Name: Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer immunomagnetische isolatie van CD34+ vaatwand-stamcellen uit muizen met magnetische sortering en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar cardiovasculaire ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82070502, 31972909, 32171099), het Sichuan Science and Technology Program van de provincie Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). De auteurs willen Qingbo Xu van de Universiteit van Zhejiang bedanken voor zijn hulp bij de celkweek, en de auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische hulp van het flowcytometrieplatform in de Southwest Medical University.

Deze studie werd goedgekeurd en de dieren werden behandeld in overeenstemming met de richtlijnen voor het beheer en gebruik van proefdieren in China. Het onderzoek hield zich strikt aan de ethische eisen van dierproeven, met goedkeuring van de Ethische Commissie voor Dieren (Goedkeuringsnummer: SWMU2020664). Acht weken oude gezonde C57BL/6-muizen van beide geslachten, met een gewicht tussen 18-20 g, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden gehuisvest in het Laboratory Animal Center van de Southwest Medical University (SWMU).
1. Weefselblokcultuur van adventitie uit de aorta en mesenteriale slagaders
<ol><li>Isolatie van CD34+ VW-SC's voor bewoners<ol><li>Verdoof twee muizen met 3% isofluraan inhalatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig adequate anesthesie door in de tenen te knijpen. Plaats de muis op zijn rug met medische tape en spray 70% ethanol ontsmettingsmiddel om de vacht van de muis te desinfecteren. Open de borst- en buikholte met behulp van een steriele oogheelkundige schaar en tang om het hart en de darmen bloot te leggen. Na het ontleden van de geïsoleerde aorta en mesenteriale slagaders, speldt u de aorta en het mesenteriale bed in een petrischaal met siliciumelastomeer en gevuld met een fysiologische zoutoplossing. Ontleed met een andere set gesteriliseerde scharen en tangen snel het vet rond de aorta en mesenteriale slagaders.</li>
		<li>Breng de ontlede weefsels over in een petrischaal van 6 cm met 1% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing (zie materiaaltabel). Breng na twee keer spoelen de slagaders over naar een weefselkweekkap onder een stereomicroscoop.</li>
		<li>Snijd de slagaders in de lengterichting door en gebruik een fijne pincet om de buitenste laag van de aorta en de eerste tak van de mesenteriale slagaders af te pellen. Breng de buitenste lagen over in een petrischaal van 3,5 cm met 0,1-0,2 ml kweekmedium (zie Materiaaltabel). Snijd de buitenste lagen in kleine stukjes (ongeveer 1 mm3).</li>
		<li>Breng de weefselstukjes over in een met gelatine beklede T25-kolf en zorg voor een gelijkmatige verdeling over de bodem van de kolf. Houd een matige afstand tussen de weefselstukken om het kruipen en de groei van cellen te vergemakkelijken. Plaats de kolf gedurende 3 uur verticaal in een broedstoven (37 °C, 5% CO2) zodat de weefselblokjes aan de bodem van de kolf kunnen hechten.</li>
		<li>Voeg na 3 uur 5 ml DMEM hoog glucosegroeimedium toe om de weefselblokken onder te dompelen. Oriënteer de T25-kolf horizontaal. Bewaak de celmigratie rond weefselblokkades door een microscoop met tussenpozen van 3 dagen. OPMERKING: Het medium moet 20% foetaal runderserum, 0,2% leukemieremmende factor (LIF), 0,2 mM β-Mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine bevatten (zie materiaaltabel). Foetaal runderserum ondersteunt de celproliferatie, terwijl LIF en β-Mercaptoethanol de celdifferentiatie belemmeren 7,8.</li>
		<li>Wanneer cellen in de T25-kolf ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, passeer en kweek ze dan in een of twee T75-kolven. Subcultuur van de cellen over vijf passages om een goede groei en gezondheid te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Magnetische scheiding van residente CD34+ stamcellen<ol><li>Wanneer de cellen in een of twee T75-kolven 80% samenvloeiing bereiken, dissocieert u de cellen met trypsine en resuspendeert u ze in 1 ml sorteerbuffer (2 mM EDTA en 0,5% FBS). Bepaal het celnummer (kolf 107/T75) en centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten (bij kamertemperatuur).</li>
