Name: 小学游离中脑多巴胺鼠类新生儿的细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: 学习从啮齿动物新生幼崽制备原代中脑多巴胺神经元细胞培养的方法，用于研究多巴胺释放动力学和突触前特性。该技术为神经科学和药理学研究提供了重要的体外实验模型。

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本工作由 DK065872（ENP）、Smith Family Foundation 生物医学研究卓越奖（ENP）、F31 DA023760（BMG, ENP）和 P30 NS047243（塔夫茨神经科学研究中心）资助。

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

本文所述方法能够精细解析中枢多巴胺神经元的形态学和神经化学特征，而这些特征在系统性或体内研究方法中通常无法获得。

<table><tbody><tr><td colspan="4">材料已包含在实验方案正文中。</td></tr></tbody></table>

新生鼠中脑多巴胺能细胞原代分离培养

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

建立多巴胺能神经元的原代细胞培养体系，可使研究者在排除脑内其他系统性输入干扰的情况下，独立研究多巴胺能神经元的突触前特性。在本实验室中，我们利用这些神经元通过碳纤维安培法评估多巴胺释放动力学，并通过定量PCR和免疫细胞化学方法检测与多巴胺相关的基因和蛋白质表达水平。在本视频中，我们将向您展示如何从啮齿类动物新生个体中建立此类细胞培养体系。
该过程包括多个步骤，如皮层胶质星形细胞的铺板、胶质基质对神经元细胞培养基的条件化处理、新生幼鼠中脑的解剖、多巴胺能神经元的消化、提取与铺板，以及添加神经营养因子以确保细胞存活。
适用于此类制备的应用包括电生理学、免疫细胞化学、定量PCR、视频显微镜（例如，囊泡与质膜实时融合的观察）、细胞活力检测以及其他毒理学筛选。

原代分离的中脑多巴胺细胞培养可用于研究多巴胺神经元的突触前特性。这些培养细胞可用于实时监测多巴胺释放动力学，以及多巴胺胞吐作用调控因子的蛋白质/mRNA水平。本文中，我们将展示如何从啮齿类动物新生个体中建立此类细胞培养。

