Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Free Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

Bruk av in vivo imaging for å skjerme for morfogenese fenotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infeksjon i en pattedyrvert

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Journal (Immunology and Infection)

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Journal (Immunology and Infection)

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Click here for the English version

Bruk av in vivo imaging for å skjerme for morfogenese fenotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infeksjon i en pattedyrvert

Article DOI: 10.3791/64258-v

October 12th, 2022 •

Rohan S. Wakade¹, Damian J. Krysan^1,2, Melanie Wellington¹

¹Department of Pediatrics, Carver College of Medicine, University of Iowa, ²Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 12th, 2022

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Dette manuskriptet beskriver en metode for screening av moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon hos en pattedyrvert ved bruk av ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Transcript

Candida albicans morfogenese utløses av et mylder av miljøsignaler. Ved å studere morfogenese in vivo, bestemmer vi hvordan organismen integrerer og reagerer på alle disse miljøsignalene. Den største fordelen med denne teknikken er at den lar oss studere morfogenese i fravær av bias eller gjenstander som kan introduseres ved hjelp av in vitro-modellsystemer.

Svært få mennesker har erfaring med intradermale injeksjoner. Jeg anbefaler på det sterkeste at noen som er nye i denne teknikken, kontakter dyreressursveterinæren for å få hjelp til å lære den. Rohan Wakade, en postdoktor fra vår laboratoriegruppe, demonstrerer prosedyren.

Begynn med å forberede dyret til inokulering ved å mate klorofyllfri chow i minst syv dager før inokulering. En dag før injeksjon, ta en dab av Canada albicans celler fra en koloni ved hjelp av en tannpirker. Inokulere 25 milliliter YPD og gjenta denne prosessen flere ganger for å oppnå celler fra flere forskjellige kolonier.

Inkuber kulturen over natten ved 30 grader Celsius i en orbital shaker-inkubator ved 175 RPM. Sentrifuge en milliliter kultur i to minutter ved 500 x g, vask deretter gjæren tre ganger med en milliliter steril DPBS. Resuspend pelleten i en milliliter steril DPBS og fortynn kulturen ved 1 til 100.

Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og juster dermed celletettheten. Deretter lager du inokulum til injeksjon ved å blande like store mengder av den refererte og eksperimentelle stammen. Bruk en bomullspinne, påfør en over-the-counter hårfjerningskrem liberalt på den indre og ytre overflaten av begge ørene til et bedøvelsesdyr.

Etter to til tre minutter, tørk forsiktig øret med en tørr gasbind etterfulgt av gasbind pads mettet i sterilt vann for å fjerne hårfjerningskremrester grundig. Etter sterilisering av ørens overflate med 70% etanol, bland inokulumet godt ved å snu hetteglasset flere ganger eller vortexing det. Trekk 20 til 30 mikroliter inokulum i en insulinsprøyte.

Hold nålen i stående stilling og bank forsiktig på sprøyten for å sikre at det er luft i sylinderen øverst. Kast forsiktig ut luft og overflødig inokulum tilbake i inokulumrøret eller et avfallsrør slik at stempelet er på 10 mikrolitermerket. Påfør over disken dobbeltsidig hudbånd på et lite konisk eller rundbunnet plastrør og draper øret over båndet, unngå å løsne anestesi nesekeglen.

Hold sprøytenålen nesten parallelt med huden og unngå store årer, sett spissen av nålen inn i det ytterste laget av huden til skråningen bare er dekket og injiser inokulumet sakte intradermalt. En god intradermal injeksjon vil heve en liten boble i huden. Hold nålen på plass i 15 til 20 sekunder før du fjerner den fra øret for å minimere lekkasje.

Etter institusjonelle protokoller, merk buret med biohazard etiketter som indikerer at dyr i buret er infisert med Candida albicans. Ved å bruke de samme vasket kulturer som ble brukt til å forberede inokulumet, lage en 1 til 50 fortynning av celler i RPMI 1640, supplert med 10% varme og aktivert føtalt bovint serum og inkubere ved 37 grader Celsius med tumbling i fire timer. Undersøk prøven ved hjelp av et mikroskop.

Telle minst 100 celler, registrere antall gjær og filamentøse celler for hver stamme. Roter målet for lang arbeidsavstand på plass og legg en dråpe nedsenkningsvæske på linsen. Senk linsen for å unngå mulig skade når du plasserer dekselet.

Plasser deksel nummer 1.5 over sceneåpningen og teip det på plass. Løft målet slik at nedsenkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dekselet. Sikre en anestesi nesekjegle på mikroskopstadiet på en slik måte at den vil dekke dyrets nese fullt ut når den er på plass for avbildning.

Plasser nesen til en bedøvet mus i nesekeglen. Plasser en dråpe sterilt vann på dekselet over objektivlinsen. Juster anestesi nesekeglen og plasser musen slik at musens øre er over vanndråpen.

Ta en annen dekselslipp og plasser dekselets kant parallelt med musens kropp med kanten som berører musen der øret møter hodet. Bruk en hengselbevegelse til å senke den frie kanten av dekselet til mikroskoptrinnet. Når dekselet glir mot mikroskopstadiet, vil det flate øret.

Teip toppdekselet godt for å holde akkurat nok trykk til å holde øret flatt og unngå å fange musens hår eller værhår i båndet. Med mindre et mikroskop med et miljøkammer brukes, dekk musens kropp løst med en steril drapering for å opprettholde et normalt termisk miljø. Ved hjelp av hvitt lys, widefield-bildebehandling, juster fokusplanet inn i ørevevet og fokuser på de røde blodcellene som beveger seg i blodkarene.

For å oppnå et sterkt nok signal / støyforhold slik at morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet, juster lasereffekten eller bildehastigheten. For å unngå vevskader, bruk lavest mulig lasereffekt. Velg et synsfelt med tydelig filamentdannelse i den refererte stammen og hvor de fleste organismer er spredt ut nok til at deres morfologi kan bestemmes.

Angi fokus øverst og nederst for en Z-stakk. Det er ikke nødvendig å dekke hele dybden av det infiserte området, men husk at organismer øverst eller nederst i bildevolumet vanligvis utelukkes fra analysen. Skaff Z-stack-bilder, pseudofarge hver kanal for å skille hver belastning og overlegg kanalene.

Lagre bildene. Bruk bildebehandlingsprogramvare til å utføre en maksimal projeksjon av Z-stakken i et todimensjonalt bilde. Tell hver organisme sett i de maksimale projeksjonsbildene etter belastningstype og morfologi.

Den refererte stammen danner raskt filamenter in vitro. Mens EFG1 Null ikke klarte å danne filamenter. EFG1 Null utviser også en betydelig filamentasjonsdefekt in vivo.

Omtrent 9 % av EFG1 Null-celler vokste som filamenter in vivo. På samme måte viste CYR1 Null mutantstammen en filamentasjonsdefekt in vitro sammenlignet med den refererte stammen. Derimot vokste 53 % av CYR1 Null mutantcellene som filamenter in vivo.

Filamentene dannet av CYR1 Null-mutanten var kortere enn den refererte stammen. Det er viktig å holde nålen parallell med huden under inokulasjon. Målet er å plassere inokulum like under det ytre laget av huden.

Denne teknikken kan også brukes med musestammer som uttrykker et fluorescerende protein i vertsceller av interesse, slik at vi kan studere vertspatogeninteraksjoner in vivo.

X

Simple Hit Counter