Name: Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Öğrenin, civciv embriyolarında tüm dağı antikor boyama yöntemini. HRP konjuge ikincil antikorlar ve DAB substrat kullanarak antijen ekspresyon desenlerini görselleştirin. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve sinirbilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biyolojik bilimler Bölümü, Iowa Üniversitesi tarafından NICHD ve bakımı himayesinde geliştirilen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (J. Dodd, TM Jessell ve A. Kawakami) tarafından geliştirilen monoklonal antikorlar (15.3B9, PAX7) elde edildi , Iowa. DP Uyuşturucu İstismarı Ulusal Enstitüsü Ruth Kirschstein Ödülü 1F32 DA021977-01A1 alıcı. Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.

I. Şematik Bakış: Bu video civciv embriyo tüm montaj immünohistokimya farklı adımları gösteriyor. İlk olarak, embriyo PFA sabittir [IHC1]. Sonra, endojen peroksidaz aktivitesini söndürülür [IHC2]. Embriyo daha sonra primer antikor [IHC3] inkübe edilir. Birkaç yıkamadan sonra, embriyo sekonder antikoru inkübe [IHC4] Renk reaksiyonu DAB [IHC5] kullanarak ortaya ve antikor boyama görünür turuncu [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="573" /> Bölüm 1: embriyoların Tespit <ol><li> Civciv embriyolarının tüm montaj immünohistokimya gerçekleştirmek için, ilk önce bir yumurta, forseps ile kabuk dokunarak ve kabuk parçaları kaldırarak açın. </li><li> Forseps ile kalın albümin çıkarın ve embriyo yukarı bakacak şekilde kaba forseps ile yumurta sarısı kesesi eğin. </li><li> Ince makas kullanarak, yolk kesesi embriyo etrafında bir kare kesti. Bir kaşık ile yumurta sarısı embriyonun çıkarın ve PBS içeren bir yemek yer. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, membranlar ve sarısı ve embriyo transferi PBS içeren yeni bir çanak dikkatle çıkarın. </li><li> Forseps ve böcek pimleri ile embriyo Pin, PBS aspire. PBS içinde% 4 PFA ile değiştirin ve embriyo RT 1s düzeltmek için izin. </li></ol> Bölüm 2: antikor adım için hazırlık embriyolar <ol><li> Potansiyel mikrobik kontaminasyonu en aza indirmek için, aşağıdaki adımları GKD 2 O kullanın. </li><li> Embriyo sabittir sonra fiksatif çözüm aspirat ve düzgün kimyasal atık olarak atmayın. PBS ile çanak doldurun. </li><li> yanında, bir Mikrodiseksiyonla bıçak kullanarak extraembryonic membranlar kaldırmak için embriyo etrafında bir kare kesilir. Forseps ile böcek pimleri çıkarın. </li><li> Pimleri çıkarıldıktan sonra, PBT (PBS, pH 7.4,% 0.5 Triton X) içeren bir sintilasyon flakon embriyo transferi künt sonunda Pasteur pipet kullanın. </li><li> Her biri için 10 dakika ile 3 kez, PBT embriyo yıkayın. </li><li> Sintilasyon şişeden PBT çıkarın ve PBTx potansiyel endojen peroksidaz inaktif hale getirmek için% 0.3 H 2 O 2 içeren değiştirin. </li><li> Nutator 2 saat oda sıcaklığında inkübe. </li><li> PBT, 3 kez her biri için 10 dakika, 30 dakika her biri için 3 kez embriyo yıkayın. </li></ol> Bölüm 3: Antikor inkübasyon <ol><li> Antikor ile embriyo leke için, tampon engelleme veya% 1 BSA /% 1 NGS / PBT (ikincil antikor keçi büyüdü çünkü biz NGS) bir saat boyunca embriyo yıkayarak başlayın. RT az bir saat için nutator inkübe edin. </li><li> 2 gün, 4 ° C nutator üzerinde bu çözüm engelleme tampon, ve inkübe embriyo birincil antikor 01:01 sulandırınız. Primer antikor seyreltme faktörü primer antikor seçimine bağlıdır. Burada, supernatent olarak verilmiştir Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, antikor kullanın. Biz tampon engelleme 01:01 sulandırmak. </li><li> yanında, PBT (3) 1 saat yıkar takip PBT 3 10 dakika yıkar, gerçekleştirin. </li><li> Yıkandıktan sonra, ikincil antikor 1:2500 engelleme tampon seyreltilmiş (Bu durumda peroksidaz konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) ve bu çözüm inkübe embriyo 4 O / N ° C nutator. </li><li> PBT (3) 1 saat yıkar takip PBT 3 10 dakikalık yıkama yapın. </li></ol> Bölüm 3: Renk reaksiyonu <ol><li> Renk reaksiyonu lekeli embriyo geliştirmek için, öncelikle Tris tamponu (100 mM Tris HCl, pH 7.4) 2 20 dakika yıkar gerçekleştirin. </li><li> DAB 500μg/ml Tris tampon substrat (3,3 &#39;diaminobenzidin tetrahydrochloride) Bu arada davlumbaz altında çözülür; karanlıkta çözüm tutmak, buz üzerinde. </li><li> Flakon içeren embriyo son Tris tampon yıkama çıkarın ve adım 3.2 5ml DAB çözüm ile değiştirin. 20 milyon nutator koyu tutun. DAB dekontamine için% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren kova Eppendorf ucu atın. </li><li> Bu arada% 0.3 stok dH 2 O H 2 O 2 buz üzerinde hazırlayın. </li><li> DAB embriyoların içeren flakon 50μl stok H 2 O 2 ekleyin. Karanlıkta saklayın. 1-2 dakika sonra, mikroskop altında tepki izlemek. </li></ol> Bölüm 4: Embriyo işleme fotoğraf ve histoloji <ol><li> Renk reaksiyonu tamamlandığında, çamaşır suyu kova DAB atmayın. 5 ml musluk suyu ile değiştirin. </li><li> PBS içinde 2 adet 10 dakikalık yıkama yapın. </li><li> Fotoğraf ve balmumu kesit işlemek için, her biri için 10 dakika (% 25,% 50,% 75 ve% 100) bir etanol dizi kurutmak. </li><li> 0.5 - 1 ml sedir ağacı yağı (embriyo saydam hale getirecek) etanol değiştirin. Sedir ağacı yağı fotoğrafçılığı için Süreci. </li><li> Fotoğrafçılık sonra, şişe embriyo dönmek ve% 100 etanol ile sedir ağacı yağı değiştirin. Etanol adımı tekrarlayın. </li><li> E değiştirin.% 100 etanol% 5 Fast yeşil FCF thanol ve 3 dakika (bu adım embriyolar histoloji için görünür kılmak) inkübe edin. Hızlı yeşil FCF çözümü için% 100 etanol ve histoloji süreci ile değiştirin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="Şekil 2" width="600" height="498" /> Aşağıda gösterilen örnekler, embriyoların aşamalarında HH 10 (A), 12 (B) ve 11 (C) disseke; Embriyolar PAX 7 gelişmekte olan sinir crestas ifade Somitlerin ve nöral tüp (A, B) yanı sıra; (C), notokord 15.3B9 (Not-1) (antikorlar Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası tarafından sağlanan) ile etiketlenir.

