Name: Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie-Ploidy-Analysen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Hydatidiform-Molargeweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Erfahren Sie Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie für die Diagnose von Hydatidiform-Molen aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe. Diese Protokolle minimieren die mütterliche DNA-Kontamination und verbessern die diagnostische Genauigkeit erheblich.

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Die Autoren danken Sophie Patrier und Marianne Parésy für die gemeinsame Nutzung des ursprünglichen Flow-Zytometrie-Protokolls und Promega und Qiagen für die Bereitstellung von Vorräten und Reagenzien. Diese Arbeit wurde von der Réseau Québécois en Reproduction und dem Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) an R.S. unterstützt.

<ol><li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li>
<li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li>
<li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles%3A+ancillary+techniques+%28p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%29+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li>
<li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+hydatidiform+moles%3A+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li>
<li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li>
<li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hydatidiform+mole%3A+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li>
<li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles%2C+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li>
<li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li>
<li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li>
<li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles%3A+Basic+Science+and+Genetic+Counselling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Obstetrics+and+Gynecology+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li>
<li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li>
<li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li>
<li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation%3A+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+%22partial%22+or+%22complete%22+hydatidiform+moles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li>
<li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Gynecological+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li>
<li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles%3A+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

HM sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien und haben verschiedene histologische und genotypische Typen, was ihre genaue Klassifizierung und Diagnose schwierig macht. Die histopathologische morphologische Bewertung erwies sich oft als ungenau und ist daher allein unzuverlässig, um HM in CHM und PHM zu klassifizieren und von nicht-molaren Fehlgeburten zu unterscheiden. Daher erfordert eine genaue Diagnose von HM den Einsatz anderer Methoden wie Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung, Pl...

Ein hydatidiformer Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch abnorme embryonale Entwicklung, Hyperproliferation des Trophoblasten und hydropische Degeneration von Chorionzotten (CV) gekennzeichnet ist. Historisch gesehen wurde HM in zwei Typen unterteilt, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM) nur auf der Grundlage der morphologischen Bewertung1. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung allein nicht ausreicht, um HM in die beiden Subtypen (CHM und PHM) einzustufen und sie von nicht-molaren Fehlgeburten2,3,4zu unterscheiden.
Da CHM und PHM unterschiedliche Neigungen zu malignen Erkrankungen haben, ist es daher wichtig, den genotypischen Typ von HM genau zu bestimmen, um den Patienten eine angemessene Nachbeobachtung und Behandlung zu ermöglichen. Infolgedessen wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Methoden entwickelt und entwickelt, um den elterlichen Beitrag zu den Molgeweben zu identifizieren und eine korrekte Klassifizierung von HM zu erreichen. Dazu gehören Karyotypie-Analyse, chromosomaler Banding-Polymorphismus, humanes Leukozyten-Antigen (HLA) serologische Typisierung, Restriktionsfragmentlänge Polymorphismus, variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen, Mikrosatelliten-Genotypisierung, Durchflusszytometrie und p57 KIP2-Immunhistochemie. Dies hat eine genaue Unterteilung von HM-Konzepten auf der Grundlage des elterlichen Beitrags zu ihren Genomen ermöglicht, wie folgt: CHM, die diploid undrogenetisch monospermisch oder diploid androgenetisch dispermisch sind, und PHM, die triploid sind, dispermisch in 99% und monospermin in 1% der Fälle5,6,7,8. Darüber hinaus gibt es eine andere genotypische Art von HM, die in den letzten zwei Jahrzehnten entstanden ist, die diploid biparental ist. Letzteres ist meist wiederkehrendeund und kann ein einzelnes Familienmitglied (einfache Fälle) oder mindestens zwei Familienmitglieder (familiäre Fälle) betreffen. Diese diploiden biparentalen Maulwürfe werden meist durch rezessive Mutationen in NLRP7 oder KHDC3L bei den Patienten9,10,11,12verursacht. Diploid biparental HM bei Patienten mit rezessiven Mutationen in NLRP7 kann als CHM oder PHM durch morphologische Analyse diagnostiziert werden und dies scheint mit der Schwere der Mutationen bei den Patienten13,14verbunden zu sein. Neben der Klassifizierung von HM nach ihren Genotypen ermöglichte die Einführung und Verwendung mehrerer Genotypisierungsmethoden die Unterscheidung der verschiedenen Molentitäten von nicht-molaren Fehlgeburten, wie z. B. aneuploiden diploiden biparentalen andere Arten von Konzepten5,15. Solche Vorstellungen können einige Trophoblast-Proliferation und abnorme villous Morphologie haben, die bis zu einem gewissen Grad einige morphologische Merkmale von HM imitieren.
Der Zweck dieses Artikels besteht darin, detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Geweben (FFPE) sowie umfassende Analysen der Ergebnisse dieser Methoden und deren Integration mit anderen Methoden für korrekte und schlüssige Diagnose von Molgeweben.

