Name: 测量TDP-43蛋白病果 蝇 模型中的葡萄糖摄取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学习使用FRET基因编码葡萄糖传感器在果蝇运动神经元中实时测量葡萄糖摄取的方法。该技术可揭示TDP-43蛋白病神经元代谢变化，为神经退行性疾病研究提供重要见解。

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我们感谢Stefanie Schirmeier和Takeshi Iwatsubo提供 果蝇 菌株。我们还感谢Patricia Jansma在亚利桑那大学Marley影像核心协助成像工作。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）NS091299、NS115514（资助DCZ）、HHMI Gilliam奖学金（资助EM）以及本科生生物学研究项目（资助HB）提供经费支持。

UAS FLII12Pglu-700µδ6 转基因果蝇由 Volkenhoff 等人报道10，并由 S. Schirmeier 博士惠赠。UAS TDP-43G298S 转基因品系由 T. Iwatsubo 博士惠赠13。同时携带 UAS FLII12Pglu-700µδ6 和 UAS TDP-43 转基因的重组 Drosophila 品系由 Zarnescu 实验室采用标准遗传学方法构建，并在 Manzo 等人研究中报道9。使用 D42 GAL4 驱动葡萄糖传感器单独或与 TDP-43G298S 在运动神经元中共同表达。所有果蝇品系均饲养于麦芽糖玉米粉培养基上，在 25 °C、12 小时黑暗:12 小时光照循环条件下培养。
1. Drosophila 腹神经索（VNC）解剖
<ol>
	<li>制备硅胶弹性体解剖皿。
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，将硅胶弹性体组分倒入50 mL离心管中，并充分搅拌。</li>
		<li>向35 mm组织培养皿中加入约2 mL弹性体混合液。使用注射器去除所有气泡。盖上培养皿，置于60 °C烘箱中过夜固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖Drosophila幼虫以暴露腹神经索（VNC），同时维持组织活性。
	<ol>
		<li>取一条游走期三龄幼虫，用ddH2O冲洗，然后将其置于涂有弹性体的培养皿中的一滴HL3缓冲液（70 mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MgCl2，10 mM NaHCO3，115 mM蔗糖，5 mM海藻糖，5 mM HEPES；pH 7.1）中。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用一对镊子（#5或55号镊子）将幼虫的头端和尾端固定，腹面朝下，用昆虫针（Minutein Pins）沿纵向轻轻拉伸幼虫。</li>
		<li>使用斜角虹膜剪，在尾端固定针上方做一切口，然后从切口处开始向幼虫头端进行纵向剪切。</li>
		<li>必要时添加数滴HL-3缓冲液。在不干扰中枢神经系统（CNS）的前提下，移除气管及其他漂浮组织。将体壁瓣固定并展开，以充分暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统（VNC、轴突及神经肌肉接头）完整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 图像采集
<ol>
	<li>优化成像参数。
	<ol>
		<li>在开始解剖前，先打开显微镜和激光器。必须使用配备40倍水浸物镜的直立共聚焦显微镜进行图像采集。使用405 nm激光激发CFP，并在CFP（465–499 nm）和FRET（535–695 nm）检测通道中同时采集图像。</li>
		<li>优化采集参数，包括扫描速度（6）、平均次数（2）、物镜（40倍）、缩放倍数（1倍）、针孔大小（1 AU）和空间分辨率（512 × 512）。调节增益，使信号处于最佳动态范围。所有基因型必须使用相同的参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对腹神经索（VNC）内的运动神经元进行成像。
	<ol>
		<li>将盛有解剖样本的硅胶培养皿置于物镜下。降低物镜，使其接触海藻糖-蔗糖HL3缓冲液（见1.2.1）。必须确保物镜完全浸没在缓冲液中。如有需要，可补充更多缓冲液。</li>
