Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Stabilitet och struktur av Fladdermus Major Histocompatibility Complex Klass I med heterologous β₂-Microglobulin

Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney

Journal (Immunology and Infection)

Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Journal (Immunology and Infection)

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Click here for the English version

Stabilitet och struktur av Fladdermus Major Histocompatibility Complex Klass I med heterologous β₂-Microglobulin

Article DOI: 10.3791/61462-v

March 10th, 2021 •

Di Zhang*^1,2, Kefang Liu*^3,4, Dan Lu*^2,5, Pengyan Wang^1,2, Qingxu Zhang^1,2, Peipei Liu², Yingze Zhao², Yan Chai⁴, Jianxin Lyu¹, Jianxun Qi⁴, William J. Liu^1,2

¹School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, ²NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau, ⁴CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, ⁵Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 10th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Protokollet beskriver experimentella metoder för att erhålla stabila stora histocompatibility komplexa (MHC) klass I genom potentiella β_{2-mikroglobulin}(β₂m) substitutioner från olika arter. Den strukturella jämförelsen av MHC jag stabiliseras av homologa och heterologa β₂m undersöktes.

Transcript

I denna studie använde vi Bat MHC Klass I som modell för att sammanfatta metodiken och för att utvärdera genomförbarheten av en hybrid MHC klass I komplex med heterologt beta-2 mikroglobulin. Tidigare studier har visat att däggdjurs B2M-substitutionen inte påverkar peptidpresentationen nämnvärt. Faktum är att hybrid MHC klass I kan aktivera en liknande struktur och funktion som den ursprungliga molekylen.

Dessa tekniker kan användas för att underlätta funktionell och strukturerad studie av MHC I för vävnad svar utvärdering under infektionssjukdomar och tumör immunterapi. För E.coli-odlingstransformation tillsätt 10 nanogram plasmid innehållande fladdermus eller human MHC klass I beta två mikroglobulin vätekedja till 100 mikroliter utjämnad suspension och bada suspensionen i is i 30 minuter. I slutet av inkubationen chockar värmen bakterierna i 90 sekunder vid 42 grader Celsius och återvänder kulturen till isbadet i två minuter.

Lägg sedan till 800 mikroliter lysogen buljong till kulturen och skaka suspensionen på en gungplattform i 20 minuter vid 37 grader Celsius och 200 rotationer per minut. I slutet av inkubationen, sprid 100 mikroliter av bakterierna på ett lämpligt antibiotikaresistent odlingsblad. Nästa morgon, välj en enda nyligen omvandlad bakterieklon och inokulera klonen med tre milliliter LB med antibiotikum medium.

Placera kulturen på gungplattformen på 37 grader Celsius i 12 till 16 timmar. Nästa morgon överför du 500 mikroliter av det aktiverade bakteriebeståndet till 50 milliliter LB med antibiotikamedium och returnerar bakterierna till den gungande inkubatorn över natten. Dela upp det återstående aktiverade bakteriebeståndet i 500 mikroliter alikvoter och tillsätt varje alikvot till 500 mikrolitervolymer på 40% glycerol, för minus 80 grader Celsius lagring.

För att generera stora mängder rekombinant protein överför nästa morgon bakteriesuspensionen till två liter LB med antibiotikummedium vid ett förhållande på 1 till 100 och återgår kulturen till den gungande inkubatorn tills en absorbans på 0,6 vid 600 nanometer uppnås. Lägg sedan till en millimolär IPTG till kulturen för att inducera uttryck av transgenen. Efter fyra till sex timmars induktion överför du bakteriekulturen till flaskor för centrifugering och suspenderar bakteriecellspellets i 60 milliliter PBS per flaska.

Frigör sedan det uttryckta rekombinanta proteinet med ultraljud cell disruptor 99 gånger, i sex sekunder och ett intervall på 12 sekunder vid 300 Watt per ultraljudsbehandling. För införande av kroppsrening samla de sonifierade bakterierna genom centrifugering och suspendera pelletsen i en lämplig volym tvättbuffert för ytterligare två centrifugationer. Efter den andra tvätten, suspendera upp införandeorganen och återupphängningsbufferten och avsätt ett 20 mikroliter alikvot av provet för SDS-sidan för att testa inneslutningskroppens renhet.

Centrifugera det återstående provet och väg in den inneslutningskropp som innehåller pellets. Tillsätt upplösningsbufferten till pelletsen till en slutlig koncentration av 30 milligram inklusionskropp per milliliter buffert. Och använd en magnetisk omrörare för att långsamt röra lösningen vid fyra grader Celsius, tills inklusionskropparna löses upp i upplösningsbufferten.

Efter att ha kasserat fällningarna, lagra inkluderingskropparna på minus 20 eller minus 80 grader Celsius. För MHC-komplex omformning, tillsätt en fem millimolär reducerad glutation och 0,5 millimolar oxiderad glutation vid 250 till 300 milliliter, en fyra grader Celsius omdubblningsbuffert. Och rör långsamt lösningen på en magnetisk omrörare vid fyra grader Celsius i 10 till 20 minuter.