<table><tbody><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD BioSciences</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarelektrophoresegerät: Genome Angewandte Biosysteme 3730xl DNA-Analysator</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>313001R</td><td>Service des Zentrums für Angewandte Genomik (http://www.tcag.ca)</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60, Einbettmedium für Histopathologie</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>23244257</tr><tr><td>Eosin Y Stammlösung (1%)</td><td>Fisher</td><td>SE23-500D</td><td></td></tr><tr><td>FCSalyzer - Software für die Durchflusszytometrie-Analyse</td><td>SourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FFPE Qiagen Kit</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td>Zum Trennen und für den Reinigungsprozess</td></tr><tr><td>Glacial Essigsäure (konzentriert)</td><td>Sigma</td><td>A6283-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser: Deckglas</td><td>Fisher</td><td>12-541a</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Fisher</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>Hochdeionisiertes Formamid: Hi-Di Formamid</td><td>Thermofisher</td><td>4311320 IHC-Plattform</td><td></td></tr><tr><td>: Benchmark Ultra</td><td></td> <td>Roche-Kimwipes</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Ultident</td><td>30-34120</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomklingen</td><td>Fisher</td><td>12-634-1C</td><td></td></tr><tr><td>Nitex Filtergewebe, 48 &mu; m</td><td>Filmar</td><td>74011</td><td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; jeder andere Filter ist geeignet, aber dies ist eine kostengünstige und effektive Option von einem Nicht-Forschungsunternehmen</td></tr><tr><td>p57 Antikörper</td><td>Cell Marque</td><td>457M</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53499-632</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät</td><td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>PeakScanner 1.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4381867</td><td>Software für die Genotypisierungsanalyse.</td></tr><tr><td>Pepsin aus der Magenschleimhaut des Schweins</td><td>Sigma</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Positiv geladene Objektträger: Superfrost Plus 25x75mm</td><td>Fisher</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>PowerPlex 16 HS System</td><td>Promega Corporation</td><td>DC2102</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodid</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease A aus der Bauchspeicheldrüse des Rinds</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Trennmatrix: POP-7 Polymer</td><td>Thermofisher</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrosatelliten-dna-genotypisierung und durchflusszytometrie-ploidy-analysen von formalinfixierten paraffin-eingebetteten hydatidiform-molargeweben

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch übermäßige trophoblastische Proliferation und abnorme embryonale Entwicklung gekennzeichnet ist. Es gibt zwei Arten von HM, die auf mikroskopischer morphologischer Auswertung basieren, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM). Diese können auf der Grundlage des Elternbeitrags zu den Molgenomen weiter unterteilt werden. Eine solche Charakterisierung von HM durch Morphologie und Genotypanalysen ist entscheidend für das Patientenmanagement und für das grundlegende Verständnis dieser faszinierenden Pathologie. Es ist gut dokumentiert, dass die morphologische Analyse von HM einer breiten Interobserver-Variabilität unterliegt und allein nicht ausreicht, um HM genau in CHM und PHM zu klassifizieren und von hydropischen nicht-molaren Abtreibungen zu unterscheiden. Die Genotypisierungsanalyse wird hauptsächlich an DNA und Geweben aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Produkten der Empfängnis durchgeführt, die eine weniger optimale Qualität aufweisen und folglich zu falschen Schlussfolgerungen führen können. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrieanalysen von FFPE-Molarengeweben sowie die Interpretation der Ergebnisse dieser Methoden, deren Fehlerbehebung und Integration in die morphologische Bewertung bereitgestellt. , p57KIP2-Immunhistochemie und Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), um eine korrekte und robuste Diagnose zu erhalten. Hier teilen die Autoren die Methoden und Lehren aus der Analyse von rund 400 Empfängnisprodukten aus den letzten 10 Jahren.

