos para su microinyección en peces cebra larvales e imágenes en vivo para evaluar su capacidad de selección de macrófagos y su localización en compartimentos intracelulares necesarios para la degradación de los liposomas y la administración de fármacos citoplasmáticos. Como prueba de concepto hemos utilizado previamente esta técnica para apuntar dos fármacos a los macrófagos para suprimir su activación en un modelo larvario de pez cebra de inflamación aguda de gota24. Esta técnica de administración de fármacos amplía el "kit de herramientas" químico disponible para los investigadores de peces cebra que desean garantizar la meta de los macrófagos de sus fármacos de interés.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diseteroyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPE)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850367P</td><td></td></tr><tr><td>1.0 y micro; m Whatman Nuclepore Membranas de policarbonato grabadas</td><td>con pistas GE Healthcare Life Sciences</td><td>110610</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo de 25 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo de 35 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 Detector de matriz de diodos infinitos</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba cuaternaria Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1311B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Termostato de la serie Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Avanti miniextrusora Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agujas de microinyección de borosilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>203-776-0664</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 pinza de punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader punta de pipeta</td><td>Eppendorf 5242956003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf SmartBlock 1,5 mL, termobloque para 24 vasos de reacción</td><td>Eppendorf</td><td>4053-6038</td><td></td></tr><tr><td>manipulador de pestañas</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Hawksley</td><td>BS.748</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH Chemicals</td><td>441474J</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>serie 1260 Sistema</td><td></td>de HPLC</tr><tr>KC-SIGMA-ALDRICH<td></td><td></td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rojo Profundo</td><td>Invitrogen</td><td>L12492</td><td>1 mM solución madre en DMSO, mantener a -20 & deg; C y proteger de la luz.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>soporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-fosfoetanolamina (Marina Blue DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>M12652</td><td>Mantener a -20 &deg; C y proteger de la luz.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387-500G</td><td></td></tr><tr><td>azul de metileno</td><td>Alfa Aesar</td><td>42771</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3516</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidante dirigido a las mitocondrias MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Indicador de superóxido mitocondrial rojo</td><td>Thermo Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td>Mantener a -20 & grados; C y proteger de la luz.</td></tr><tr><td>N-feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Tenga cuidado al manipular, tóxico.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4,6 mm</td><td>columna Phenomenex</td><td>00G-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Escherichia coli Roja BioParticles Conjugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>Manténgalo a -20 &deg; C y proteger de la luz. Prepare 1 mg/mL de solución madre disolviendo 2 mg de producto liofilizado en 2 mL de PBS suplementado con 20 mM de HEPES, pH 7,4.</td></tr><tr><td>pipeta de transferencia de plástico</td><td>Medi'Ray</td><td>RL200C</td><td></td></tr><tr><td>poloxamer 188</td><td>BASF Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inyector de presión</td><td>Applied Scientific Instruments</td><td>MPPI-2</td><td></td></tr><tr><td>evaporador rotativo</td><td>B&uuml; chi, Flawil, Suiza</td><td>B&uuml; chi R-215 Rotavapor</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido</td><td>Olympus Olympus</td><td>FV1000 FluoView</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrífuga</td><td>Microscopio</td><td></td> estereoscópico Thermo Scientific 75000090 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Prepare 4 mg/mL de solución madre (en H2O desionizado) y manténgala a -20 °C.</td></tr><tr><td>triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Baño ultrasónico</td><td>Thermo Scientific</td><td>FB-11205</td><td></td></tr><tr><td>Volocity Software de análisis de imágenes</td><td>PerkinElmer</td><td>versión 6.3</td><td></td></tr> baño <tr><td>de agua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td><td></td></tr></tbody></table>

dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

Las larvas de pez cebra (Danio rerio) se han convertido en un modelo popular para investigar las interacciones huésped-patógeno y la contribución de las células inmunitarias innatas a la enfermedad inflamatoria debido a su sistema inmunitario innato funcionalmente conservado. También se utilizan ampliamente para examinar cómo las células inmunitarias innatas ayudan a guiar los procesos de desarrollo. Al aprovechar la transparencia óptica y la tractabilidad genética del pez cebra larvaria, estos estudios a menudo se centran en enfoques de imágenes en vivo para caracterizar funcionalmente a los macrófagos y neutrófilos marcados fluorescentemente dentro de los animales intactos. Debido a su diversa heterogeneidad funcional y a su papel en constante expansión en la patogénesis de la enfermedad, los macrófagos han recibido una atención significativa. Además de las manipulaciones genéticas, las intervenciones químicas se utilizan ahora de forma rutinaria para manipular y examinar el comportamiento de los macrófagos en el pez cebra larvario. La administración de estos medicamentos se limita típicamente a la orientación pasiva de drogas libres a través de la inmersión directa o microinyección. Estos enfoques se basan en la suposición de que cualquier cambio en el comportamiento de los macrófagos es el resultado de un efecto directo de la droga en los propios macrófagos, y no una consecuencia posterior de un efecto directo sobre otro tipo de célula. Aquí, presentamos nuestros protocolos para apuntar a medicamentos específicamente a los macrófagos de peces cebra larvarios mediante liposomas fluorescentes cargados de drogas por microinyección. Revelamos que los liposomas fluorescentes azules cargados con drogas modificados por poloxámero s 188 son fácilmente tomados por los macrófagos, y no por los neutrófilos. También proporcionamos evidencia de que los medicamentos entregados de esta manera pueden afectar la actividad de los macrófagos de una manera consistente con el mecanismo de acción de la droga. Esta técnica será de valor para los investigadores que deseen garantizar la orientación de fármacos a los macrófagos y cuando los fármacos son demasiado tóxicos para ser suministrados por métodos tradicionales como la inmersión.

El enfoque de hidratación de película delgada descrito aquí para la preparación de liposomas fluorescentes que encierran fármacos es un método simple y rentable. Con el protocolo utilizado en este estudio, se espera que los liposomas sean unilamellar23,24. El tamaño, el potencial zeta, la carga de fármacos y la eficiencia de atrapamiento de los liposomas producidos se resumen en la Tabla 1. El tamaño de partícula de los liposomas (antes y después...

Aquí, describimos la síntesis de liposomas cargados de drogas y su microinyección en peces cebra larvales con el propósito de dirigir la administración de fármacos a células de linaje de macrófagos.

Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Este protocolo describe una técnica para apuntar a fármacos de interés para los macrófagos de peces cebra larvales para manipular y evaluar la función de los macrófagos. Esta técnica tiene ventajas sobre las estrategias tradicionales de administración de fármacos, como la inmersión, asegurando que los fármacos estén dirigidos específicamente a los macrófagos a través de la encapsulación de liposomas. Cuando se aplica a modelos de peces cebra de la enfermedad con un componente inflamatorio, esta técnica tiene el potencial de resolver cómo los macrófagos contribuyen a los procesos patológicos.Aquí, demostramos la utilidad de esta técnica apuntando a un fármaco inhibidor de especies de oxígeno mitocondrial-reactivo a los macrófagos para suprimir la activación. La microinyección de liposomas cargados con drogas en larvas puede ser difícil, ya que se debe tener cuidado de no causar daño epitelial excesivo, lo que puede influir en los estudios inmunológicos. La demostración visual de este protocolo es importante porque implica metodologías farmacológicas y de células vivas de animales enteros que pueden no realizarse rutinariamente en un solo laboratorio.Para preparar 10 miligramos de li

targeting-drugs-to-larval-zebrafish-macrophages-injecting-drug-loaded

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

El artículo describe la ablación hepática dirigida, un método para inducir la muerte de hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra. El protocolo de muestra describe el proceso para generar, manipular y evaluar la ablación hepática dirigida en el pez cebra.

Ablación hepática dirigida: inducción de la muerte de hepatocitos con metronidazol en larvas transgénicas de pez cebra

El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

Una técnica zWEDGI para visualizar larvas de pez cebra infectadas con patógenos fúngicos

El video muestra la microinyección de lipopolisacáridos (LPS) en el cerebro de larvas de pez cebra para inducir neuroinflamación. Las larvas se colocan en una placa revestida de agarosa, la aguja se inserta en los ventrículos cerebrales y se inyecta el LPS. El LPS inyectado desencadena una respuesta inmunitaria que conduce a la neuroinflamación.

Inducción de neuroinflamación en larvas de pez cebra con una inyección de lipopolisacárido

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

Este protocolo describe una técnica para visualizar el comportamiento de los macrófagos y la muerte en peces cebra embrionarios durante la infección por Mycobacterium marinum. Se incluyen medidas para la preparación de bacterias, infección de embriones y microscopía intravital. Esta técnica se puede aplicar a la observación del comportamiento celular y la muerte en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.

Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

El pez cebra dirigido a electrófilos y oxidantes reactivos (Z-REX) es un método basado en la biología química para la investigación de la señalización reactiva de moléculas pequeñas. Esta técnica se puede aplicar a peces vivos de diferentes etapas de desarrollo. Aquí, combinamos ensayos estándar en pez cebra con Z-REX para el análisis de la vía de señalización.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Aprende a dirigir fármacos a macrófagos de larvas de pez cebra mediante liposomas cargados con drogas y microinyección. Este método permite evaluar funciones inmunitarias y estudiar mecanismos inflamatorios in vivo.

Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas

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