Name: 基于CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白的基因数字电路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习利用CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白在酿酒酵母中构建基因数字电路的方法。本方案通过Gibson组装和PCR技术建立合成转录网络，为合成生物学研究提供新框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢天津大学合成生物学实验室（SPST）所有学生的一般性帮助，同时感谢李志和张向阳在FACS实验中的协助。

<ol><li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).</li>
<li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Institute+of+Electrical+Engineers%22%5BJournal%5D)">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li>
<li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+finger+tools%3A+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li>
<li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+effectors%3A+customizable+proteins+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li>
<li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li>
<li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459(2017).</li>
<li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194(2019).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bare+dSpCas9%2C+scaffold+gRNA%2C+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li>
<li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning.+Fourth+edition%22">Molecular Cloning. Fourth edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li>
<li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19(2016).</li>
<li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li>
<li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li>
<li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179(2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).</li>
<li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flowCore%3A+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106(2009).</li>
<li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11(2018).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案展示了一种合成基因数字电路的完整工作流程，遵循&#34;设计-构建-测试-学习&#34;（DBTL）生物工程循环，并涵盖干实验与湿实验两方面。本文重点研究CRISPR-Cas系统，主要包括dSpCas9、denAsCas12a、dLbCas12a以及相应的抗CRISPR蛋白，通过在S. cerevisiae中设计和构建小型转录调控网络来实现。其中部分网络模拟了布尔逻辑门，即数字电路的基本组成单元。本文所描述的所有电路均有助于揭示CRISPR相关蛋白及抗CRISPR蛋白在S. cerevisiae中的特性与功能。这些结果对于将上述蛋白纳入基因数字电路体系具有重要意义。
DBTL 概念为合成生物学提供了一个框架，但在测试新构建物后还需进行大量优化和改进。例如，在电路1中，最初合成启动子上游的 yEGFP 仅含有一个靶位点（一个 lexOp 拷贝），供 dCas9/dCas12a-AD 结合。在测试该电路构型后，我们发现其激活效果不超过两倍15,<sup class="xref...