		<li>Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de celpellet in 98 μl sorteerbuffer per 107 totale cellen. Voeg 2 μL CD34-antilichaam toe (zie materiaaltabel). Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij 4°C in het donker met af en toe schudden.</li>
		<li>Was de cellen door 2 ml sorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatans voorzichtig en volledig en resuspendeer de cellen in 80 μL sorteerbuffer.</li>
		<li>Voeg 20 μL Anti-FITC MicroBeads (per 107 cellen in totaal, zie Materiaaltabel) toe aan de buffer. Meng goed door herhaaldelijk pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker met intermitterend schudden.</li>
		<li>Was de cellen twee keer door 2 ml buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g om de cellen opnieuw te pelleteren. Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de cellen in 1 ml buffer.</li>
		<li>Plaats een MS-kolom binnen het magnetische veld van een geschikte scheider en zorg ervoor dat er een verzamelbuis (bijv. een centrifugebuis van 15 ml) onder de MS-kolom wordt geplaatst om de gescheiden componenten op te vangen. (zie Tabel met materialen). Spoel de kolom af met een buffer van 500 μL en wacht tot deze volledig is doorgelopen.</li>
		<li>Laad de celsuspensie in de kolom en verzamel de doorstroom met niet-gelabelde cellen in de buis van 15 ml.</li>
		<li>Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze op een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Breng 500 μL buffer in de kolom en spoel vervolgens onmiddellijk de magnetisch gelabelde cellen weg door de zuiger in de kolom te duwen.</li>
		<li>Om de zuiverheid van CD34+- cellen te verbeteren, kan de geëlueerde fractie worden verrijkt met behulp van een tweede MS-kolom. Herhaal het scheidingsproces zoals hierboven vermeld. Beoordeel de zuiverheid van de gesorteerde cellen via flowcytometrie. OPMERKING: Doorgaans worden 10%-20% CD34+ -cellen verkregen, met ongeveer 70%-80% negatieve cellen en ongeveer 10% verlies als gevolg van kleurings- en centrifugeprocedures.</li>
		<li>Om de zuiverheid van vasculaire wand CD34+ stamcellen verder te bevestigen, identificeert u de gesorteerde cellen door middel van flowcytometrie. De huidige studie toonde een zuiverheid van meer dan 90%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Celidentificatie door immunofluorescentie
<ol><li>Zaadcellen op dekglaasjes (diameter 8 mm) voorgecoat met 0,04% gelatine.</li>
	<li>Wanneer de cellen ongeveer 60%-70% samenvloeiing bereiken, spoel dan twee keer met PBS en fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Was de cellen gedurende 3 minuten (3 keer) met PBS en permeabiliseer de cellen met 0,2% Triton X-100 (in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de cellen met PBS gedurende 3 minuten (3 keer) en blokkeer de niet-specifieke binding van de antilichamen met 5% ezelserum (in PBS) gedurende 1 uur.</li>
	<li>Verwijder de blokkeerbuffer door elk dekglaasje met een pincet op de rand te houden en op een vel pluisvrije doekjes te laten lopen.</li>
	<li>Incubeer de cellen in 100 keer verdunde primaire antilichamen (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, zie materiaaltabel) in 1% BSA (in PBS) 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Decanteer de oplossing en was de cellen gedurende 3 minuten (3 keer) met PBS. Incubeer de cellen met Alexa Fluor 488 gelabeld secundair antilichaam (1:200 in 1% BSA) (zie materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Voer DAPI-tegenkleuring uit door DAPI-stockoplossing te verdunnen tot 0,5 μg/ml in PBS en cellen gedurende 5 minuten te incuberen.</li>
	<li>Spoel af met PBS en dicht de dekglaasjes af met antifade-reagens. Leg beelden vast onder de confocale laserscanmicroscoop.</li>
