Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
قياس فلوري المسح الضوئي النانوي للفحص في اكتشاف الرصاص القائم على الشظايا
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
رصد التغيرات في درجة حرارة ذوبان البروتين المستهدف(أي،المقايسة التحول الحراري، TSA) هو وسيلة فعالة لفحص مكتبات جزء من بضع مئات من المركبات. نحن نقدم بروتوكول TSA تنفيذ الروبوتات بمساعدة نانو التفاضلية المسح الفلوري (نانو DSF) لرصد التربتوفان المفلورة الجوهرية والضوء التشتت الخلفي لفحص جزء.
Transcript
هذا البروتوكول مفيد لحملات اكتشاف الرصاص المجزأة كأداة إضافية لاختيار الأجزاء الواعدة كمرشحين للحرارة. يستخدم Nano DSO لفحص الأجزاء كمية محدودة من عينة البروتين غير المبوبة ويمكن استخدامه بشكل روتيني لجميع أهداف البروتين تقريبا. يمكن استخدام هذا الأسلوب لفحص أي مجموعات من ligands.
أو للتحقق من الحرارة من الطرق الأخرى. إخراج لوحة جزء من ناقص 20 أو ناقص 80 درجة مئوية الفريزر والسماح لها ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف على مقاعد البدلاء أعلى شاكر. الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة 30 ثانية لجمع أي قطرات التمسك جانب الآبار.
خذ لوحة تبلور MRC 2-well وماصة 15 ميكرولتر من محلول مخزون البروتين في كل بئر فرعي باستخدام ماصة متعددة القنوات. للتحقق من تعريفات الشظايا والبروتينات على البعوضة، قم بتشغيل موزع النانو وتأكد من عدم وجود عقبات حول المكونات المتحركة. فتح واجهة المستخدم الرسومية، انقر على علامة التبويب الإعداد وتحت سطح السفينة التكوين تحقق ما إذا كان نوع لوحة التي يتم توفير المركبات واحد الذي يتم نقل البروتين موجودة بالفعل في قائمة اللوحات المتاحة.
إذا لم يكن كذلك، انقر فوق خيارات ثم لوحات وإنشاء تعريف لوحة جديدة عن طريق ملء القيم الصحيحة لنوع الخاصية. ضمن علامة التبويب إعداد، حدد موضع اللوحة ضمن تكوين سطح السفينة. باستخدام القائمة المنسدلة، اختر Grainier U لوحة أسفل لموقف واحد وMRC 2-لوحة جيدا للموضع الثاني وحفظ البروتوكول.
ضع لوحة الشظايا في الموضع الأول ولوحة البروتين في الموضع الثاني من سطح السفينة. في علامة التبويب بروتوكول انقر فوق ملف واختر البروتوكول المحفوظة في الخطوة السابقة للاستغناء عن الأجزاء. تعريف حجم الأجزاء التي سيتم الاستغناء عنها ك 0.3 ميكرولتر.
بالنسبة إلى لوحة نموذجية حيث لا يحتوي العمودان الأول والثاني عشر على أجزاء، حدد موقع البدء إلى العمود الثاني، وموقع النهاية إلى العمود 11. في بعض اللوحات، إذا كانت الأعمدة اثنين أو 11 فارغة، استخدم العمودين الثالث وال 10 كقيم بداية ونهاية. انقر على تشغيل لبدء البرنامج.
بعد الاستغناء، الذي يستغرق حوالي دقيقتين يتم الانتهاء، وإزالة البروتين ولوحات جزء من الروبوت وختم لهم مع فيلم ختم لاصقة. طرد مركزي لفترة وجيزة لوحة البروتين في 500 مرة G لمدة 30 ثانية لجمع أي قطرة التمسك الجانبين الآبار قبل الشروع في الخطوة التالية. فحص بصريا آبار لوحة البروتين لهطول الأمطار التي قد وقعت بسبب إضافة شظايا.
إذا لوحظ هطول الأمطار في العديد من الآبار، والحد من تركيز شظايا وتكرار التجربة. قم بتشغيل أداة بروميثيوس. على الشاشة التي تعمل باللمس، اضغط على فتح درج للوصول إلى وحدة تحميل الشعرية من الصك.
إزالة الشريط المغناطيسي من وحدة التحميل وتنظيف المرآة مع الإيثانول لإزالة أي جزيئات الغبار. لنقل محلول من لوحة شظايا البروتين إلى الشعيرات الدموية، ضع لوحة البروتين والشعيرات الدموية بجانب الأداة لتسهيل الوصول إلى وحدة التحميل الشعرية. خذ أحد الشعرية عقد في نهاية واحدة ولمس الحل في لوحة البروتين مع الطرف الآخر من الشعيرات الدموية لنقل العينة.
دائما ارتداء قفازات وتأكد من عدم لمس الشعرية في الوسط والشوائب من القفازات من شأنه أن يؤثر على القياس. ضع الشعرية في الموضع المعين لحامل الحامل، وتأكد من محاذاتها بشكل صحيح وتوسيطها، كرر هذه الخطوات لملء جميع المناصب في وحدة التحميل. في النهاية، ضع الشريط المغناطيسي فوق الشعيرات الدموية لعقدها في مكانها واضغط على إغلاق درج لبدء تجربة Nano-DSF.
فتح تطبيق بروميثيوس العلاقات العامة. ThermControl وإنشاء مشروع جديد بالنقر فوق بدء جلسة عمل جديدة. أولا، القيام بمسح الاكتشاف للكشف عن مضان العينات. تغيير إشارة الفلورسنت للعينات عن طريق ضبط قوة الإثارة من الليزر.
للحصول على التشبع الحراري، انقر على علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي، وتعيين درجة حرارة البدء إلى 20 درجة مئوية، ودرجة الحرارة النهائية إلى 95 درجة مئوية ومنحدر درجة الحرارة إلى درجة مئوية واحدة في الدقيقة. ثم انقر على قياس ابدأ. توزيع التردد للتحول ودرجة حرارة ذوبان الخارجي، الحركية، أو أعرب عنه بشكل كبير في السرطان بروتين واحد، يتم عرض النطاق التنظيمية رباعية الأقطاب تكرار كيناز المغزل الاحتكاري 1، والسارس-CoV-2 3c مثل بروتياز هنا.
وتشير القيم السلبية إلى انخفاض في درجة حرارة الذوبان في وجود جزء، في حين تشير القيمة الإيجابية إلى زيادة في درجة حرارة الذوبان. بالنسبة ل Nsp5 ، يكون لجميع الشظايا تأثير إزالة الاستقرار ، في حين أنه بالنسبة ل Hec1 و Mps1 ، لوحظت كل من استقرار وإزالة الاستقرار. هذه طريقة رخيصة وسريعة لفحص مكتبات الأجزاء.
يمكن أن تظهر طرق أخرى مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير البلوري بالأشعة السينية الربط الدقيق للشظايا وهي متاحة أيضا من خلال اكتشاف INX. ساعدت النتائج مع بروتياز الفيروس التاجي اقتراح مركبات جديدة التي يمكن تطويرها إلى أدوية ضد COVID-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
