人调节性T细胞克隆的制备

摘要

本方案描述了用于扩增和克隆人调节性T细胞的方法，以获得具有Treg特异性去甲基化区域（TSDR）稳定去甲基化状态及Treg特异性表型特征的超高纯度、有活力的人调节性T细胞。

摘要

人类调节性T细胞（Treg）由于现有Treg富集方法的局限性，极难实现高纯度分离。当前方法主要依赖于通过多种随生理和病理状态不同而表达水平各异的活化依赖性细胞表面标志物来鉴定Treg。因此，被分离为“Treg”的细胞群体中往往含有大量非Treg效应T细胞（即Teff），这会干扰对这些细胞的精确表型与功能特征分析、基因组与蛋白质组学表征、在不同健康与疾病状态下的可靠计数，以及为治疗目的而进行的分离与扩增。尤其是后者仍是一个主要障碍，因为在与Treg相关的细胞区室（例如CD4⁺CD25⁺ T细胞）中无意扩增效应细胞，可能导致基于Treg的免疫治疗无效，甚至产生危害。本研究提出一种规避基于细胞群体的Treg分离与扩增相关问题的方法，并证明：通过生成Treg候选克隆，继而仅对经过严格筛选的单克隆细胞进行选择、培养和扩增，能够获得超纯的Treg细胞产物，该产物可在体外长期培养数月之久，从而支持对这些细胞的后续研究，包括潜在的治疗应用。

引言

本实验方案的目的是实现超高水平纯度的克隆性人调节性T细胞（Treg）的体外扩增。通过分离富集Treg的细胞群体并进行后续克隆，可筛选出具有理想表型的Treg细胞，并将其扩增，以进一步研究这些细胞的生物学特性、探索其潜在的治疗价值以及其他实验性下游应用。

与多克隆分离和扩增方法相比，Treg克隆能够显著提高Treg的纯度。这是因为该方法可以可靠且可控地排除表型相似或不同的效应T细胞（Teffector cells），从而获得更纯净的细胞群体，其中包括表达FOXP3的非Treg细胞（FOXP3^intCD45RA^negCD25^int）以及CD4⁺ CD25⁺ FOXP3^- Teff¹等。通过该方法获得的克隆细胞系不会出现快速扩增的非Treg克隆过度生长的问题，而这一问题使得长期（即数月）体外培养和扩增在实际操作中几乎不可能或至少极具挑战性。此外，克隆来源的Treg还可在扩增后对其表型特征进行广泛验证，包括采用已被公认为评估人源真正天然Treg（bona fide natural Treg）表观遗传特征的标准方法（例如TSDR区域的稳定去甲基化）进行分析^1,2,<....

方案

本方案遵循所有与涉及人类样本研究的伦理规范相关的机构指南。人类细胞及其他人源血液制品的操作必须至少在符合BSL-2标准的认证环境中进行，并至少遵守BSL-2安全准则。

1. 对人外周血单个核细胞中 CD4⁺CD127^loCD25^hi 细胞进行预富集

警告：全程使用无菌技术。立即将锐器丢弃至适当的锐器容器中。在丢弃前，对任何接触过血液和/或血液制品的物品使用漂白剂处理。在生物安全柜中操作。

1. 从外周血采集或白细胞单采术获取人外周血或预先富集人白细胞的血液制品（即“白细胞富集包”）。应立即处理细胞。
   注意：若无法避免过夜储存，请在室温（RT）下储存和运输细胞。避免暴露于低温环境。
2. 通过密度梯度介质梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），方法如前所述⁹。
3. 使用血细胞计数板或细胞计数仪仔细计数PBMCs。如条件允许，应使用至少300 × 10⁶个PBMCs进行调节性T细胞（Treg）的分离。
4. 将PBMCs重悬于分离缓冲液（含1.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液[PBS]中加入2%混合人AB型血清[PHS-AB]）中，调整细胞浓度至50 × 10⁶个/mL，并根据所用分选试剂....