</ol>3. Geïnduceerde differentiatie en karakterisering van CD34+ VW-SC's
<ol><li>Zaad CD34+ stamcellen met een geschikte dichtheid (40%-50% confluentie) op respectievelijk dekglaasjes en 6-putjes platen.</li>
	<li>Induceer endotheelcel-georiënteerde differentiatie van CD34+ -cellen door cellen te kweken in endotheelcelkweekmedium EBM-2 (zie materiaaltabel) gedurende 1 week.</li>
	<li>Induceer fibroblastcel-georiënteerde differentiatie van CD34+ -cellen door cellen te kweken in fibroblastcelkweekmedium FM-2 (zie materiaaltabel) gedurende 3 dagen.</li>
	<li>Onderwerp de ongedifferentieerde en gedifferentieerde cellen aan immunofluorescentiekleuring (zoals vermeld in stap 2) bij laserexcitatie van 488 nm en een 40x objectief. Detecteer de expressie van endotheelcelmarkers (CD31, VWF) en fibroblastcelmarkers (PDGFRα, Vimentin) (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Dissocieer de cellen met trypsine en verkrijg de celkorrel door centrifugeren (300 x g, 5 min, kamertemperatuur). Resuspendeer de cellen met 100 μL sorteerbuffer. Pre-incubeer de celsuspensie met gezuiverd anti-muis CD16/CD32 mAb (1 μg) (zie materiaaltabel) bij 4 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Voeg 2 μL PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Monoklonaal Antilichaam APC (2 μL, 1:50) en CD140a (PDGFRa) Monoklonaal Antilichaam FITC (2 μL, 1:50) rechtstreeks toe aan gepre-geïncubeerde cellen in aanwezigheid van Mouse Fc Block en verder incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Was de cellen twee keer door 2 ml buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten (kamertemperatuur) bij 300 x g om de cellen opnieuw te pelleteren. Gooi het supernatans volledig weg en resuspendeer de cellen in 300 μL buffer. Plaats flowbuizen met gekleurde cellen in een koelbox, klaar voor flowcytometrie.</li>
</ol>4. Detectie van intracellulaire Ca2+ signalering in vasculaire CD34+ stamcellen
<ol><li>Zaadcellen op dekglaasjes 10 uur voor experimenten met een dichtheid tot 70% confluentie.</li>
	<li>Haal de dekglaasjes eruit en bevestig ze op de bodem van een aangepaste kamer met vaseline.</li>
	<li>Was de dekglaasjes eenmaal met PBS, vervang ze door Fura-2/AM (5 μM) in Tyrode-oplossing (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,2 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,4 mM) (zie Materiaaltabel) en incubeer de cellen gedurende 30 minuten in het donker.</li>
	<li>Verwijder de kleurstof door deze gedurende 10 minuten te behandelen met de oplossing van Tyrode om fura-2/AM ontestering mogelijk te maken.</li>
	<li>Monteer de kamer op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een breedveldbeeldvormingssysteem met een monochromator en een CCD-camera (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Open het hoofdvenster, ga naar het dialoogvenster Grab-instellingen en de camerapagina en druk op de live-knop voor livebeeldweergave.</li>
	<li>Kies het fluorescentiebeeldtype, stel de lusherhalingstijden van 340 nm/380 nm, het beeldformaat en de belichtingstijd van de camera in op 380 nm en 340 nm om een optimale beeldhelderheid te bereiken.</li>
	<li>Maak enkele snapshots en teken verschillende lijnen uit de vrije hand om de cellen met verschillende kleuren te omcirkelen en vooraf Region of Interests (ROI's) te definiëren, waarbij de achtergrond wordt aangegeven als ROI 0.</li>
	<li>Bewerk een reeds ingesloten protocol opnieuw in de werkruimteweergave en maak een nieuwe werkruimte.</li>
	<li>Voer het protocol uit en de "Fluorescentie 340 nm div Fluorescentie 380 nm (Live Kinetic)" geeft de online kinetische grafiek weer.</li>
	<li>In de numerieke weergave is een spreadsheet zichtbaar met kolommen met grijswaardenwaarden en bijbehorende tijdinformatie. Exporteer de spreadsheetgegevens met behulp van het klembord.</li>
	<li>Bereken F340 nm/F380 nm met vermelding van intracellulaire Ca2+ veranderingen na aftrek van de achtergrondfluorescentie (ROI 0).</li>
</ol>

