Immunology and Infection
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Herstellung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Zellstapeln für präklinische Studien in Großtiermodellen
Chapters
Summary June 30th, 2021
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Hier bieten wir ein detailliertes Verfahren für die großtechnische Produktion von AAV-Vektoren in Forschungsqualität unter Verwendung von adhärenten HEK 293-Zellen, die in Zellstapeln gezüchtet wurden, und affinitätschromatographischer Aufreinigung. Dieses Protokoll liefert konsistent >1 x 1013 Vektorgenomen/ml und liefert Vektormengen, die für Großtierstudien geeignet sind.
Transcript
Dieses Protokoll zur Herstellung von AAV-Virusvektoren ist kostengünstig und liefert ein AAV mit hoher Reinheit und hohem Titer in Forschungsqualität für den Einsatz in präklinischen, großen Tiermodellen. Diese Technik verwendet adhärente HEK293-Zellen in Zellkulturkammern, was zeiteffizient und weniger praktisch ist, was weniger Störungen der Zellen ermöglicht. Dieses Protokoll kann bei der viralen Vektorproduktion für den Bereich der Gentherapie sehr hilfreich sein und kann auch für die Produktion anderer AAV-Serotypen verwendet werden, die ebenfalls Heparansulfat binden.
Um zu beginnen, sammeln Sie HEK293-Zellen aus der Kultur, wenn sie 80% Konfluenz erreicht. Saugen Sie das Medium ab, bevor Sie die Zellkulturplatte vorsichtig mit drei Millilitern PBS waschen. Dann aspirieren Sie PBS und fügen Sie drei Milliliter Trypsin hinzu.
Die Platten zwei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie sieben Milliliter vollständiges DMEM auf die Platte geben und den Überstand in konischen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Drehen Sie die Röhren vorsichtig um, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen sind.
Um die Zelldichte zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter der Zellproben mit 10 Mikrolitern Trypanblau. Und fügen Sie die Mischung zu einem Zellzählobjektträger hinzu, um sie im Zellzähler zu analysieren. Mischen Sie die Zellsuspension mit einem Liter vorgewärmtem vollständigem DMEM, um die Kulturkammer zu sehen.
Drehen Sie die Kammer vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie die Kammer bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Neben der Zellkulturkammer werden Zellen mit 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter in einer 15 Zentimeter großen Platte als Referenz für die Konfluenz kultiviert.
Nach 65 Stunden Inkubation, wenn die Zellen zu 80 bis 90% konfluent sind, fügen Sie langsam die Polyethylenimin-DNA- und DMEM-Mischung in den Zellkulturkammerport hinzu. Verteilen Sie die Flüssigkeit gleichmäßig auf alle Reihen, bevor Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden inkubieren. Schütteln Sie nach der Inkubation die Zellkulturkammer kräftig, um die Zellen zu entfernen, bis das Medium trüb erscheint, und gießen Sie es in vier oder 500 Milliliter Zentrifugenröhrchen.
Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den geklärten Überstand in eine Ein-Liter-PETG-Flasche und resuspenieren Sie die Zellpellets in 50 Milliliter lizenziertem Puffer in 500 Milliliter Zentrifugenröhrchen. Die Röhrchen 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation die Röhrchen 30 Minuten lang bei 18.000 mal G zentrifugieren und den Überstand in dieselbe Ein-Liter-PETG-Flasche geben. Bei minus 80 Grad Celsius lagern. Tauen Sie das Rohlysat über Nacht bei vier Grad Celsius auf.
Nach dem Auftauen filtern Sie es mit einem 0,22-Mikron-Filter. Unmittelbar vor den Reinigungsschritten passivieren Sie den Zentrifugalkonzentrator durch Zugabe von vier Millilitern Filtervorbehandlungspuffer für jede verwendete Heparin-Sepharose-Säule. Legen Sie den Schlauch in eine Peristaltikpumpe.
Führen Sie die Lösungen und Medien nacheinander aus. Bereiten Sie sich auf die Chromatographie vor, indem Sie eine Fünf-Milliliter-Heparin-Sepharose-Säule an den Schlauch anbringen und 25 Milliliter Bazell DMEM durch die Säule laufen lassen. Dann laden Sie 0,2 Mikromol des gefilterten Rohlysats mit einer Durchflussrate von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde auf die Säule.
Waschen Sie die Säule nacheinander, um fünf Milliliter fünfmal mit 300 Millimol Natriumchlorid HBSS, mit Magnesium und Kalzium zu eluieren und die fünf Elutionen als E1 bis E5 zu kennzeichnen. Wenn Sie fertig sind, drehen Sie den Zentrifugalkonzentrator, der den Vorbehandlungspuffer enthält, zwei Minuten lang bei 900 mal G. Verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie den Zentrifugalkonzentratorfilter mit vier Millilitern HBSS mit Magnesium und Kalzium, indem Sie sich zwei Minuten lang bei 1000 mal G drehen.
Dann die Elution E2 zum Zentrifugalkonzentrator geben und fünf Minuten lang mit 1000 mal G drehen. Verwerfen Sie den Durchfluss. In ähnlicher Weise wird die Elution E3 in den Zentrifugalkonzentrator gedreht, bis das konzentrierte Virus etwa einen Milliliter beträgt.
Entfernen Sie das konzentrierte Virus mit einer gefilterten P200-Spitze aus dem Zentrifugenkonzentrator und sammeln Sie es in einem sterilen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nach der Entnahme des Virus spülen Sie den Zentrifugalkonzentrator mit 200 Mikrolitern HBSS mit Magnesium und Kalzium aus. 30 Sekunden lang kräftig auf und ab pipettieren, um alle an der Membran haftenden Viren zu entfernen, und das konzentrierte Virus im selben 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen sammeln.
Mischen Sie die Tube gut. Waschen Sie die Säule und sättigen Sie sie mit 20% Ethanol, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius lagern. Lagern Sie den Pumpenschlauch in einem molaren Natriumhydroxid.
Die Transduktionseffizienz des AAV6.2FF-Kapsids wurde bei Mäusen, Hamstern und Lämmern für 28 Tage bei intramuskulärer Verabreichung verglichen. Mäuse verabreichten fünfmal 10 an das 12. Vektorgenom pro Kilogramm AAV6.2FF humanes IgG, exprimiert zwischen 171 und 237 Mikrogramm pro Milliliter humanem IgG im Serum. Hamster wird zweimal 10 bis zum 13. Vektorgenom pro Kilogramm AAV6.2FF menschlichem IgG verabreicht, ausgedrückt viel höhere Konzentrationen von menschlichem IgG als die Mäuse.
Während das Großtiermodell in der Lage war, durchschnittlich 35 Mikrogramm pro Milliliter an menschlichen IgG-Spiegeln im Plasma zu exprimieren. Große Tiermodelle können die Expression des AAV-Transgens in vivo bestimmen und bestimmen, ob die Transgene eine therapeutische Wirkung gegen die Störung oder Krankheit von Interesse haben. Die Studie hat die große Transduktionsfähigkeit von AAV6.2FF, einem neuartigen AAV 6-Serotyp-Vektor in der Skelettmuskulatur, sowie die geringe Immunogenität von AAV-Virusvektoren in vivo gezeigt.
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