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

Bu video genç civciv embriyolarında tüm montaj antikor boyama işlemi farklı adımları gösteriyor. Bu protokol esas civciv 2,3 roman antikorların mekansal ve zamansal karakterizasyonu için kullanılan yanı sıra hakaret 4 embriyonik malformasyonlar belirlemek için bilinen antijenik belirteçlerinin kullanımı için.

<table><tbody><tr><td>Yumurtalar</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>Premium Fertile</td><td>Döllenmiş, HH4 (16 saat)</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 veya benzeri</td><td></td></tr><tr><td>Marsh Otomatik İnkübatör</td><td>Diğer</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Pens (1)</td><td>Araç</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>Pens (2)</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td> Plastik kaplar</td><td>Araç</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk Pompa</td><td>Araç</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Kapiler Pipet</td><td>Araç</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>Alev altında yuvarlatılmış kenar</td></tr><tr><td>Mikrodiseksiyon bıçağı</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>Fiksasyon sonrası embriyoyu çevreleyen membranlardan ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kürleme Ajanı ve Bazı</td><td>Reaktif</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>1 birim Kürleme Ajanı, 9 birim Baz karıştırın; 37°C'de gece boyunca bekletin</td></tr><tr><td>%16 PFA</td><td>Reaktif</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>%30 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Reaktif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Primer Antikorlar</td><td>Reaktif</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>Bu antikorlar için araştırmacılar fare donörler kullanmıştır</td></tr><tr><td>Peroksidaz konjugeli-Keçi Anti-Fare IgG (H+L) </td><td>Reaktif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidin tetrahidroklorür</td><td>Reaktif</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>-20°C'de saklayın; kullanmadan önce şişenin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.</td></tr><tr><td>Sedir ağacı yağı</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Minuten pinleri 0.2mm çap</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