2011年，研究人员提出了一种计算方法，并开发了相应的软件，用于自动设计数字合成基因回路1用户需指定输入端数量（三个或四个），并填写电路的真值表；这提供了利用电子学技术推导电路结构所需的全部信息。真值表被转化为两个布尔表达式 通过 卡诺图法2每个布尔公式由子句构成，这些子句描述了电路输入及其否定（即文字）之间部分或全部的逻辑运算（加法或乘法）。子句本身则通过相加（OR）或相乘（AND）来计算电路输出。任何电路均可根据其对应的两种公式之一实现：一种为积之和（POS，product of sums）形式，另一种为和之积（SOP，sum of products）表示。前者由多个子句（即布尔门）相乘构成，每个子句包含文字的逻辑加；后者则相反，是由多个子句相加而成，每个子句中的文字先进行逻辑乘。
通过在面包板上将不同的门电路进行物理连接，可以实现电子电路。电流允许门电路之间交换信号，从而计算出输出结果。
在生物学中，情况更为复杂。布尔门可以通过转录单元（TU；即真核细胞内“启动子-编码区-终止子”序列）来实现，其中转录或翻译（或两者）受到调控。因此，至少有两种分子构成了生物线路：转录因子蛋白和非编码的反义RNA1。
基因数字电路分为两层或三层逻辑门，即：1）输入层，由YES（缓冲）门和NOT门组成，将输入的化学物质转化为配线分子；2）内部层，包含的转录单元（TU）数量与相应布尔表达式中的子句数量相等。如果电路按照积之和（SOP）表达式设计，则内部层中的每个子句都会在所谓的分布式输出架构中产生电路输出（例如荧光）。如果采用和之积（POS）表达式，则需要第3）输出层，该层包含一个单一的乘法门，用于汇集来自内部层的配线分子。
总体而言，在合成生物学中，针对同一回路可以设计出多种不同的方案。这些方案在转录单元（TUs）的数量与类型以及连接分子的种类和数量上各不相同。为了选择最适合在酵母细胞中实现的最简便方案，每种回路设计都对应一个复杂度评分 S，其定义如下：
<img alt="静态平衡方程：\( S = 2^{A-1} + 2^{R-1} + a \)；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">
其中 A 表示激活因子的数量， R 代表阻遏蛋白的数量，以及 a 是反义RNA分子的数量。如果电路中缺少激活因子或抑制因子，则它们对S的贡献为零。因此，当电路设计需要大量正交转录因子时（S值较高），在实验室中实现该电路方案的难度更大。这意味着需要对新的激活因子和抑制因子进行工程化设计。 从头合成 为了实现数字电路内部的完整布线。原则上，可以通过使用锌指蛋白来组装新型DNA结合蛋白3 和TAL效应子4 作为模板。然而，此方法显得过于繁琐且耗时；因此，应主要依赖小RNA和翻译调控来完成复杂基因线路的构建。
最初，该方法被开发用于在细菌中构建数字电路。实际上，在真核细胞中，相较于反义RNA，更合适的说法是微小RNA（miRNA）或小干扰RNA（siRNA）5。然而，RNAi通路并不存在于酵母S. cerevisiae中。因此，应选择完全基于转录的调控网络。假设一个电路需要五个激活因子和五个抑制因子，则其复杂度评分为 S = 32。通过用单个dCas96（核酸酶失活的Cas9）融合激活结构域（AD）来替代这10个转录因子，可降低电路的复杂性。如文献7所示，当dCas9-AD结合于TATA框与转录起始位点（TSS）之间时，在酵母中起抑制作用；而当其结合于TATA框上游较远位置时，则发挥激活作用。因此，可以用一个dCas9-AD融合蛋白和10条sgRNA（单导向RNA）替代原有的10个转录因子，使总复杂度评分降至 S = 11。合成10条sgRNA快速且简便，而正如前文所述，组装10个蛋白质则需要更长时间且操作更为复杂。
或者，可以使用两种正交的dCas蛋白（例如dCas9和dCas12a）：一种与激活结构域（AD）融合，另一种保持无修饰状态，或与抑制结构域联用。该方案的复杂度评分仅增加一个单位（S = 12）。因此，CRISPR-dCas系统是构建酿酒酵母（S. cerevisiae）中高度复杂基因数字电路的关键。
本文深入表征了基于dCas9和dCas12a的抑制子与激活子在酵母中的效率。结果表明，这些系统无需大量sgRNA即可优化其活性，因此优先避免使用附加体质粒。此外，当使用能够招募多个VP64激活结构域（AD）的支架RNA（scRNA）时，基于dCas9的激活子效果显著更强。相比之下，dCas12a则在直接融合强效的VPR激活结构域时表现良好。进一步发现，合成激活型启动子所需的靶位点数量可变，具体取决于激活子的构型（例如，使用dCas12a-VPR时需要三个靶位点，dCas9-VP64需要六个，而dCas9结合scRNA时仅需一个）。作为抑制子，dCas12a在结合编码区时比结合启动子区域表现出更强的抑制效果。
然而，CRISPR-dCas9/dCas12a 的一个缺点是不能直接与化学物质相互作用，因此它们在输入层可能无法发挥作用。为此，研究人员已探索了包含抗CRISPR蛋白（Acrs）的替代型布尔逻辑门设计。Acrs可作用于(d)Cas蛋白并抑制其功能8，因而可作为调控CRISPR-(d)Cas系统活性的手段。本文系统分析了II型Acrs与(d)Cas9以及V型Acrs与(d)Cas12a在S. cerevisiae中的相互作用。由于Acrs比Cas蛋白小得多，研究人员通过将人雌激素受体的激素结合域9-HBD（hER）与AcrIIA4融合，构建了一个响应雌激素β-雌二醇的非门（NOT gate）。此外，还实现了若干在半乳糖诱导下表达AcrVAs、并组成型表达dCas12a(-AD)的是门（YES gate）和非门（NOT gate）。目前，这些逻辑门仅作为概念验证。然而，它们也代表了深入重新思考酵母细胞中合成基因数字电路自动化计算设计算法的第一步。