Isolatie en magnetische scheiding van muizen CD34+ stamcellen van de vaatwand

<ol><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+progenitor+cells+in+the+adventitia+contribute+to+atherosclerosis+of+vein+grafts+in+ApoE-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice.</a> J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow+CD34%2B+cells+are+crucial+for+endothelial+repair+of+the+injured+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery.</a> Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).</li>
<li>Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+wall+as+a+source+of+stem+cells+able+to+differentiate+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).</li>
<li>Patel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+progenitors+versus+mature+endothelial+cells+reveals+key+soxF-dependent+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process.</a> Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).</li>
<li>Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+stem+cells+in+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles of stem cells in vascular remodeling.</a> Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+resident+stem+cells+in+vessel+formation+and+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis.</a> Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+growth+and+smooth+muscle+differentiation+of+vascular+wall-resident+CD34%2B+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells.</a> Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).</li>
<li>Tang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+vascular+wall-resident+CD34%2B+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Plus%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells.</a> Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).</li>
<li>Sukumaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+regulates+autophagy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis.</a> Cells. 10 (8), 2125(2021).</li>
<li>van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optimizing stem cell culture.</a> J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).</li>
<li>Rotmans, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+cell+seeding+with+anti-CD34+antibodies+successfully+accelerates+endothelialization+but+stimulates+intimal+hyperplasia+in+porcine+arteriovenous+expanded+polytetrafluoroethylene+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts.</a> Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).</li>
<li>Qu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+amyloid+A1+in+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells+basing+on+single-cell+RNA+sequencing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).</li>
<li>Flynn, J., Gorry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Analysis+to+Identify+Human+CD8%2B+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells.</a> Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).</li>
<li>Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present%2C+and+future+of+affinity-based+cell+separation+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies.</a> Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).</li>
<li>Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+identification+of+rat+glomerular+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Sin%22%5BJournal%5D)">Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells.</a> Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).</li>
<li>Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+identification+of+rats+hair+follicle+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells.</a> Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).</li>
<li>Kumar, P., Garg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approaches+to+obtain+medulloblastoma+stem+cells+from+bulk+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures.</a> Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).</li>
<li>Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+planarian+stem+cells+using+DNA+and+mitochondrial+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes.</a> Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).</li>
<li>Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+profile+of+circulating+vascular+progenitor+cells+in+human+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration.</a> PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).</li>
<li>Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+purity+and+vitality+of+natural+killer+cells+with+different+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits.</a> Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consortium+SI.+Isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).</li>
<li>Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-induced+Ca2%2B-signalling+mechanisms+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).</li>
<li>Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+store-operated+calcium+entry+to+modulate+Ca2%2B-dependent+physiological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).</li>
<li>Garcia-Carlos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II%2C+ATP+and+high+extracellular+potassium+induced+intracellular+calcium+responses+in+primary+rat+brain+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Funct%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures.</a> Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).</li>
<li>Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+as+a+tool+to+investigate+sarcoplasmic+reticulum+and+intracellular+calcium+dynamics+in+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles.</a> J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Deze studie biedt een snelle en handige methode voor het verkrijgen van functionele CD34+ VW-SC's uit de aorta en mesenteriale slagaders van muizen. CD34+ VW-SC's die met deze methode worden verkregen, hebben proliferatieve activiteit en multidirectionele differentiatie-eigenschappen. Trifosfaatinositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R's), ryanodinereceptoren (RyR's) en in de winkel bediende calciumkanalen mediëren de afgifte en binnenkomst van Ca2+ in CD34+ VW-SC's...

De vaatwand speelt een cruciale rol bij de vasculaire ontwikkeling, homeostatische regulatie en de progressie van vaatziekten. In de afgelopen jaren hebben talrijke onderzoeken de aanwezigheid van verschillende stamcellijnen in slagaders aan het licht gebracht. In 2004 rapporteerde de groep van professor Qingbo Xu voor het eerst het bestaan van vasculaire stam-/voorlopercellen in de periferie van de volwassen vaatwand, die CD34, Sca-1, c-kit en Flk-11 tot expressie brengen. Deze vasculaire stamcellen vertonen multidirectionele differentiatie en proliferatiepotentieel. Onder normale omstandigheden blijven ze relatief rustig; Wanneer ze echter door specifieke factoren worden geactiveerd, kunnen ze differentiëren in gladde spiercellen, endotheelcellen en fibroblasten. Als alternatief kunnen ze de perivasculaire matrix en de vorming van microvaten reguleren door middel van paracriene effecten om het herstel of de hermodellering van gewonde bloedvaten te bevorderen 2,3,4,5,6. Onlangs werd vastgesteld dat residente CD34+-stamcellen in de vaatwand een rol spelen bij de regeneratie van endotheelcellen na letsel aan de voerdraad van de dijbeenslagader2. Bijgevolg zijn de isolatie en kwantificering van CD34+ VW-SC's en het onderzoek van de biologische basiskenmerken van CD34+ stamcellen cruciaal voor het verder bestuderen van de signaalroutes die betrokken zijn bij de regulatie van CD34+ VW-SC's.
Er zijn momenteel verschillende methoden voor celscheiding beschikbaar, waaronder technieken die zijn gebaseerd op celcultuurkenmerken of fysische eigenschappen van cellen, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie, wat resulteert in gesorteerde cellen met veel niet-doelcellen en een relatief lage zuiverheid 7,8,9,10,11,12 . Een andere veelgebruikte techniek is fluorescentie/magnetisch geassisteerde celsortering. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een complex systeem met hoge technische eisen, en het is relatief duur, tijdrovend en beïnvloedt mogelijk de activiteit van gesorteerde cellen 13,14. Magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) is echter efficiënter en handiger, met een hoog herstelpercentage en celactiviteit en minder impact op downstream-toepassingen8. Daarom hebben we in dit protocol MACS toegepast om CD34+ VW-SC's te zuiveren en de cellen verder te identificeren door middel van flowcytometrie. Het opzetten van op MACS gebaseerde isolatiemethoden voor het bestuderen van vaatwandstamcellen zou van onschatbare waarde zijn. Ten eerste maakt het experimenteel genetisch en celbiologisch onderzoek mogelijk. Ten tweede maakt efficiënte isolatie en kweek van stamcellen in de vaatwand systematische beoordeling en screening van signaalfactoren die stamcelfuncties reguleren mogelijk. Ten derde zorgt de identificatie van cruciale fenotypes in stamcellen voor een belangrijke 'kwaliteitscontrole' bij het beoordelen van de celstatus. Het identificeren van zuiveringsmethoden zou dus nuttig kunnen zijn voor vergelijkbare toepassingen als analoge stamcellen die zijn afgeleid van vaten.
Dit rapport biedt een gedetailleerde demonstratie van een stabiele en betrouwbare methode voor de kweek van CD34+ VW-SC's, inclusief celidentificatie en functionele beoordeling uitgevoerd door flowcytometrie, immunofluorescentiekleuring en Ca2+ -signaleringsmeting. Deze studie biedt een basis voor verder diepgaand onderzoek naar de functie van CD34+ VW-SC's en hun regulerende mechanismen bij fysiologische en pathologische aandoeningen.

