Name: 从MEFs基质胶我的MEFs传代的胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-04T23:27:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习利用小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和基质胶无饲养层条件培养人胚胎干细胞的方法。本视频详细演示了如何维持干细胞的多能性状态，为再生医学研究提供实用操作指南。

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Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究得到了加州再生医学研究所（CIRM）种子基金 RS1-00313 的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）再生医学与干细胞研究 Broad 中心的成员，特别是 Amander Clark 博士、Jerome Zack 博士，以及 UCLA Broad 研究所干细胞核心设施的工作人员对本研究工作的支持。

在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上培养的人胚胎干细胞（hESCs）的传代
通常，根据特定的hESC细胞系，一个汇合的hESC培养板可以按1:6至1:10的比例进行传代。传代后的培养板将在传代后5至7天再次达到汇合状态。
<ol>
<li>分传前两天，使用0.1%明胶溶液对培养板进行明胶化处理。对于6孔板，每孔加入2 ml溶液，并将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育。2 组织培养箱中孵育过夜。</li>
<li>前一天将MEFs接种于明胶包被的6孔板中，以便计划传代hESCs时使用。（注意：如有需要，MEFs可提前最多3天接种。大约3天后，MEFs会变得更为扁平且铺展，维持hESCs的能力不如新鲜MEFs。）取一管经γ射线照射或丝裂霉素C处理的CF1 MEFs，细胞数量为5-6 × 10⁶。6 细胞从液氮中取出，在37°C水浴中解冻2分钟。用预热的MEF培养基在50 ml离心管中洗涤细胞一次，并将细胞重悬于最终体积的预热MEF培养基中。当细胞密度为5-6 x 106 细胞，足以接种两到三个6孔板。</li>
<li>在洗涤 MEFs 的同时，取出已明胶包被的培养板，吸净各孔中的溶液，每孔加入 2.5 ml MEF 培养基。 </li>
<li>每孔加入 0.5 ml MEF 悬液，使每孔终体积为 3 ml。确保 MEF 均匀分散，将培养板放回培养箱中过夜，使细胞沉降。</li>
<li>在hESC传代当天，准备新鲜的或使用 &lt; 2 周龄的无菌 IV 型胶原酶溶液，浓度为 1 mg/ml。吸除拟传代 hESC 孔中的全部培养基，每孔用 2 ml 温热的 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次，然后每孔加入 1 ml IV 型胶原酶溶液。于 37°C 培养箱中孵育 5–10 分钟。将 6 孔板从培养箱中取出，每孔加入 1 ml 不含 bFGF 的 ES 培养基。用 1 ml 移液器吸取各孔中的液体，反复吹打，使干细胞从培养板上脱落。每孔约需吹打 5 至 10 次。随后，将悬浮的 hESC 转移至 50 ml Falcon 管中。对所有拟传代的孔重复上述操作，并将细胞悬液合并至同一个 50 ml Falcon 管中。于室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集 hESC 细胞沉淀，并用不含 bFGF 的 ES 培养基洗涤一次。</li>
<li>在洗涤 hESCs 的同时，取出 MEF 培养板，移除各孔中的全部培养基，并用无菌、预热的 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次，然后每孔加入 2.5 ml ES 培养基（现添加 10 ng/ml bFGF）。</li>
<li>将沉淀的hESCs重悬于适量添加了10 ng/ml bFGF的ES培养基中。（注意：重悬后的hESCs应大致具有均匀的集落大小和形态。重悬体积取决于传代比例。）用移液器轻柔吹打hESC悬液数次，使集落变小且更加均一，但避免过度吹打导致产生单细胞或过小的集落。每孔加入0.5 ml hESC悬液至MEF培养板中，使每孔终体积为3 ml。加样后目视检查，确保hESCs分布均匀，然后将培养板放回培养箱中过夜沉降。接种后，集落通常需要数天时间才能呈现出其典型的形态和边缘特征。</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science . 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology+%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。在接种前的最后一步，当重悬hESCs时，细胞集落应大致具有均匀的大小和形态。轻轻吹打hESC悬液数次，以使集落变小且更加均一，但避免过度吹打导致产生单细胞或过小的集落。需要通过免疫荧光染色结合显微镜观察或流式细胞术检测hESC多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认hESC在培养过程中维持未分化状态。

<table><tbody><tr><td>Knockout血清替代物（KSR）</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> 非必需氨基酸</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>试剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>试剂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>生物医学工程</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>试剂</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>试剂</td><td>干细胞技术</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 </td><td>试剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>试剂</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>试剂</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 抗体</td><td>试剂</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>抗人/鼠SSEA-4 藻红蛋白&amp;#8211;rythrin 偶联小鼠 IgG3</td><td>试剂</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗兔IgG</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

