Name: Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie Immunhistochemie an Drosophila-Larven zur Visualisierung von Proteinen an der neuromuskulären Synapse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Regulationsmechanismen der Synapsenbildung.

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Bevor Sie beginnen <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: PBT (0,1% Triton X100 in 1X PBS), PBTB (0,2% BSA in PBT) und PBTN (2% NGS in PBTB). </li><li> Dissect Drosophila-Larven. Bitte beachten Sie Drosophila Larven NMJ Dissection. </li></ol> Immunhistochemie <ol><li> Bewegen sich die Larven in ein 1,5 ml Röhrchen mit PBT. Waschen Sie die Larven zweimal für 15 Minuten in der PBT. Hinweis: um sich zu waschen, statt der 1,5-ml-Tube auf einem Kolbenpendel Mischer. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem pippetor und ersetzen sie durch frische Flüssigkeit. </li><li> Entfernen Sie die PBT. Wash in PBTB zweimal für 30 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die PBTB. Wash in PBTN zweimal für 15 Minuten. </li><li> Inkubieren in Primärantikörper in PBTN bei Raumtemperatur verdünnt für 1 Stunde oder bei 4 º C über Nacht. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBTB. Hinweis: Um hinzuzufügen Lösung spülen und entfernen schnell. </li><li> Zweimal waschen für 15 Minuten in PBTB. </li><li> Wash in PBTN für 30 Minuten. </li><li> Inkubieren in Sekundär-Antikörper (und konjugierte Primärantikörper, wenn Sie eines verwenden) in PBTN verdünnt. </li><li> Cover in Alufolie und Inkubation für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie zweimal mit PBTB. </li><li> Zweimal waschen für 15 Minuten mit PBTB. </li><li> Gehen Sie zur Montage. </li></ol> Montage Hinweis: Mount in Glycerin, wenn die Proben sofort abgebildet werden. Berg in Prolong Gold-, wenn die Proben vor der Belichtung gespeichert werden soll (für mehr als eine Woche) oder, wenn die Proben müssen mehrfach abgebildet werden. Um zu verwenden, statt eine Flasche zu verlängern, 65 º C Wasserbad für 2-3 Minuten. Nehmen Sie ein Aliquot verlängern Gold und halten in einer Wärme-Block bei 45-50 º C. <ol><li> Gießen gefärbt preps in PBT in einem Uhrglas. </li><li> Legen Sie einige Glycerin auf einen sauberen Glasobjektträger für die Verarbeitung. </li><li> Bewegen Sie den Tieren auf die Verarbeitung von Bild Kommissionierung sie aus dem Uhrglas durch eine Ecke mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, sie sind Kutikula nach unten. </li><li> Entfernen Sie den Kopf und Schwanz mit einer frischen Rasierklinge auf die Bearbeitung von Glas gleiten. Ein exacto-Messer mit Klinge Nr. 16 eignet sich gut dafür. </li><li> Auf einem anderen Bild (Montage Folie), legte einen kleinen Tropfen Glycerin / verlängern und breitete sie mit sauberen Pinzette. </li><li> Bewegen Sie den sezierten Tiere an der Montageplatte schieben durch ihre Kante, kümmert sich nicht um sie zu invertieren. Versuchen Sie, sie in Reihen in der gleichen Ausrichtung zu montieren. Berg 6-8 Tieren pro Folie. </li><li> Drop ein Deckglas auf, indem eine Kante in die Glycerin / Verlängern und langsam loslassen. </li><li> Verschließen Sie die Folie mit Nagellack. Hinweis [Nicht Bild, bis der Lack trocken ist. Dies dauert in der Regel 10 Minuten. Für die Proben in Verlängerung Gold montiert, lassen Sie die Folien trocken für mindestens drei Stunden vor dem Versiegeln oder Bildgebung.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunhistochemie (IHC) ist von entscheidender Bedeutung für das Studium der Biologie, weil es NMJ Visualisierung der NMJ ermöglicht. Dies wird durch die Verwendung von Antikörpern, dass die neuronalen Membran (zB HRP), der Präsynapse (zB CSP, SYT), und / oder die Postsynapse (zB DLG) erkennen erreicht. Signalmoleküle, Strukturproteine, oder neuartige Proteine ​​von Interesse kann auch gefärbt werden. Dann können Gene mutiert oder missexpressed werden, und IHC können Störung der synaptischen Struktur und / oder neuronale...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; Nutator-Mischer</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionsmesser Nr. 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Klingen Nr. 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larven nmj immunhistochemie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität eingesetzt. Die weit verbreitete Verwendung des<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor-System ist aufgrund seiner hohen Verfügbarkeit. Es kann mit Single-Cell-Auflösung analysiert werden. Es gibt 30 Muskeln pro hemisegment deren Anordnung innerhalb des peripheren Körper Wand bekannt sind. Insgesamt 31 Motoneuronen, diese Muskeln legen in ein Muster, das high fidelity hat. Mit Molekularbiologie und Genetik, kann man transgene Tiere oder Mutanten. Dann kann einer Studie der Entwicklung Auswirkungen auf die Morphologie und Funktion der NMJ. Immunhistochemie kann eindeutig Bild die Komponenten des NMJ verwendet werden. In diesem Artikel zeigen wir, wie Antikörper-Färbung verwenden, um die Visualisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven NMJ.

