Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.
Transcript
פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם והפחתת נתונים הנדרשים למחקרי הד ספין נויטרונים מוצלחים של תנודות ממברנה קולקטיבית של רלוונטיות לפונקציות ביולוגיות ויישומים מעשיים של ממברנות השומנים. NSE ניגש ישירות לדינמיקה של הממברנה בצירי הזמן של ננו-שניות של פונקציות קרום מפתח עם היתרון הייחודי של רגישות איזוטופים לבדיקת תכונות ממברנה סלקטיבית שאינן נגישות לטכניקות אחרות. מחקרים על דינמיקת הממברנה על הננומטרים חיוניים להבנת תכונות הממברנה הבסיסית של המנגנון המולקולרי ואינטראקציות בין חלבון ממברנה הסתבכו בפתולוגיות תאים שונות.
השיטה מספקת לחוקרים חדשים ל- NSE הנחיות מפורטות על עיצוב, הכנה ואפיון שלשלות שומנים לניסויים מוצלחים וניתוח ופרשנות להפחתת נתונים לאחר מכן. מי שיוכיחו את ההליך יהיו טסאני קומארג' וג'ולי נגוין, סטודנטית לתואר שני ותלמידת לתואר ראשון מהמעבדה. עבודה בתוך מכסה המנוע, להכין את השעיית השומנים על ידי המסת שומנים במשקל מדויק מיליליטר אחד של ממס עם ערבוב ידני.
ייבשו את תמיסת השומנים על ידי הזרמה עדינה של גז אינרטי בוויאליה תוך סיבוב איטי בזווית. כדי להסיר ביסודיות את הממס שיורית, מניחים את הבקבוקונים לילה בתנור ואקום ב 35 מעלות צלזיוס. למחרת, לחות את הסרט השומנים עם שני מיליליטר של מים כבדים כדי לקבל ריכוז שומנים של 50 מיליגרם למיליליטר מערבולת השעיית השומנים hydrated עד סרט השומנים מומס לחלוטין.
לאחר מכן, לבצע חמישה מחזורי הפשרת הקפאה על ידי אחסון את ההשעיה השומנים hydrated במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הקפאה. ואז מעביר אותו לאמבט מים של 35 מעלות צלזיוס כדי להפשיר את ההשעיה של השומנים. מערבולת ההשעיה המופשרת עד הומוגני לפני שתמשיך למחזור הבא.
לפני תחילת הניסוי, להרכיב את ההתקנה extruder באמצעות קרום פולי-ביקרבונט בין שתי תומכות ממברנה ולהוסיף שני מסנני נייר בכל צד כדי לספק תמיכה נוספת. השתמש מזרקי זכוכית אטום כדי לחות את קרום פוליקרבונט על ידי העברת 0.3 מיליליטר של מים כבדים דרך הרכבת הממברנה מספר פעמים. לאחר לחות הממברנה, הכנס מזרק גז אחד מיליליטר הדוק עם תמיסת שומנים לבן חלבי מוכן לקצה אחד ומזרק ריק לקצה הנגדי של מנגנון extruder.
לאחר שהמזרקים מחוברים, הנח את ההרכבה לתוך בלוק המחול. תכנת את המשאבה על-ידי החזקת לחצן Rate לחוץ כדי להיכנס לקצב ההבלטה ולחץ על לחצן קוטר כדי להזין את קוטר המזרק. לאחר מכן, לחץ על סג עד שהאור נדלק.
לחץ על התחל והמתן עד שהדגימה תתחיל לחלק למזרק הריק. לחץ על לחצן עצור רגע לפני שהמזרק לדוגמה ריק לחלוטין. הקלט את אמצעי האחסון שניתן לו ולאחר מכן החזק את לחצן Rate עד שהשלב הראשון יופיע על המסך.
תוך שמירה על נורית משיכה כבויה, לחץ על לחצן עוצמת הקול כדי להזין את אמצעי האחסון שהוקלט קודם לכן. לחץ שוב על לחצן תדרג והשתמש בחץ הימני ביותר למעלה כדי לגשת לשלב השני. הקש על אמצעי אחסון כדי להזין את אותו ערך של אמצעי האחסון שהוקלט קודם לכן.
בשלב זה, לחץ על לחצן לסגת עד שהנורית לסגת דולקת. חזור על המחזור עבור שלב שלוש על-ידי לחיצה על לחצן עוצמת הקול עד ש- LP:SE יופיע על המסך והגדר אותו ל- 20. לבסוף, לחץ על לחצן קצב, גש לשלב הרביעי ולחץ על לחצן עוצמת הקול כדי להגיע לפונקציה Stop כדי לסיים את הגדרת המשאבה.
לאחר שהמשאבה מתוכנתת, הקש התחל כדי להתחיל את מחזור ההבלטה. בצע 15 עד 20 מחזורי שחול לפני איסוף השעיית השומנים השקוף כחול אופל ב בקבוקון נקי למדידות. פתח את תוכנת DAVE ובחר הקטן נתוני NSE מתפריט הפחתת נתונים.
העלה את קבצי הנתונים מעל ערכי Q שונים באמצעות פתח קבצי הד מתפריט הקובץ. הקבצים שהועלו יופיעו תחת ערכות הנתונים הזמינות. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ שנבחר וסמן אותו לפי המדידה אליה הוא מתאים לסימון לדוגמה, לתא או לרזולוציה.