从mefs到matrigel i：在mefs存在条件下传代hescs

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。

本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）。共3部分，第1部分。

从MEFs到Matrigel I：在MEFs存在条件下传代hESCs

由于人类胚胎干细胞在再生医学中具有重要潜力，人们正日益关注其生物学特性及操控方法。在本视频中，我们将向您展示如何利用小鼠胚胎成纤维细胞饲养层以及无饲养层的Matrigel条件，培养并维持人类胚胎干细胞的多能状态。大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校病理学与实验室医学系一个实验室微视频项目的Jinjiang。今天我们将向您展示一种在小鼠胚胎成纤维细胞、饲养层细胞以及在基质胶上无饲养层条件下培养人类胚胎干细胞的方法。该方法包括制备小鼠胚胎成纤维细胞、制备适用于基质胶培养的甲基纤维素条件培养基、基质胶包被培养皿的准备，以及随时间进行的人类胚胎干细胞的传代与培养。现在让我们开始吧。开始培养操作时，将人胚胎样干细胞接种在小鼠胚胎成纤维细胞上，或在基质上进行人胚胎干细胞的传代。我们从融合生长的人胚胎干细胞开始，按照1:6至1:10的比例进行接种，具体比例取决于所使用的特定胚胎干细胞系。传代后，细胞将在5至7天内再次达到融合状态。在实验前两天，使用checon提供的0.1%明胶溶液制备明胶包被的培养板。如果使用六孔板，每孔加入2 mL，然后在37°C、5% CO₂的组织培养箱中过夜孵育。次日将细胞接种到已明胶包被的六孔板中。若需要，最迟可提前三天将细胞接种至六孔板。然而，不建议使用超过三天的细胞。从液氮中取出一支含有 5×10⁶ 至 6×10⁶ 个经辐照或丝裂霉素 C 处理的 CF OneFS 细胞的冻存管，在 37°C 水浴中解冻两分钟。细胞解冻后，在 15 毫升 Falcon 管中用预热的 meth 培养基洗涤一次，细胞总数为 5×10⁶ 至 6×10⁶ 个。可以观察到两到三个六孔板，每个孔中加入三毫升培养基。确保细胞均匀分散。可将培养板放回培养箱中过夜。在准备传代人胚胎干细胞的当天，配制新鲜的无菌胶原酶IV溶液，浓度为每毫升1 mg。注意，胶原酶溶液可在4°C保存，但使用时间不得超过两周。移除人胚胎干细胞孔中的所有培养基。用2毫升预热至37°C、pH为7.4的1×PDS溶液轻柔洗涤每个孔一次。随后，向每个孔中加入1毫升胶原酶IV溶液，并在37°C孵育5至10分钟。孵育后，向每个孔中加入1毫升不含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的干细胞培养基，然后仅需使用1毫升移液器将孔中已有的培养基反复吹打5至10次，即可使干细胞从孔底脱落。随后，将悬浮的人胚胎干细胞转移至15毫升离心管中。收集细胞后，在室温下以200 × g离心5分钟，使干细胞形成沉淀。随后，在人胚胎干细胞洗涤过程中，依次用不含BFGF的干细胞培养基洗涤。取出甲醇处理的培养板。吸去孔板中的全部培养基，用无菌温热的1×PBS（pH 7.4）洗涤一次。然后每孔加入2.5毫升胚胎干细胞培养基，其中添加10纳克/毫升bFGF。接下来，将沉淀的人胚胎干细胞重悬于适量的干细胞培养基中，培养基中需添加10纳克/毫升的bFGF。

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从MEFs基质胶我的MEFs传代的胚胎干细胞

在本视频中，我们展示了实验室如何常规使用胰蛋白酶对HuES人类胚胎干细胞系进行传代。由JoVE为您提供。...

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从 MEF 到 Matrigel 2：将 hESC 从 MEF 分离并接种到 Matrigel 上

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适用于培养人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的小鼠胚胎成纤维细胞的制备

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高密度人胚胎干细胞培养中快速去除成纤维细胞

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通过表观遗传重编程由人胚胎干细胞生成肌球体

本文介绍了基于解离的单细胞非克隆型单层（NCM）生长的人多能干细胞（hPSC）培养方案。这一新方法利用Rho相关激酶抑制剂或层粘连蛋白异构体521（LN-521），适用于大量生产均一的hPSCs，以及进行基因操作和药物筛选。...

人类多能干细胞培养、维持与遗传分析的替代培养体系

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。...

锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

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