chick tüm dağı antikor boyama yöntemi

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, beyin, nöral tüp ve hücre gruplarının gelişmekte olan antikor ifade çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video tüm antikor boyama HRP konjuge sekonder antikor kullanarak farklı adımları gösteriyor; İlk yumurta, embriyo disseke ve paraformaldehid sabit. İkincisi, endojen peroksidaz inaktive olur; embriyo sonra primer antikor maruz kalmaktadır. Birkaç yıkamadan sonra, embriyo HRP konjuge sekonder antikor ile inkübe edilir. Peroksidaz aktivitesi diaminobenzidin substrat reaksiyonu ile ortaya çıkar. Son olarak, embriyo, sabit ve fotoğraf ve kesit için işlenir. Kullanımı üzerinde floresan antikor Bu yöntemin avantajı, embriyolar bu nedenle, balmumu kesit kesit antijeni sitelerin çalışma sağlayan işlenebilir. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tanıtıldı.<sup&gt; 1</sup&gt;.

Bu video tüm montaj immünhistokimya, bir antijen mekansal ve zamansal ifade desenini genç civciv embriyolarında görüntülendi edilebilecek bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem başlangıçta Jane Dodd ve Tom Jessell tarafından piyasaya sürüldü.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Civciv embriyosu, erken embriyonik gelişim çalışmalarında değerli bir araçtır. Şeffaflığı, erişilebilirliği ve manipülasyon kolaylığı, onu ...

Bu video, HRP konjugasyonlu sekonder antikorlar kullanılarak civciv embriyosunda yapılan tüm mount immünohistokimya yönteminin farklı adımlarını göstermektedir. İlk olarak embriyo, paraformaldehit ile fikse edilir. Ardından endojen peroksidaz aktivitesi söndürülür.Embriyo daha sonra primer antikor içinde inkübe edilir. Birkaç yıkama işleminin ardından, embriyo HRP konjugeli sekonder antikor içinde inkübe edilir. DAB substratı kullanılarak renk reaksiyonu ortaya çıkarılır ve antikor boyaması turuncu görünür. Bu yöntemin floresan antikorların kullanımına göre avantajı, embriyoların parafin kesit için işlenebilmesi ve böylece antijen bölgelerinin enine kesitlerde incelenebilmesidir.Merhaba, ben Houston'daki Texas A&M'de bulunan Çevresel ve Genomik Tıp Merkezi'ndeki FIN Laboratuvarı'ndan Delphine. Bugün size, HRP konjuge antikorlar kullanarak tavuk embriyolarında hormon montaj antikor boyamalarının gerçekleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, antiepileptik ilaçlarla tedavi sonrası embriyoların morfolojisini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse, civciv embriyolarında tüm monta immünohistokimya işlemini gerçekleştirmek için başlayalım. İlk olarak

method-for-whole-mount-antibody-staining-in-chick

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Bu videoda, endobronşiyal biyopsilerden dendritik hücreleri tanımlamak için immünohistokimyasal boyama tekniği açıklanmaktadır.

İmmünohistokimyasal Boyama: İnce Doku Kesitlerinden Mekansal Bilgi Elde Etmeye Yönelik Bir Yöntem

Bu video, meme kanserinin bir fare modelinde tümör hedefleme antikorlarının biyolojik dağılımını incelemek için in vivo immünofloresan lokalizasyon (IVIL) tekniğini göstermektedir. Farede tümöre özgü bir antikorun intravenöz enjeksiyonu üzerine, tümör cerrahi olarak izole edilir ve antikorun tümör dokusu içindeki lokalizasyonu ex vivo immün boyama yoluyla doğrulanır.

Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Burada, üç boyutta normal doku parçaları canlı olarak tümör hücrelerinin istilasını incelemek için bir protokol mevcut. Bu organ kültürü tekniği, özellikle in vitro koşullarında potansiyel anti-invasif ilaçlar test etmek için uygulanır.

Test Chick Kalp Invasion Testi Kanser hücrelerinin invazivliğini ve Potansiyel Anti-invaziv Bileşikler Etkinlik

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Biz fare Wolf kanalı (WD) izolasyonu ve kültürü için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlarla kültürlü / taze izole Wigner tüm montaj immün için detaylı bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte, bu teknikler WD geliştirme, sarma ve farklılaşma çalışma sağlar.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Öğrenin, civciv embriyolarında tüm dağı antikor boyama yöntemini. HRP konjuge ikincil antikorlar ve DAB substrat kullanarak antijen ekspresyon desenlerini görselleştirin. Bu teknik, gelişimsel biyoloji ve sinirbilim araştırmalarında değerli bir araçtır.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Daha fazla video keşfet