Die Komplexität von Molgeweben und die Tatsache, dass sie verschiedene Genotypen haben können, erfordern eine strenge Analyse und die Verwendung mehrerer Methoden wie morphologische Bewertung, p57-Immunhistochemie, Mikrosatellitengenotypisierung, Durchflusszytometrie und FISH. Zum Beispiel wurde ein Patient (1790) mit zwei PHM überwiesen, die nur durch Mikroarray-Analyse der POCs als triploid erwiesen wurden. Der Patient wurde daher mit wiederkehrendem PHM diagnostiziert. Die Mikrosatelli...

Hydatidiforme Maulwürfe sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien, die nach ihren morphologischen Merkmalen und dem elterlichen Beitrag zu den Molgenomen klassifiziert werden können. Hier werden Protokolle der Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem Molgewebe detailliert beschrieben, zusammen mit der Interpretation und Integration der Ergebnisse.

Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie-Ploidy-Analysen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Hydatidiform-Molargeweben

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Der Hauptvorteil unseres Genotypisierungsprotokolls besteht darin, dass es die Kontamination mit mütterlicher DNA minimiert, was die größte Herausforderung bei der Genotypisierung formalinfixierter, paraffineingebetteter Molarengewebe ist. Durchflusszytometrie ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die die Diagnose von hydatidiformen Maulwürfen erheblich erleichtert. Für jedes formal fixierte Paraffin-eingebettete oder FFPE-Produkt der Empfängnis bereiten Sie einen vier Mikrometer dicken Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenabschnitt vor, wie in diesem Video beschrieben, um die morphologische Auswertung durch Mikroskopie durchzuführen.Stellen Sie die FFPE-Blöcke für 15 Minuten auf Eis, um den Schnitt zu erleichtern. Passen Sie das Mikrotome an Schnittabschnitte an, die für die mikroskopische morphologische Auswertung vier Mikrometer dick sind. Legen Sie den kalten Block in das Mikrotome und schneiden Sie einen Abschnitt aus jedem Block für H&E Färbung.Mit Zangen, übertragen Sie jeden Abschnitt in ein 45 Grad Celsius Wasserbad. Nehmen Sie den Abschnitt aus dem Wasserbad mit einem positiv geladenen Dia, das zuvor mit der Proben-Identifikationsnummer beschriftet war, mit einem Bleisti

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Das vorliegende Protokoll bietet eine praktische Lösung, die die Messung von Apoptose, mitochondrialem Membranpotenzial und DNA-Schäden in menschlichen Spermien mit einem einzigen Zytometer ermöglicht.

Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode zur Visualisierung der Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben.

Robuster Nachweis der Genamplifikation in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung eines Multiplex-Immunfluoreszenz-Antikörper-Panels für die DNA-Barcode-basierte Bildgebung von murinen FFPE-Melanomgeweben. Wir beschreiben auch eine Bildanalyse-Pipeline mit Open-Source-Tools zur Generierung von räumlichen Proteomik-Einblicken in die Immunmikroumgebung des Mausmelanomtumors.

DNA-Barcode-basierte Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse von FFPE-Proben von genetisch umprogrammierten murinen Melanomen

Wir berichten über ein DNA-FISH-Metaphasen-Spread-Protokoll, das die Locus-Kopiennummer und -Position im Genom visuell erkennt. Dieser Ansatz ermöglicht die Einzelzellauflösung von Amplifikationszuständen, insbesondere in Krebszelllinien mit extrachromosomaler DNA und homogen gefärbten Regionen.

Die DNA-FISH-Metaphase breitet sich aus, um extrachromosomale DNA von homogen färbenden Regionen in menschlichen Krebszelllinien zu unterscheiden

Erfahren Sie Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie für die Diagnose von Hydatidiform-Molen aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe. Diese Protokolle minimieren die mütterliche DNA-Kontamination und verbessern die diagnostische Genauigkeit erheblich.

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