<table><tbody><tr><td>0.1 mL PCR 8联管</td><td>NEST</td><td>403112</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（分子生物学级）</td><td>Invitrogen</td><td>75510-019</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems Veriti 96孔梯度PCR仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒</td><td>Axygen</td><td>AP-GX-250</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSuite CS&amp;T 研究用荧光微球</td><td>BD</td><td>650621</td><td>荧光微球</td></tr><tr><td>BD FACSVerse 流式细胞仪&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 感受态细胞（DH5&amp;alpha;菌株）</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>ECL Select 蛋白印迹检测试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪</td><td>北京君意电泳设备有限公司</td><td>JY300C</td><td></td></tr><tr><td>平盖8联管盖</td><td>NEST</td><td>406012</td><td></td></tr><tr><td>基因合成公司</td><td>Azenta Life Sciences</td><td></td><td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>HiFiScript cDNA合成试剂盒</td><td>CWBIO</td><td>CW2569M</td><td>步骤6.2.2.1中使用的试剂盒</td></tr><tr><td>裂解液（Zymolyase）</td><td>zymoresearch</td><td>E1004-A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i 荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;mdash;10 &amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>T-300-R-S</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;mdash;1000 &amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B-R-S</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;mdash;200 &amp;mu;L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>pRSII403</td><td>Addgene</td><td>35436</td><td></td></tr><tr><td>pRSII404</td><td>Addgene</td><td>35438</td><td></td></tr><tr><td>pRSII405</td><td>Addgene</td><td>35440</td><td></td></tr><tr><td>pRSII406</td><td>Addgene</td><td>35442</td><td></td></tr><tr><td>pRSII424</td><td>Addgene</td><td>35466</td><td></td></tr><tr><td>pTPGI_dSpCas9_VP64&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>49013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶-Acc65I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0599</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶-BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶-SacI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶-XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 96&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>-</td><td>实时荧光定量PCR仪</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. cerevisiae&lt;/em&gt; CEN.PK2-1C</td><td>-</td><td>-</td><td>亲本菌株，基因型为：MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289;&lt;br/&gt; MAL2-8c; SUC2</td></tr><tr><td>Stem-Loop 试剂盒</td><td>SparkJade</td><td>AG0502</td><td>步骤6.2.1.3中使用的试剂盒</td></tr><tr><td>T100 梯度PCR仪</td><td>BIO-RAD</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>T5 核酸外切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0495</td><td></td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x)（SYBR Green I染料）</td><td>Takara</td><td>RR820Q</td><td></td></tr><tr><td>YeaStar RNA提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1002</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875</td><td></td></tr></tbody></table>

基于crispr-cas系统与抗crispr蛋白的基因数字电路

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

合成基因布尔门与数字电路在医学诊断到环境护理等多个领域具有广泛应用。CRISPR-Cas 系统及其天然抑制因子——抗 CRISPR 蛋白（Acrs）的发现，为设计和实现 体内 基因数字电路。本文描述了一种遵循“设计-构建-测试-学习”生物工程循环理念的实验方案，该方案利用dCas9/dCas12a及其相应的Acr蛋白，在细胞内构建小型转录调控网络，其中部分网络可表现出布尔逻辑门的行为， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）这些结果揭示了dCas9/dCas12a作为转录因子的特性。具体而言，为实现基因表达的最大程度激活，dSpCas9需要与一种经过工程改造的支架RNA相互作用，该RNA可募集多个VP64激活结构域（AD）拷贝；相比之下，dCas12a则需在其C末端融合强效的VP64-p65-Rta（VPR）激活结构域。此外，增加细胞内sgRNA/crRNA的量并不能增强这两种Cas蛋白的活性。本文还阐述了如何基于CRISPR-dCas-Acr相互作用构建布尔逻辑门。其中，与人雌激素受体激素结合结构域融合的AcrIIA4是响应β-雌二醇的非门（NOT gate）的核心元件，而由可诱导系统合成的AcrVA蛋白则用于其他逻辑门的设计。 GAL1 启动子能够以半乳糖作为输入，模拟YES和NOT逻辑门。在后一类电路中，AcrVA5与dLbCas12a共同表现出最佳的逻辑行为。