		<li>使用CFP和FRET通道，手动选择一个光学切片，其中应至少包含6个沿腹神经索中线清晰聚焦的运动神经元。运动神经元的识别依据是葡萄糖传感器的表达及其在前后轴上的位置。</li>
		<li>每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表基线水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用添加葡萄糖的HL-3缓冲液进行刺激。
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管移除含海藻糖-蔗糖的HL3缓冲液，并替换为添加5 mM葡萄糖的HL-3缓冲液（70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl2、10 mM NaHCO3、115 mM蔗糖、5 mM葡萄糖、5 mM HEPES，pH 7.1）。此步骤需格外小心，尽可能避免腹神经索移动。</li>
		<li>继续每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表刺激阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将图像保存为.czi文件，或成像软件支持的任何其他文件格式，文件名应包含日期、遗传背景、实验条件（基线或刺激）以及所用通道。</li>
	<li>重复使用相同参数对所有基因型进行成像（图2A）。</li>
</ol>
3. 图像处理与 ROI 选择
<ol>
	<li>在 Fiji/ImageJ 中打开 czi 文件，并设置 颜色模式： 灰度，选择 使用超堆栈查看堆栈，并勾选 将通道拆分为单独窗口。</li>
	<li>使用漂移校正插件（turboreg 和 stackreg）处理图像。每个通道需单独校正：在 插件 菜单下选择 Stackreg，然后选择 变换方式：平移。</li>
	<li>手动选择感兴趣区域（ROIs），以提取每个通道的平均灰度值。
	<ol>
		<li>通过勾画在整个时间序列中始终处于焦点内的所有运动神经元来确定感兴趣区域。使用 ROI 管理器保存每个运动神经元的轮廓。</li>
		<li>使用 多点测量 功能，测量每个时间点各 ROI 内的平均灰度值。将第一个通道中勾画的 ROI 复制到第二个通道的刺激前图像中。</li>
		<li>对每个通道的刺激后图像重复此过程，使用与刺激前图像中相同的细胞/ROI。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用FRET和CFP通道的平均灰度值计算FRET/CFP比值。FRET/CFP比值的变化反映了细胞内葡萄糖浓度的改变。
	<ol>
		<li>绘制每个ROI及时间点的FRET/CFP比值随时间变化的曲线。在每个腹神经索（VNC）中，部分ROI在受到刺激后会表现出FRET/CFP比值下降。 
		注：这被解释为某些神经元无法摄取葡萄糖，可能是由于解剖过程引起的应激所致，因此这些ROI被排除在分析之外。对每个ROI和时间点剩余的FRET/CFP比值进行平均，得到每种基因型（单独葡萄糖传感器和葡萄糖传感器联合TDP-43G298S）在每个时间点的单一FRET/CFP比值。这些单一FRET/CFP比值用于所有后续的归一化处理。葡萄糖传感器对照组分析了31个ROI，TDP-43G298S组分析了24个ROI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基线归一化：计算实验前10分钟（基线）FRET/CFP比值的平均值，然后将整个实验过程中每个时间点的FRET/CFP比值相对于该10分钟基线平均值进行归一化（见图2B）。</li>
	<li>时间点归一化：将TDP-43G298S组的FRET/CFP比值在每个时间点相对于单独葡萄糖传感器组的FRET/CFP比值进行归一化（见图3A）。</li>
	<li>柱状图：以柱状图形式比较基线与刺激状态时，使用每种基因型在5–10分钟（基线）和15–20分钟（刺激）的FRET/CFP比值，并将刺激时的比值相对于基线比值进行归一化（见图3B）。</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>使用 Mann-Whitney 校正（用于基线和时间点归一化）或 Kruskal-Wallis 检验（用于刺激与基线 FRET/CFP 比值的柱状图表示）评估归一化数据集。</li>
</ol>