<table><tbody><tr><td>2% gelatine-oplossing</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 antilichaam</td><td>R&amp;D</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab81289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-kit antilichaam</td><td>CST</td><td>77522</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FITC MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FITC MicroBeads MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flk- 1 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab24313</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antilichaam</td><td>CST</td><td>34330</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDGFR&alpha; antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab131591</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca- 1 antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>710952</td><td></td></tr><tr><td>CD140a (PDGFRA) Monoklonaal Antilichaam (APA5), FITC</td><td>eBioscience &nbsp;Invitrogen</td><td>11-1401-82</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) Monoklonaal Antilichaam (390), APC</td><td>eBioscience&nbsp; Invitrogen</td><td>17-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Antilichaam, anti-muis, FITC, REAfinity Clone REA383</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-775</td><td></td></tr><tr><td>celkweekkap</td><td>JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD&nbsp;</td><td>SW-CJ-2FD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>&nbsp; CENCE&nbsp;&nbsp;</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp;incubators&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laserscanningmicroscoop&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>zeiss 980&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Hoge Glucose Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 kweekmedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&nbsp;&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&trade; Systeem</td><td>&nbsp;BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Millipore</td><td>ES-009-C</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 kweekmedium</td><td>ScienCell</td><td>2331</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>M1292</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor Plus 488</td><td>&nbsp;Thermofisher Scientific&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Leukemie remmend factor</td><td>Millipore</td><td>LIF2010</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS&nbsp;&nbsp; Startkit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-312</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-Amfotericine B Oplossing</td><td>Beyotime</td><td>C0224</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd Rat Anti-Muis CD16/CD32 (Muis BD Fc Blok)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscoop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TILLvisION 4.0 programma&nbsp;</td><td>&nbsp;T.I.L.L.Photonics GmbH</td><td>polychrome V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWF Monoklonaal Antilichaam (F8/86)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp;MA5-14029</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner cd34+ stamcellen van muizen