由RNA聚合酶III型启动子驱动的sgRNA/crRNA表达 
首先，本研究针对转录激活回路（回路1）的构建进行了研究，如图所示 图1A包含三个基本组分：1）编码yEGFP（报告基因）的基因，其上游连接一系列不同的合成启动子，这些启动子提供dCas9/dCas12a-AD的靶向位点；2）经酵母密码子优化的dCas9或dCas12a，分别与激活结构域（VP64和VPR）融合，并含有一段或两段核定位序列（NLSs）；两种dCas蛋白均由强组成型启动子pGPD驱动表达；3）引导dCas9/dCas12a-AD靶向至目标位点的sgRNA/crRNA序列。基于dCas9/dCas12a的激活系统的激活效率通过报告基因的荧光强度（测定）进行可视化和反映 通过 FACS 实验。
测试了一种dCas9蛋白（dSpCas9）和两种dCas12a蛋白（denAsCas12a和dLbCas12a）。当dSpCas9在其C末端延伸并融合VP64激活结构域（AD），且结合于合成启动子上游时，...

在Saccharomyces cerevisiae中，CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白被整合到布尔逻辑门的体系中。这些新型的小型逻辑电路表现出良好的性能，加深了对基于dCas9/dCas12a的转录因子以及抗CRISPR蛋白特性的理解。