באמצעות הכרטיסיה ערכת נתונים, קבץ את הפיקסלים של הגלאי ב- 2 X 2 כדי לשפר את יחס האות לרעש. החל את אותו binning על כל הקבצים של רזולוציה, תא ודוגמה. בדוק את הנתונים מעל כל קבוצות הפיקסלים והסוו את אלה עם אותות גרועים על-ידי הקשה על מקש End בלוח המקשים.
הקש Enter כדי לגשת לחלון מוקפץ כדי להחיל את אותה מסיכה על כל ארבע הפעמים שלך. פיקסלים עם מסיכה יהפכו לירוקים. ודא שהנתונים שנאספו הם בצורה של אות הד.
התחל להתאים את קובץ הרזולוציה מרשימת הקבצים שהועלה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ הרצוי ובחירה באפשרות התאם פעולות, התאם לרזולוציית Echoes מהתפריט הנפתח. ודא כי התקפי אותות ההד מניבים פרמטרים מתאימים סבירים. כדי לבדוק את השגיאה המשויכת לכל פרמטר התאמה מעל הגלאי כולו, בחר אפשרויות תמונה ולאחר מכן בחר את הפרמטר המתאים לעניין.
לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תמונת הגלאי כדי לגשת לחלון מוקפץ המציג מפת סרגל שגיאות. אם ההתאמה לפיקסל מסוים אינה משביעת רצון, התאימו מחדש את האות מעל הפיקסל על-ידי בחירתו, לחיצה על הכרטיסיה התאמה והקשה על התאם פיקסל. הזן פרמטרי התחלה חדשים עבור השלב והתקופה בכרטיסיה התאמה.
הקטן את הקובץ לדוגמה על-ידי בחירת הקובץ המתאים מרשימת הקבצים שהועלה ומתויג. בדוק את כל הפיקסלים והסוות את העניים כמתואר לעיל. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ובחר התאם פעולות, ייבוא שלבים.
עבור קובץ הרזולוציה, התאם אותות הד כפי שתואר קודם לכן עם ערכי התקופה ללא שינוי ונקודת פאזה הד המיובאת מהרזולוציה מתאימה. הזן את מרכז הקרן עבור כל קבצי הנתונים על-ידי גישה לכרטיסיה כללי והזנת ערכי מרכז הקרן X ו- Y שנרשמו מהניסוי. לאחר השלמת ההתאמות, חשב את פונקציית פיזור הביניים מנורמלת על-ידי לחיצה ימינה על הקובץ לדוגמה הרצוי מרשימת הקבצים המותאמים ובחירה באפשרות חשב I of Q מהתפריט הנפתח.
הזן את המידע הנדרש עבור קבצי הרזולוציה והתא ואת מספר Q-arcs בחלון המוקפץ ולאחר מכן הקש אישור כדי להציג תוצאות. שים לב כי הנתונים בציאן מציגים אות גרוע עקב אפקטי קצה גלאי ויש לבטל בעת הידור ערכות נתוני Q שונות. לבסוף, שמור את ערכות הנתונים המופחתות כקבצי ASCII ושמור את ההפעלה כולה כפרוייקט DAVE בתיקיה הרצויה.
במחקר זה, מדידות NSE של דגימות liposomal שהוכנו עם תוכניות תיוג שונות בוצעו. מדידות NSE של תנודות כיפוף ממברנה מבוצעות על ליפוזומים מנוגדים לחלוטין. ערכת פירוק זו גורמת להבדל אורך פיזור גדול בין ליבת הממברנה לסביבת הנוזלים המנוטרלת, משפרת באופן משמעותי את אות הפיזור מהממברנות הליפוזומליות ומשפרת את סטטיסטיקת המדידה של דינמיקת הכיפוף.
מצד שני, מדידות NSE של תנודות עובי הממברנה של ליפוזומים מראות סטיות ביחס ל- Q לתלות השלישית של תנודות כיפוף. כדי לבודד את אות תנודות העובי, האות המתקבל מחולק על ידי Q לשלישי והדינמיקה העודפת מותאמת לפונקציה לורנציאנית ב- Q.שיטה זו מותנית בנתונים באיכות טובה, שהיא ברת השגה יותר עם דגימות של ריכוזים גבוהים ואותות פיזור חזקים. הדינמיקה שנחקרה על ידי NSE יכולה להיחקר בסינרגיה על ידי דיטריום NMR relaxometry וסימולציות מולקולריות-דינמיות כדי להמחיש כיצד מבני שומנים מולקולריים ומוטיבים אריזה משפיעים על תפקודי הממברנה.
מחקרי NSE על ממברנות שומנים לשפוך אור חדש על ביופיסיקה ממברנה, היחסים המורכבים של מבנה הממברנה והדינמיקה, וכיצד הם משפיעים על תפקודי הממברנה ואינטראקציות חלבון ממברנה.
Tags
ביולוגיה גיליון 171 דינמיקה של שומנים קולקטיביים מודולוס כיפוף דחיסת שטח תנודות עובי צמיגות ממברנה תיוג סלקטיבי הכנת ליפוזוםRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
