Kryosektion Dissektion af den voksne subependymale zone til nøjagtig og dyb kvantitativ proteomanalyse

Vores dissektionsmetode tillader præcis isolering af ventrikulær neurogen niche og er derfor velegnet til at studere det molekylære mikromiljø i denne niche. Den største fordel ved denne dissektionsmetode er, at den er præcis, effektiv og forårsager minimal vævsforstyrrelse, mens den stadig er kompatibel med massespektrometri til proteomanalyse. I denne protokol ekstraherer vi ventrikelens neurogene niche fra en musehjerne, men denne metode kan også anvendes på andre arter og i forskellige tilstande af sundhed og sygdom.

Teknikken kan kræve noget træning. især med skalpel skærer, når udsætter og udvinde ventrikulær neurogenic niche. Efter aflivning af en 8-til 10 uger gammel C57 sort / 6 mandlig mus, udtrække hjernen ved manuel dissektion og placere den i en kultur skål, der indeholder iskold dissektion medium.

Brug en skalpel, fjern olfaktoriske pære ved at lave en lige koronar skåret mellem den olfaktoriske pære og den indvendige stang af cortex. Fjern derefter cortexens forreste stang ved at lave et koronarklip, så de laterale hjertekamre er synlige i koronarplanet. Derefter åbner du ved hjælp af en saks begge de laterale hjertekamre fra toppen, begyndende med den sagittale sektion fra den kortikale overflade til ventrikulær lumen.

Aflange dette snit i en C-formet måde efter ventrikulær fleksion. Derefter forbinde de kaukale ender af venstre og højre sagittal snit, beskæftiger en ekstra koronar snit. Fjern derefter cortex og corpus callosum, der dækker de mediale ventrikulære vægge.

Hvis vævet er fastgjort til de mediale ventrikulære vægge, foretage yderligere nedskæringer eller løfte cortex og corpus callosum med en saks til at løsne vævet. Derefter, ved hjælp af sammenkædninger, fjerne cortex og corpus callosum dækker de laterale hjertekamre. Brug sammenkramper, spred forsigtigt ventrikulære vægge og fjern choroid plexus.

Sæt derefter hjernen på en glasrutschebane og læg diaset oven på tøris for at fryse hjernen med ventrikulære vægge i den åbne konfiguration. Før sektionsopdelning skal du sikre dig, at hjernen er fastgjort til kryostat vedhæftede plade på baghjernen med et indlejringsmedium til frosset væv. Derudover skal du sikre dig, at intet indlejringsmedium kommer i kontakt med forhjernen, især ved hjertekamrene.

Derefter skæres 50-til 100-mikrometer-tykke koronar dele af hjernen indtil slutningen af den laterale ventrikel, og monter sektionerne på glasrutschebanerne. Placer glasrutschebanerne på tøris under et dissektionsmikroskop. Løft skiverne fra tørisen i 15 til 30 sekunder for at opnå en kort, ufuldstændig optøning, hvilket gør striatums kompakte myelin observerbar som tætte hvide prikker.

Derefter, ved hjælp af en forkølet skalpel, adskille subependymal zone fra den tilstødende striatum, og overføre det som et helt stykke eller opdelt i to til fire dele i en mikrocentrifuge rør ved hjælp af den stumpe kant af den afkølede skalpel. Så gør det samme for den mediale ventrikulære zone. Myelin-associerede, glycoprotein-positive interne kapsler af striatum blev identificeret i helemount prøverne, men sjældent i kryo-sektion-dissektion prøver via immunohistochemistry.

Striatal kontaminering i helmonterede prøver blev bekræftet ved berigelse af myelinproteiner i den subependymale zone sammenlignet med de somato-sensoriske cortexprøver. I modsætning hertil viste sammenligninger af disse myelinmarkørproteiner i kryosektionsdektionsprøverne ingen signifikante forskelle i subependymal zone og somato-sensoriske cortexprøver. Ved sammenligning af massespektrometriresultater mellem kryosektionsdektion og laserfangst af mikrodissement gav laserfangstmikrodisction ca. halvt så mange kvantificerede proteiner, selv om vævskollektionstiden var ca. dobbelt så lang.

Principkomponentanalyse afslører, at der er større variation blandt prøver indsamlet med laserfangst mikroissektion, afbildet som firkanter, end blandt dem indsamlet med kryo-sektion-dissektion, afbildet som cirkler. En 2D anmærkning berigelse test mellem kryo-sektion-dissektion og laser fange mikrodissection for subependymal og mediale ependymal zoner afslørede lignende berigelse i både metoder og regioner for proteiner forbundet med det ekstracellulære rum. Kryo-sektion-dissektion giver en mere robust identifikation og kvantificering af neurogenese i subependymal zone-associerede ekstracellulære matrix proteiner.

I tilfælde af tenascin-C, kun kryo-sektion-dissektion viste berigelse i den subependymale zone i forhold til den mediale ependymal zone. Sørg for, at hjernesektionerne på diasene ikke bliver helt optøet. Samlet set er det godt at øve trinene i dissektionsproceduren for et ensartet resultat.

Dissektionsmetoden kan også bruges sammen med andre proteinanalysemetoder, der let kan detektere meget lave rigelige proteiner, såsom vækstfaktorer og cytokiner. Denne mikroissektionsmetode gjorde det muligt for os at identificere en ny neurogeneseregulator, og vi mener, at det vil give andre mulighed for at identificere andre regulatorer af neurogenese i forskellige sammenhænge.