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Residente CD34+ vasculaire wand-residente stam- en voorlopercellen (VW-SC's) worden steeds meer erkend voor hun cruciale rol bij het reguleren van vasculair letsel en herstel. Het opzetten van een stabiele en efficiënte methode om functionele muizen CD34+ VW-SC's te kweken is essentieel voor verder onderzoek naar de mechanismen die betrokken zijn bij de proliferatie, migratie en differentiatie van deze cellen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. De beschreven methode combineert magnetische parelscreening en flowcytometrie om primair gekweekte CD34+ VW-SC's te zuiveren. De gezuiverde cellen worden vervolgens functioneel geïdentificeerd door middel van immunofluorescentiekleuring en Ca2+- beeldvorming. In het kort worden vasculaire cellen uit de adventitia van de aorta van de muizen en de mesenteriale slagader verkregen door aanhechting van weefselblokkades, gevolgd door subculturatie tot het bereiken van een celgetal van ten minste 1 ×10 7. Vervolgens worden CD34+ VW-SC's gezuiverd met behulp van magnetische parelsortering en flowcytometrie. Identificatie van CD34+ VW-SC's omvat cellulaire immunofluorescentiekleuring, terwijl functionele multipotentie wordt bepaald door cellen bloot te stellen aan een specifiek kweekmedium voor gerichte differentiatie. Bovendien wordt de functionele interne Ca2+- afgifte en externe Ca2+ -invoer beoordeeld met behulp van een in de handel verkrijgbaar beeldvormingswerkstation in Fura-2/AM-geladen cellen die zijn blootgesteld aan ATP, cafeïne of thapsigargin (TG). Deze methode biedt een stabiele en efficiënte techniek voor het isoleren, kweken en identificeren van CD34+ -stamcellen die in de vaatwand wonen, en biedt de mogelijkheid voor in-vitrostudies naar de regulerende mechanismen van VW-SC's en de screening van gerichte geneesmiddelen.

Isolatie en zuivering van CD34+ VW-SC's Hoge zuiverheid van CD34+ VW-SC's wordt verkregen uit de adventitie van de aorta en mesenteriale slagader van de muis door weefselaanhechting en magnetische microbead-sortering. Het percentage CD34+- cellen in de vaatwand is over het algemeen 10%-30%. Flowcytometrie bevestigt dat de zuiverheid van CD34+- cellen verkregen door magnetische parelsortering meer dan 90% is (Figuur 1A). Cellulai...

Deze studie heeft een stabiele en efficiënte methode vastgesteld voor de isolatie, kweek en functionele bepaling van CD34+ stamcellen in de vaatwand (CD34+ VW-SC's). Deze gemakkelijk te volgen en tijdbesparende isolatiemethode kan door andere onderzoekers worden gebruikt om de mogelijke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij hart- en vaatziekten.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34+ stamcellen van muizen

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

Bewoner vaatwand CD34+ stamcellen worden steeds meer erkend voor hun cruciale rol bij het reguleren van vasculaire remodellering na letsel. Het opzetten van een stabiele en efficiënte methode om functionele CD34+-cellen te kweken is essentieel voor verder onderzoek naar de deelnemende mechanismen onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Deze techniek combineert magnetische parelscreening en flowcytometrie om de primaire gekweekte residente CD34+-stamcellen te zuiveren.Vervolgens kunnen de gezuiverde cellen functioneel worden geïdentificeerd door middel van immunofluorescerende kleuring en calciumbeeldvorming. Vanwege de fenotypische en functionele heterogeniteit van residente CD34+-stamcellen in de vasculaire zenuwwand, zal het nodig zijn om het specifieke subcellulaire type residente vasculaire CD34+-cellen te identificeren. We presenteren een verfijnde methodologie voor de kweek, identificatie en functionele beoordeling van CD34+-stamcellen in de vaatwand.Deze nieuwe benadering omvat magnetische sortering, flowcytometrie, immunofluorescentiekleuring en calciumsignaleringsmeting. Door gebruik te maken van deze technieken legt onze studie een solide basis voor toekomstig uitgebreid onderzoek naar de functie onder regulatie van ontvangende CD34+-stamcellen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.

immunomagnetic-isolation-vascular-wall-resident-cd34-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video demonstrates a technique for generating human immune system (HIS) mice. CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs) are isolated from human cord blood buffy coat cells using antibody-coated magnetic beads. The CD34+ HSCs are expanded in a growth medium enriched with cytokines and cryopreserved. Finally, the thawed HSCs are injected into an immunodeficient mouse pup to establish the HIS mouse model.

Isolating Cord Blood Hematopoietic Stem Cells to Generate Human Immune System Mice

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

We hebben een protocol geoptimaliseerd voor het isoleren en zuiveren van Murine cardiale pericytes voor fundamenteel onderzoek en onderzoek naar hun biologie en therapeutisch potentieel.

Isolatie en zuivering van Murine cardiale Pericytes

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Leer immunomagnetische isolatie van CD34+ vaatwand-stamcellen uit muizen met magnetische sortering en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar cardiovasculaire ziekteprocessen.

Immunomagnetische isolatie van de vaatwand-bewoner CD34⁺ stamcellen van muizen

Meer video's verkennen