<ol><li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li>
<li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li>
<li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43%2C+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li>
<li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li>
<li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD%3A+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li>
<li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li>
<li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114(2019).</li>
<li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).</li>
<li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimedica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li>
<li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li>
<li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+for+the+brain%3A+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li>
<li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细描述的技术可用于在活体果蝇（Drosophila）中测量特定感兴趣细胞类型的葡萄糖摄取，所用工具为基于FRET的传感器FLII12Pglu-700µδ6，该传感器可检测毫摩尔浓度范围内的葡萄糖水平变化10,11,12。此前，该传感器已与UAS-GAL4系统联合使用，以实现其在特定细胞类型（包括神经元）中的靶向表达9,10。在本研究中，采用D42 GAL4驱动FLII12Pglu-700µδ6单独表达，或与疾病相关突变TDP-43G298S共同表达，以展示该方法在评估肌萎缩侧索硬化症（ALS）运动神经元葡萄糖摄取中的应用。此外，该方法可广泛应用于幼虫腹神经索（VNC）中多种荧光传感器的成像。
该方案中的关键步骤包括最大化信噪比。为此，设...

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，目前尚无治愈方法。ALS 影响上、下运动神经元，导致运动协调能力丧失、不可逆的瘫痪、呼吸衰竭，并在确诊后 2 至 5 年内最终死亡1. 肌萎缩侧索硬化症与代谢异常相关，例如体重减轻、血脂异常和高代谢状态（详见综述于2）；然而，这些代谢改变与运动神经元变性之间的关系仍不明确。肌萎缩侧索硬化症（ALS）及相关神经退行性疾病的一个共同特征是TDP-43，这是一种核酸结合蛋白，参与RNA加工的多个步骤3,4,5尽管TDP-43基因突变仅影响3%-5%的患者，但在细胞质包涵体中可检测到野生型TDP-43蛋白 &#62;97%的肌萎缩侧索硬化症病例（综述见于6）。该病理在 果蝇 通过在运动神经元中过表达人源野生型或突变型TDP-43（G298S），模拟了肌萎缩侧索硬化症（ALS）的多个特征，包括细胞质包涵体、运动功能障碍以及寿命缩短7,8利用这些模型，最近有报道称，TDP-43 蛋白病可导致丙酮酸水平以及糖酵解限速酶磷酸果糖激酶（PFK）mRNA 显著升高9在源自患者的运动神经元和脊髓中也发现了PFK转录本的类似升高，提示在TDP-43蛋白病背景下糖酵解通路被上调。有趣的是，在TDP-43蛋白病的果蝇模型中，通过饮食和遗传手段进一步增强糖酵解，可缓解多种肌萎缩侧索硬化（ALS）表型，如运动功能障碍，并延长寿命，这与变性运动神经元中存在代偿性神经保护机制的假说一致。
为进一步探究糖酵解的变化并测量葡萄糖摄取量 果蝇 TDP-43 蛋白病的模型，一种先前报道的基于基因编码的荧光共振能量转移（FRET）传感器 FLII12Pglu-700µδ610 使用UAS-GAL4表达系统在运动神经元中特异性表达。FLII12Pglu-700µδ6葡萄糖传感器利用两种绿色荧光蛋白变体——青色和黄色荧光蛋白（CFP和YFP）之间的共振能量转移，在细胞水平上检测葡萄糖。该传感器包含一个来自细菌的葡萄糖结合结构域 大肠杆菌 MglB 基因在分子的两端分别与CFP和YFP融合。当与葡萄糖分子结合时，该传感器发生构象变化，使CFP与YFP相互靠近，从而允许发生FRET，借此可定量细胞内葡萄糖水平。10,11,12 (图1）。在此，我们展示了如何利用FLII12Pglu-700µδ6传感器检测运动神经元中因TDP-43蛋白病变引起的葡萄糖摄取变化。本文所述实验表明，过表达与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的突变型TDP-43G298S在运动神经元中，与对照组相比，葡萄糖摄取显著增加。该方法可用于其他类型的肌萎缩侧索硬化症（如 SOD1、C9orf72 等）和/或其他细胞类型（如胶质细胞、肌肉细胞），以确定与神经退行性变相关的葡萄糖摄取变化。

<table><tbody><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>40X 水浸物镜</td><td>Zeiss</td><td>440090</td><td>可浸入式，数值孔径 0.8</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-5618</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>VWR</td><td>100189-236</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>VWR</td><td>100189-244</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 固定针</td><td>细科学工具公司（Fine Science tools）</td><td>26002-10</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>陶氏化学（Dow）</td><td>1317318</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM880 NLO 直立式多光子/共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