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

合成基因布尔门与数字电路在医学诊断到环境护理等多个领域具有广泛应用。……的发现

本实验方案详细说明了如何设计、构建和分析利用II型和V型CRISPR dCas系统及其相应抗CRISPR蛋白的酵母基因数字电路。该方案具有可组装性，因为它整合了一套标准化流程，用于在酵母中组装和测试合成转录网络。首先，配制反应体系：加入20至40纳克DNA模板、1微升正向引物、1微升反向引物、5微升dNTP混合物、0.5微升DNA聚合酶、10微升5× DNA聚合酶反应缓冲液，并用双蒸水补足至总体积50微升。使用手稿中所述的降落PCR程序，在热循环仪中扩增DNA序列。通过凝胶电泳分离PCR产物，并使用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收并稀释DNA片段。采用Gibson组装法，将纯化的PCR产物插入线性化的穿梭载体中：将等摩尔的DNA混合物在50摄氏度下孵育1小时，完成连接反应。通过降落PCR和Gibson组装方法构建dCas12a受体载体，具体操作如前所述。使用BamH1和Xhol1进行酶切，并利用T4 DNA连接酶连接，将酵母密码子优化的dCas12a蛋白插入两个新构建的受体载体中。类似地，基于pRS2403穿梭载体，通过降落PCR和Gibson组装方法构建表达抗CRISPR蛋白的质粒。进行显微镜细胞检测时，取两微升细胞溶液置于载玻片上，并盖上盖玻片。打开荧光光源、显微镜和计算机，通过荧光显微镜观察细胞。记录荧光光源编号后，在计算机上打开显微镜软件。将玻片置于显微镜载物台上，在绿光下观察细胞，并选择40倍物镜。调节粗调焦旋钮，直至酵母细胞轮廓出现，再使用细调焦旋钮使细胞清晰对焦。检测细胞时，先关闭显微镜视野，切换至计算机屏幕，然后点击“live”按钮。等待三到五秒。点击“捕获”以拍照并保存图像。接下来，关闭计算机、显微镜和荧光光源。在测量前20分钟打开流式细胞仪，以预热激光器，并将20微升细胞培养物与300微升双蒸水混合。在连接流式细胞仪的计算机上运行FACS软件，创建新实验，然后设置测量参数。接下来，根据样本的激发和发射波长选择相应的滤光片，并将采集细胞数设置为 10,000。通过测量荧光微球的强度来调整 FITC 滤光片电压，确保连续两次实验中微球强度的相对差异不超过 5%。用双蒸水冲洗仪器数秒，以去除可能残留的过量微球。测量样本荧光强度，并在等待样本注入稳定 3 至 5 秒后点击预览。最后点击“acquire”。在实验结束时再次测量微珠。检查两次微珠测量值之间的相对差异是否超过5%后，将FACS数据导出为FCS文件。打开 R Studio 并加载脚本 BDverse_analysis.R 以分析 FCS 文件。将实验名称设置为 ename，将存储 FCS 文件的目录路径设置为 dir_d，结果文件将生成在 dir_r 目录中。接下来，设置荧光通道。设定已测量的样本数量。设定散点图的尺寸，以及柱状图和箱线图的 x 轴与 y 轴的最大长度。通过删除相应行前的井号来选择评分方法。选择与所选设门方法相对应的已设门的flowSet对象以及点图分辨率，分辨率应至少为256。取消注释两条过滤指令，以去除荧光信号为负的测量值，并去除由于其他实验引起的异常值，具体方法详见论文描述。按下源按钮并运行脚本。分析结果的所有文件均生成在 dir_r 目录中。当合成启动子上含有六个 lexOp 靶位点时，dSpCas9-VP64 达到了最佳的激活效率。对于dCas12a-VPR，当在合成启动子中插入三个lexOp拷贝时，激活效率最高。当CRISPR RNA和单链向导RNA位于整合型质粒上时，其激活效果分别比位于附加体型质粒上时高出1.4至2.4倍和1.1至1.5倍。RT-qPCR结果显示，无论表达系统如何，附加体型载体产生的单链向导RNA和CRISPR RNA水平均显著高于整合型载体。测试了dSpCas9复合物与招募MCP-VP64的支架RNA的激活效率。含有单个野生型和F6MS2发夹结构的支架RNA分别实现了5.27倍和4.3倍的激活。然而，两种发夹结构的组合使用则达到了7.54倍的激活，具有最高的激活效率。使用了四种不同的启动子来驱动三种II型抗CRISPR蛋白的表达，结果表明它们的作用具有剂量依赖性。强启动子分别将荧光水平降低至其原始值的0.21、0.11和0.13。滴定曲线显示，该电路表现出类似结型门控的特性，其开启与关闭状态的比值接近2.3。五型抗CRISPR蛋白AcrVA1可使作为激活子的denAS-Cas12a和dLB-Cas12a的荧光表达降低19%至71%。研究了激活子与阻遏子之间的关系，其中AcrVA1在由pGAL1启动子驱动、pTEF1和遗传型CYC1t-pCYC1noTata调控时，其抑制效果表现出较大波动；五型抗CRISPR-A1仅对裸露的dLB-Cas12a表现出一定程度的抑制作用。FACS仪器较为精密，因此须小心操作。细胞溶液浓度切勿过高，且仪器应保持清洁。

gene-digital-circuits-based-on-crispr-cas-systems-anti-crispr

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基于CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白的基因数字电路

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。...

利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

本文介绍了一种基于小分子 Shield-1...

一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包

本文报道了利用CRISPR/Cas9系统构建着丝粒相关蛋白E（CENP-E）基因敲除细胞及三种基于表型的筛选策略。我们已利用CENP-E 基因敲除细胞系建立了一种新方法，用于验证CENP-E抑制剂的特异性和毒性，该方法对药物开发和生物学研究具有重要意义。...

使用 CRISPR/Cas9 系统构建着丝粒相关蛋白-E CENP-E-/- 敲除细胞系

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

实体瘤中的间质液流动增强，可调节肿瘤细胞的侵袭。本文介绍一种将间质液流动施加于嵌入基质中的细胞，进而测量其对细胞侵袭影响的技术。该技术可轻松适用于其他系统的相关研究。...

用于测量间质流体流动对肿瘤细胞侵袭影响的三维细胞培养模型

纤维素体是用于降解纤维素的多酶复合物。本研究采用基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based...

利用基于原子力显微镜的单分子力谱研究纤维素体的受体-配体系统

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

学习利用CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白在酿酒酵母中构建基因数字电路的方法。本方案通过Gibson组装和PCR技术建立合成转录网络，为合成生物学研究提供新框架。

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

探索更多视频