建立多巴胺能神经元的原代细胞培养，可使其突触前特性在分离条件下得到研究……

大家好，我是来自塔夫茨大学医学院药理学与实验治疗学系Emmanuel Pothos实验室的Lauren Frank。这位是Emmanuel Pothos。今天我们将向您展示一种从小鼠新生鼠中建立原代中脑多巴胺神经元细胞培养的实验方法。该操作步骤包括以下流程：准备工具与试剂，解剖出生零至两天的啮齿类动物脑组织的中脑，分离脑组织段，并接种离散的神经元。现在让我们开始。该实验步骤中，有多项准备工作需提前两到三周进行，以便在制备多巴胺能神经元培养物之前完成。必须提前接种胶质细胞，使其有足够时间增殖并覆盖培养皿底部。原代多巴胺能神经元将在原代神经元细胞培养前一至七天，接种于一层胶质细胞形成的单层上。在原代神经元培养前一天，移除胶质细胞的培养基，并更换为两毫升新鲜的神经元培养基。除解剖器械外，所有物品均需使用紫外光灭菌，包括12个解剖培养皿。两个含有微型磁力搅拌子的解离管。两个瓶盖，顶部各打有两个小孔。滑动环已展开。取出滑动环盒时，请记住保持其打开状态。所有这些工具在培养当天使用前均需用70%乙醇进行表面处理。首先，从冷冻保存中取出用于解离原代神经元溶液的所有pepane溶液组分，并使其解冻。设置一个加热板，将烧杯中的水加热至 34 摄氏度，用于组织消化，并准备经碳氧混合气饱和的水，以对 pepane 溶液进行氧合。在消化过程中，准备 15 支无菌试管，每管加入 4 至 6 毫升无菌 PBS，用于解剖前清洗脑组织，随后置于冰上。另分装 20 至 30 毫升新鲜神经元培养基，放入培养箱中预温。接下来，使用无菌翻口过滤装置过滤 pepane 溶液，制备解离小瓶，然后将滤液转移至解离小瓶中。使用 25 毫升带螺旋盖的小瓶，插入无菌注射器，在瓶盖上扎一个孔，并连接 0.2 微米滤器。将碳氧混合气体（carbogen）接入滤器，并用封口膜固定。将小瓶置于泡沫塑料圆盘中。将解离管放置到位后，确保磁力搅拌子正在转动。气体已通入管内，温度已稳定在34摄氏度。将解剖显微镜移入生物安全柜中，并将解剖器械摆放在铝箔纸上。然后铺开一张大铝箔和12张小铝箔。留下一把剪刀，用于配合铝箔进行断头操作。在通风橱外放置一个装有冰水的泡沫塑料盒。接下来，准备麻醉剂，该麻醉剂由 0.075 毫升氯胺酮和 0.075 毫升赛拉嗪混合而成。然后获取至少 12 只 P0 至 P2 代幼崽用于 135 毫米培养皿，配备 23 毫米玻璃盖玻片。对于小鼠，需确保整窝幼崽的基因型一致。如果基因型未知，则需要将每只动物的细胞分别接种在不同的培养皿中，并准确记录，以便将细胞与后续的基因分型结果相对应。开始解剖时，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉第一只动物。当动物对尾部弹击测试无反应时，将其放入冰水中30秒，直至出现低温状态。然后用70%乙醇冲洗一小片铝箔、断头剪刀和动物头部，以避免在解剖过程中污染脑组织。用剪刀断头，使头部掉落至铝箔片上，并将其移至超净台内。先用小剪刀剪开皮肤暴露颅骨，轻轻取出脑组织。沿颅骨周围360度环形剪开。然后用镊子剥离颅骨盖。使用小刮勺将脑组织从颅腔中取出，并放入盛有冰块的15毫升离心管中。加入冷的PBS缓冲液，然后将离心管放回冰上，再取出下一个脑组织。重复解剖操作，直至有三个大脑分别置于冰上的不同离心管中。将一个大脑连同PBS倒入第一个解剖皿中。在显微镜下，将大脑放置在硅胶密封胶制成的平台垫上作为缓冲，以保持刀片锋利。使用移液管将脑组织片段转移至含有新鲜 PBS 的离心管中，以洗涤片段，随后再转移至 pepane 溶液中。当第一个片段加入时即启动计时器，并持续进行解剖操作，直至所有脑组织均开始消化。在 pap pain 中。首批脑组织片段已消化约一小时。当最后一批组织片段加入后，继续消化一小时。确保 pepane 浴的温度稳定在 34 摄氏度。开始切片步骤时，使用移液管将脑组织片段放入无菌的15毫升离心管中。尽量避免带入过多的戊烷溶液。如果发生此情况，则需去除多余的戊烷。接着，从培养箱中加入两毫升预热的神经元培养基，洗涤组织片段。待组织片段沉降后，小心弃去尽可能多的溶液，注意不要扰动组织片段。共进行三次洗涤。每次换液时务必更换移液器，以避免交叉污染，并使用新的移液器进行转移。在2 mL神经元培养基中开始操作。吹打25次，注意避免引入气泡。然后让未结合的组织段静置三分钟。使用移液管尽可能收集上清液，避免扰动底部的组织段。将上清液保存在新的无菌15毫升离心管中。使用1000微升移液器吸头重复上一步操作，然后使用200微升吸头重复操作，此时组织片段应完全解离，肉眼可见。所有步骤产生的上清液均收集至同一个15毫升离心管中。接下来即可进行细胞接种，最后使用移液管将细胞悬液反复吹打10次，以获得均匀的细胞悬液用于计数。使用无菌的黄色移液器吸头套住镊子的每个尖端。小心地将一个载玻片环尽可能居中放置于玻璃表面。每个培养皿内的这些环将用于隔离培养皿中的一个区域，用于接种神经元。使用移液枪头将环滑入每块培养皿的中心孔中。然后轻柔地向培养皿中加入适量体积的细胞。将细胞加入已放置在培养皿中的环的中心位置。每次处理不同培养皿时务必更换吸头。接下来，向每皿中靠近环外侧的位置加入100 µL稀释后的GDNF溶液，以促进神经元增殖。随后，在环外侧加入有丝分裂抑制剂氟代脱氧尿苷（fluoro dioxine）或FDU，以防止胶质细胞过度生长。移液器吸头通常需放回培养箱中，次日使用无菌移液器吸头覆盖镊子尖端，取出环状物，将培养皿放回培养箱，并尽可能减少扰动，直至实验开始。每天检查培养皿是否有污染迹象，一旦发现污染，立即移除有问题的培养皿。培养物在三周内即可用于电生理学、分子生物学实验以及免疫细胞化学检测。现在细胞已经接种，让我们观察一些培养细胞的代表性示例。此处观察的是14天前接种的原代培养细胞。这是一个良好的培养示例，因为可以看到具有突起延伸的明显细胞体。此外，请注意观察培养皿中是否存在霉菌或真菌生长，此类现象可能提示污染感染。我们刚刚向您展示了如何从新生啮齿类动物中制备原代分离的中脑多巴胺能细胞培养物。在进行该操作时，需牢记以下要点：保持无菌环境，仅使用出生后第0至第2天的新生动物，将其接种于健康的胶质细胞基质上，并使用胶质细胞条件培养基，同时保持一致的接种密度。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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小学游离中脑多巴胺鼠类新生儿的细胞培养

介绍了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型脑片的方法。这些器官型脑片培养物可用于观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑神经元的行为。...

胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

本视频介绍了一种从小鼠胚胎脑组织中培养多巴胺能神经元的方法。该过程包括用蛋白水解酶处理中脑，使细胞解离，并将细胞接种于聚合物包被的盖玻片上，在含抗生素的营养丰富培养基中进行培养，以促进细胞生长并维持其长期存活能力。...

培养和维持小鼠胚胎脑组织来源的多巴胺能神经元

该视频展示了从小鼠胚胎中脑分离和培养多巴胺能神经元的过程。分离出的腹侧中脑组织通过酶消化法进行解离。获得的多巴胺能神经元被收集并转移至多孔板内的微岛结构中。细胞在多巴胺能神经元培养基中孵育，以维持其在微岛内的高密度生长状态。...

原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。...

由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

多巴胺能神经元在大脑中发挥着重要的调节作用，其丢失与帕金森病相关。在本视频中，我们展示了如何从胚胎小鼠中脑分离培养原代中枢多巴胺能神经元。此类培养体系可用于研究这些神经元对各种应激因素高度敏感的特性。...

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外...

从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,...

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。...

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

本方案描述了人类中脑多巴胺能神经元的细胞培养，随后进行免疫染色，并通过获取的显微高内涵图像生成神经元表型谱，从而识别由遗传或化学调控引起的表型变化。...

人源干细胞衍生中脑多巴胺能神经元的表型分析

学习从啮齿动物新生幼崽制备原代中脑多巴胺神经元细胞培养的方法，用于研究多巴胺释放动力学和突触前特性。该技术为神经科学和药理学研究提供了重要的体外实验模型。

新生鼠中脑多巴胺能细胞原代分离培养

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