Dieses Protokoll zeigt, wie Immunhistochemie auf seziert Drosophila Larve führen.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Die neuromuskuläre Endplatte (NMJ) von Drosophila ist ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der synaptischen Entwicklung und Plastizität. Die weite Verbreitung ...

Dieses Protokoll beschreibt, wie man immunhistochematische Färbungen an dissezierten Gsof-Larven durchführt, um Proteine sichtbar zu machen, die an der Synapsenentwicklung beteiligt sind. Während des gesamten Verfahrens wird ein 1,7-mil-Röhrchen für die Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern sowie für die Waschschritte verwendet. Anschließend werden die Larven auf einen Bearbeitungsobjektträger überführt, wo sie mit einem Präzisionsmesser zurechtgeschnitten werden; die Präparate werden dann in einen Tropfen Antifading-Reagenz verbracht.Auf einem Objektträger wird ein Deckglas abschließend mit Nagellack versiegelt. Hallo, ich bin Jonathan Brent aus dem Labor von Brian McCade an der Abteilung für Physiologie und zelluläre Biophysik am College of Physicians and Surgeons der Columbia University. Wir verwenden dieses Verfahren, um die genetische Regulation der Synapsenbildung an der neuromuskulären Verbindung und am sich entwickelnden Axonknoten zu untersuchen.Beginnen wir also. Bevor Sie die Immunhistochemie am Gsof-Larven-NMJ durchführen, müssen Sie zunächst die Larven korrekt dissezieren. Um dieses Verfahren zu erlernen, sehen Sie sich den begleitenden Videoartikel mit de

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

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Forschung

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Biologie

Drosophila Larven NMJ Dissection

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Betäubung und Bildgebung von...

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Die dendritischen Verzweigung sensorischen Neuronen...

Morphologische Analyse Drosophila Larven peripheren sensorischen Neuron Dendriten und Axone mit Genetic Mosaike

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und...

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Die Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) wird als Modell verwendet, um die Morphologie und Funktion von Synapsen zu untersuchen. Dieses Video beschreibt wichtige Merkmale, die Forscher quantifizieren, um das NMJ zu charakterisieren. Das Beispielprotokoll demonstriert eine Software, die in der Lage ist, die Quantifizierung automatisch durchzuführen.

Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Verbindung (NMJ): Eine Methode zur Beurteilung der synaptischen Morphologie und Funktion

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Morphologie, Größe und Lage intrazellulärer Organellen sind evolutionär konserviert und scheinen ihre Funktion direkt zu beeinflussen. Die molekularen Mechanismen, die diesen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen, ist zu einem wichtigen Ziel der modernen Biologie geworden. Hier zeigen wir, wie diese Studien durch die Anwendung quantitativer Techniken erleichtert werden können.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .

Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.

Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks

Lernen Sie Immunhistochemie an Drosophila-Larven zur Visualisierung von Proteinen an der neuromuskulären Synapse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Regulationsmechanismen der Synapsenbildung.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

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