结果

成功实施本方案将获得稳定的人调节性T细胞克隆和细胞系。

通过预选/预富集CD4⁺CD127^loCD25^hi细胞是一种简便的方法，可获得包含大多数人调节性T细胞（Treg）的起始细胞群体（图1A–C）。并非所有克隆均表现出Treg表型。通过检测CD25^hiCD127^lo表达对克隆进行预筛选，是识别目标克隆的合理策略，并可通过预选提高获得目标克隆的效率（图2A，B）。克隆性的评估可通过TCR Vβ染色轻松实现，要求在细胞产物中仅检测到单一的Vβ链（图3A，B）。然而，仅依赖流式细胞术对克隆进行表征可能因效应T细胞（Teff）与Treg细胞之间分离不完全而导致结果误判，尤其是在FOXP3、CD25和CD.......

讨论

本方案描述了通过有限稀释法和基于饲养细胞的扩增方法，从含有调节性T细胞的起始群体中分离、扩增并严格筛选细胞，从而实现高纯度人调节性T细胞的扩增。

该方法的关键步骤包括：1）选择合适的起始细胞群体。通常，CD127^loCD25^你好 CD4 的区室⁺ 人外周血单个核细胞中的T细胞含有多种适用于此目的的调节性T细胞^10,172）准确的细胞计数对于成功克隆至关重要，因为接种细胞过多可能导致产生寡克隆细胞系，而接种过少则会降低克隆效率。本方案采用标准血细胞计数板进行细胞计数。如果经过适当优化设置并验证计数准确性，也可使用自动细胞计数仪替代。3）接种初始细胞后需对培养板进行长期观察与维护。调节性T细胞（Treg）增殖缓慢，因此克隆通常需在培养数周后才以肉眼可见的细胞团块形式出现。需要注意的是，该时间范围与常用于快速增殖效应T细胞（如细胞毒性CD8⁺ T细胞）克隆制备的方法相比存在显著差异。⁺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm Stericup，500 mL	Millipore	5500	培养基储存与制备
100x 非必需氨基酸	Gibco	11140-050	培养基组分
15 mL 圆锥形离心管（每袋50个，每箱500个）	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	培养基组分
25 mL 单口移液管架	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL 圆锥形离心管（每包25个）	ThermoFisher Scientific	339652
50x 青霉素-链霉素溶液	Corning	Corning, 30-001-Cl	培养基组分
CryoTube 冻存管，内螺纹，圆底，星足，聚丙烯螺旋盖，无菌，1.8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep 人 CD25 阳性选择试剂盒	Stemcell Technologies	18231	替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
EasySep 人 CD4+CD127low T 细胞预富集试剂盒	Stemcell Technologies	19231	替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
EasySep 人 CD4+CD127lowCD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒（替代第12项）	Stemcell Technologies	18063	替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	用于外周血或白细胞分离产物中 PBMC 的纯化；密度梯度介质
人 AB 血清（PHS-AB）	Valley Biomedical Inc	HP1022	培养基组分
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于紫外激发）	Thermo Fischer	L-34962	细胞活力染料
植物血凝素-L（PHA-L）	Millipore/Sigma	11249738001	T 细胞刺激
重组 IL-2（例如，PROLEUKINâ）	Prometheus		T 细胞刺激与维持/培养基组分
RPMI 1640	Gibco	21870-076	培养基组分
流式细胞术染色抗体（Treg 表型分析）	参见 "备注"	参见 "备注"	染色抗体列于：Nowatzky 等（2019），PubMed PMID: 30584695；PubMed Central PMCID: PMC6497402。若使用 EasySep 人 CD25 阳性选择试剂盒，则使用 2A3 或 BC96 抗 CD25 抗体进行染色，例如：Brilliant Violet 421 抗人 CD25 抗体（Biolegend；302629）
TCR Vβ Repertoire 试剂盒；IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	扩增克隆性的验证
组织培养板，96 孔，U 型底，带低蒸发盖	Corning	353077