测量葡萄糖摄取 果蝇 tdp-43蛋白病变模型

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

肌萎缩侧索硬化症是一种神经退行性疾病，诊断后2至5年内可导致进行性肌肉无力并最终死亡。临床表现包括体重减轻、脂质代谢紊乱和代谢亢进；然而，这些表现与运动神经元退行性变之间的关系尚不明确。利用一种 果蝇 TDP-43蛋白病模型可重现肌萎缩侧索硬化（ALS）的多种特征，包括胞质包涵体、运动功能障碍和寿命缩短。我们近期发现该模型存在广泛的代谢缺陷。其中，糖酵解被发现上调，遗传互作实验进一步揭示了一种代偿性神经保护机制。事实上，尽管糖酵解限速酶磷酸果糖激酶表达上调，但通过饮食和遗传手段进一步增强糖酵解可显著缓解TDP-43蛋白病果蝇模型的运动功能障碍，并延长其寿命。为深入探究TDP-43蛋白病对运动神经元糖酵解通量的影响，我们采用了此前报道的一种基于FRET的遗传编码传感器FLII12Pglu-700µδ6。该传感器由细菌葡萄糖感应结构域以及作为FRET对的青色和黄色荧光蛋白组成。当结合葡萄糖时，传感器发生构象改变，从而允许FRET发生。利用FLII12Pglu-700µδ6，我们发现表达TDP-43的运动神经元中葡萄糖摄取显著增加。G298S，一种导致肌萎缩侧索硬化症的变异。在此，我们展示如何测量葡萄糖摄取， 离体在表达葡萄糖传感器FLII12Pglu-700µδ6的TDP-43蛋白病模型幼虫腹神经索制备物中。该方法可用于测量不同细胞类型中的葡萄糖摄取，并评估导致肌萎缩侧索硬化症及相关神经退行性疾病的各种突变背景下的糖酵解通量。

腹神经索（VNC）中葡萄糖传感器的图像采集， 离体 
为了确定葡萄糖摄取的差异 果蝇 基于TDP-43的肌萎缩侧索硬化症模型中，使用了一种基因编码的基于FRET的葡萄糖传感器。该传感器由CFP和YFP与来自葡萄糖结合域的蛋白融合而成 大肠杆菌 MglB 基因。葡萄糖结合会引发构象变化，该变化可通过 CFP 与 YFP 之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。 10,11,12当葡萄糖未结合传感器时，CFP激发仅产生CFP发射信号；当葡萄糖结合后，由于CFP与YFP之间发生FRET，可检测到YFP信号。图1A）。使用 D42 GAL4 驱动子单独表达传感器，或与 ALS 相关的突变型 TDP-43 共同表达G298S 通过双组分UAS-GAL4...

在受TAR DNA结合蛋白（TDP-43）蛋白病影响的Drosophila运动神经元中，葡萄糖摄取增加，这一结果由基于FRET的遗传编码葡萄糖传感器检测得出。

测量葡萄糖摄取 果蝇 TDP-43蛋白病变模型

肌萎缩侧索硬化症是一种神经退行性疾病，诊断后2至5年内可导致进行性肌无力并死亡。临床……

该技术具有重要意义，因为它能够测量活体果蝇组织中特定细胞的葡萄糖摄取情况。基于FRET的传感器可直接反映细胞内葡萄糖水平的变化。该技术使研究人员能够实时评估ALS模型与对照组中活体运动神经元内葡萄糖水平的变化。一个具有挑战性的方面是在更换缓冲液后对同一组神经元进行成像。将样品保留在显微镜上有助于确保虚拟显微镜坐标（VMC）的移动尽可能小。在开始解剖之前，打开成像显微镜和激光器。然后选取一条游走期三龄幼虫，用双蒸水冲洗，并将其置于预先准备好的、底部铺有弹性材料的培养皿中的HL3缓冲液滴内。接着在解剖显微镜下，用镊子固定幼虫的前端和后端，背面向上，用昆虫针小心地沿幼虫长轴方向轻轻拉伸固定。使用一对斜角虹膜剪，在后端固定针的稍上方做一切口。然后从切口处向幼虫前端做一纵向切口。如需要，加入几滴HL3缓冲液，随后去除气管及其他游离器官，注意不要损伤中枢神经系统。接着用解剖针固定两侧组织瓣，拉伸体壁以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统的完整性。进行图像采集时，使用配备40倍水浸物镜的直立共聚焦显微镜。然后选择405纳米激光激发CFP。接着优化采集参数，如扫描速度、平均次数、物镜、缩放倍数、针孔大小和空间分辨率。调节增益，使信号处于最佳动态范围，并对所有基因型使用相同的参数。为成像腹神经索中的运动神经元，将盛有解剖样本的硅胶培养皿置于物镜下，降低物镜直至其接触海藻糖-蔗糖HL3缓冲液。确保物镜完全浸没在缓冲液中，必要时添加更多缓冲液。下一步。使用CFP和FRET通道，手动选择位于腹神经索中线、处于焦平面且至少包含六个运动神经元的光学区域。随后每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表基线水平。进行葡萄糖刺激时，使用巴斯德吸管移除含有海藻糖和蔗糖的HL3缓冲液，加入含5毫摩尔葡萄糖的HL3缓冲液，注意不要移动腹神经索。随后每10秒采集一次图像，持续10分钟。这些图像代表刺激阶段。将图像保存为 CZI 文件或成像软件支持的任何文件类型，文件名应包含日期、遗传背景、实验条件以及所使用的通道。重复使用相同的参数对所有基因型进行成像。进行图像处理时，打开 Fiji-ImageJ 成像软件，然后打开 CZI 文件，选择以超堆栈（hyper stack）方式查看堆栈，将颜色模式设置为灰度，并选择将通道拆分为独立窗口。下一步。使用漂移校正插件 turbo reg 和 stack reg 处理图像。每个通道需单独校正：在插件中选择 stack reg，然后选择变换模式为平移。通过手动追踪在整个时间序列中始终保持清晰对焦的所有运动神经元，来选定感兴趣区域（ROI）。然后使用 ROI 管理器保存每个运动神经元的轮廓。利用多测量功能，测量每个 ROI 在每个时间点的平均灰度值。接着将从第一通道追踪到的 ROI 复制到第二通道，用于刺激前的图像。进行数据分析时，使用FRET和CFP通道的