För MHC vätekedja och beta två mikroglobulin utspädning, ladda inneslutningskroppen i en milliliter spruta och injicera hela en milliliter volym av införande kroppslösning i en liter omformningsbuffert nära omrörningsstången, för att få en snabb och effektiv utspädning. Lös sedan upp fem milligram per milliliter peptid i dimetylsulfoxid och injicera snabbt 200 mikroliter peptid i refoldinglösningen som just visats. Efter 10 till 20 minuters långsam omrörning, injicera tre milliliter H-kedjeinkluderingskroppar i en ny en liters volym omdubblningsbuffert och låt omdubblningen fortsätta vid fyra grader Celsius i åtta till tio timmar.

För att bestämma den omveckade proteinkoncentrationen tillsätt utbytesbuffert till en tryckkammare med ett 10 kilodalton multikoppsoxidasmembran och koncentrera bufferten till 30 till 50 milliliter volym. Överför omdubblningslösningen till ett centrifugrör och ta bort fällorna genom centrifugering. Överför försiktigt supernaten i kammaren och koncentrera bufferten ytterligare till en slutlig volym på cirka en milliliter.

Avlägsna eventuella slutliga föroreningar genom centrifugering och överför supernaten till ett sterilt rör. Använd en kolonn med 1030 GL-storlek för att rena proteinerna, samla in proverna på toppen och analysera dem med hjälp av SDS-sidan. Samla MHC komplexa topp och koncentrera proteinet till en slutlig koncentration av 15 milligram per milliliter.

Späd sedan komplexet till 7,5 milligram per milliliter koncentration. För att utföra kristallisering av den komplexa MHC och peptiden med hjälp av tekniken för att sprida sittande droppånga, tillsätt 0,8 mikroliter av provet till en kommersiell kristallbräda och försegla brädan. Balansera provlösningen mot 100 mikroliter reservoarlösning vid fyra eller 18 grader Celsius och använd ett mikroskop för att regelbundet observera kristalltillväxten under de kommande sex månaderna.

För kryogent skydd, i slutet av experimentet, överför kristallerna till en lagringslösning som innehåller 20% glycerol innan de snabbt kyler proverna i en 100 graders Kelvin gasformig kväveström. Samla sedan in röntgendiffraktionsdata enligt standardprotokoll. För att bestämma kristallkomplexens struktur öppnar du högupplösta strukturella röntgendiffraktionsdata i Denzo-programmet i HK L 2000-programvarupaketet och väljer en första modell i proteindatabanken.

För att bestämma proteinstrukturen, öppna data i Phaser MR-programmet i CCP4 och använd den förfinade röntgenmodellen för den första gemensamma förfiningen. Använd sedan Phoenix-förfining ensam och foglägen för enbart röntgenförfining och den gemensamma neutronen för röntgenförfiningen. Efter varje omgång av förfining, kontrollera manuellt modellen mot Fo-Fc och 2Fo-Fc positiva kärntäthetskartor i Coot.

I dessa representativa experiment, bindande kapaciteter av Hendra Virus härledda Hendra Virus One peptid att slå MHC klass I väte kedjor med homolog fladdermus beta två mikroglobulin och heterologa mänskliga beta två mikroglobulin utvärderades. I båda analys bildades kristaller med hög upplösning genom renaturation med beta två microglobulin ljus kedjan. I avsaknad av beta två mikroglobulin bildas inte dessa komplex.

I MHC klass I vätekedjan Hendra Virus ett, Human beta två mikroglobulin struktur, bevarade rester H31, D53, W60 och Y63 av human beta två mikroglobulin, som motsvarar bat beta två mikroglobulin, ta kontakt med botten av peptid bindande spår och bevarade Q8, Y10, R12 och 24 rester, som motsvarar beta två mikroglobuliner bundna till alpha tre domänen. I de övergripande fladdermus- och mänskliga strukturerna är den genomsnittliga rotmedelvärdet kvadratisk härledning av rester en till 184 av vätekedjorna 0,248 under alla kol alfaatomens superpositioner, vilket indikerar att det inte finns några skillnader mellan dessa två komplex. Strukturen av peptid justering visar att bekräftelserna av Hendra Virus en peptider i dessa två komplex är ganska lika.

Sekvensjustering visar också att aminosyrorna i beta två mikroglobulin från olika arter är mycket bevarade. Det är viktigt att erbjuda motståndarekomplexen en hög rapporteringseffektivitet. Därför är det viktigt att välja lämplig beta två mikroglobulin och att använda mycket renade inneslutningskroppar.

Detta protokoll kan användas för att erhålla stabil MTC I-komplex genom potentiella beta två mikroglobulin substitutioner i andra arter, och att existera de är MTC I struktur och funktion. De data som erhålls från dessa studier kan användas för att bedöma T-cellssvar under infektionssjukdomar och tumörimmunterapier.

X

Simple Hit Counter