measuring-glucose-uptake-in-drosophila-models-of-tdp-43-proteinopathy

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

测量TDP-43蛋白病果 蝇 模型中的葡萄糖摄取

用于测量运动功能、学习和记忆能力的行为学实验 果蝇.

评估运动、学习和记忆功能障碍 果蝇 神经退行性疾病模型

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胰岛素敏感性检测中的胰岛素注射与血淋巴提取方法

该视频展示了一种利用基于荧光共振能量转移（FRET）的细胞内葡萄糖传感器，测量果蝇（Drosophila）幼虫运动神经元葡萄糖摄取的技术。在解剖幼虫以暴露腹神经索后，可通过传感器供体荧光团发出的荧光观察运动神经元。当葡萄糖刺激时，传感器的供体与受体荧光团之间发生FRET，触发受体荧光团发射荧光，从而实现对照组幼虫与葡萄糖代谢上调突变体幼虫之间葡萄糖摄取水平的比较。...

评估运动神经元中的葡萄糖摄取 果蝇 葡萄糖代谢上调的幼虫

代谢紊乱是人类最常见的疾病之一。利用遗传操作简便的模式生物 D. melanogaster 可用于鉴定调控代谢的新型基因。本文描述了一种相对简单的方法，通过测量果蝇的 CO2...

使用呼吸测定法测量 Drosophila 的代谢率

本文介绍了一种测量黑腹果蝇（Drosophila...

测量放射性标记底物在Drosophila melanogaster中产生的二氧化碳

越来越多的证据表明，与神经退行性疾病相关的致病性蛋白质聚集体具有类似朊病毒的特性，可在细胞间传播。本文介绍了一种可在模式生物黑腹果蝇（Drosophila...

监测朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传播 黑腹果蝇

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

荧光标记葡萄糖的细胞外耗竭与葡萄糖摄取相关，可用于离体器官和细胞培养中葡萄糖摄取的高通量筛选。...

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 Ex Vivo

本文介绍了一种利用基因编码的基于 Förster 共振能量转移的传感器，在果蝇幼虫脑离体标本中可视化单羧酸盐、葡萄糖和 ATP...

可视化单羧酸盐及其他相关代谢物在 离体果蝇实验 利用基因编码传感器研究幼虫大脑

本方案介绍了一种基于α-突触核蛋白建立便秘模型的实验方法 果蝇 帕金森病模型...

测量便秘 果蝇 帕金森病模型

学习使用FRET基因编码葡萄糖传感器在果蝇运动神经元中实时测量葡萄糖摄取的方法。该技术可揭示TDP-43蛋白病神经元代谢变化，为神经退行性疾病研究提供重要见解。

测量葡萄糖摄取果蝇 TDP-43蛋白病变模型

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测量葡萄糖摄取 果蝇 TDP-43蛋白病变模型

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测量葡萄糖摄取果蝇 TDP-43蛋白病变模型