의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila

Biology

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Summary

고주파 전기 자극 압수와 같은 활동을 사용하는 것은에서 유도된 수 있습니다

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

Drosophila melanogaster은 활동과 같은 발작을 공부를위한 유용한 도구입니다. 발작이 물리적 충격이나 전기 자극을 통해 유도하거나 수있는 돌연변이의 다양한 발작 활동과 행동의 다양한 측면의 연구에 사용할 수 있습니다. 있을만큼 충분히 높은 전압에서 자극하면 야생 형을 포함한 모든 비행은, 압수와 같은 활동을 받아야합니다. 활동과 같은 발작 모든 - 또는 - 아무것도 응답하고 각각의 유전자형은 특정 발작 한계가 있습니다. 비행의 특정 유전자형의 발작 임계값은 약물 치료 또는 유전자 억제 또는 개선을 통해 변경할 수 있습니다. 임계값은 쉽게 전기 생리학에 의해 측정됩니다. 활동 같은 발작은 뇌에 직접 전달 및 흉부에있는 등 지느러미 근육 길이 (DLMs)를 통해 기록된 고주파 전기 자극을 통해 유도하실 수 있습니다. DLMs은 거대한 섬유 시스템의 일부에 의해 innervated 있습니다. 저전압, 고주파 자극과 함께 시작하고, 이후 작은 단위로 전압을 높여, 하나의 비행에 대한 발작 임계값을 측정할 수 있습니다.

Protocol

표본 준비 :

실험이 있기 전날 밤에, 원하는 유전자형의 남성 파리 anesthetized과 부드러운 나일론 플러그와 유리병에 넣습니다. 커튼 볼도 작동합니다. anesthetization 다음, 발작 임계값이 변경되어 밤 이상적이다하지만 이상, 파리가 가장 최소한 6 시간 동안 남아 있습니다 있도록.

실험 당일, 파리 한쪽에 치과 왁스의 레이어와 유리 슬라이드에 한 번에 하나씩 장착하고 있습니다.

하나의 비행은 진공 라인에 연결된 23 게이지 바늘 (자르는 날카로운 팁 포함)를 사용하여 머리에 의해 포착됩니다.

비행은 다음 왁스로 다리와 날개를 추진하여 슬라이드에있는 왁스에 부착된입니다.

파리가 고정되면 왁스는 목에까지 밀고 있으며, 눈이 완전히 머리를 고정합니다.

전기 생리학 :

지금 장착하고 출발 준비를 전기 생리학에 배치됩니다 파리는 설정.

전기 생리학 세트 최대 micromanipulators 세 세트, 부착이 날카롭게 텅스텐 전극 하나 각각 구성되어 있습니다. 전압은 자극 전극에 부착된 격리 장치에 연결된 자극기에 의해 제공됩니다. 기록 전극은 차례로 디지털 스토리지 오실로 스코프에 첨부되어 사전에 A에 연결되어 있습니다. 그것이 필수 아니지만, 그것은 응답 청취 만들 수 있도록 오실로 스코프에 매여 있고 스피커를 가지고 유용합니다.

접지 전극은 비행의 복부에 삽입됩니다.

기록 전극은 비행의 흉부에 도설 세로 근육의 하나에 삽입됩니다.

자극 전극은 머리에 삽입됩니다. 각각의 눈쪽으로 하나.

각 펄스 사이 이초과 연속 펄스 간격 : 자극기는 다음과 같은 설정을 시작해야한다. 맥박이 지연이 없어야합니다. 펄스 폭 0.2ms해야합니다.

오실로 스코프는 저장 기능이 설정되어 있고 다음 설정을해야 : 시간 ​​/ DIV는 1ms/DIV로 설정해야합니다. 볼트 / DIV는 0.1V/DIV 50 MV / DIV 중 하나에 설정되어야합니다.

거대한 섬유 임계값은 단일 펄스를 제공하고 답변을 얻을하는 데 필요한 최소 전압을 지적 의해 결정됩니다. 이 전압이 주위에 일반적으로 V.

거대한 섬유 임계값이 결정되면, 파리를 pulsing 중지하고 오실로 스코프의 설정을 변경 : 0.2 S / DIV

자극기의 설정을 변경해야합니다 : 펄스 간격은 단일로 설정해야합니다. 기차가 켜져 3 초로 설정해야합니다. 파형 매개 변수는 다음과 같습니다 300 MS에 대한 200Hz에서 0.5 MS 펄스. 전압은 원하는 설정 및 비행의 뇌에 전달 펄스의 고주파 기차로 변경됩니다.

발작이 유발되지 않은 경우 오실로 스코프 추적 기차 후 평평한 라인을 표시합니다. 설정이 신속하게 다시 시작하는 설정으로 설정하는 경우, 하나의 펄스가 거대한 섬유 시스템에 응답을 발생합니다.

발작이 유발되는 경우, 오실로 스코프 기차 후 발작과 같은 활동을 표시합니다. 설정이 빠르게 원래 설정으로 전환하는 경우, 하나의 펄스가 거대한 섬유 시스템에 응답을 활성화 실패합니다.

파리 활동과 같은 발작이 유발되지 않을 수있는 고주파 자극 wavetrain 후 불응기 있습니다. 더 발작이 발생하지 않으면 파리가 약 7 분 동안 내화물입니다. 발작이 유발되는 경우, 파리 약 17분의 불응기 있습니다.

임계값 결정하거나 때까지 거대한 섬유 반응보고 너무 약해 될 때까지 임계값을 결정하면, 추가 고주파 자극은 같은 날 (내화물 기간 동안 적절한 시간 후)에 전달할 수 있습니다.

실험이 완료되면, 즉시이 전기 생리학에서 제거 설정, 왁스에서 출시하고, 처분이다.

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Discussion

이 비디오는 개별 Drosophila의 비행의 발작 임계값을 결정하는 기본 단계를 보여주었다. 대신 디지털 오실로 스코프를 사용, 컴퓨터 디지타이저도 사용할 수 있습니다. 이 기술은 파리의 발작 직전에 약물이나 유전자 변경의 효과를 결정하는 데 유용합니다.

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Acknowledgments

이 작품은 NIH 연구 부여, 간질 재단 교부금 및 맥나이트 재단 교부금 Drosophila 과일 파리에서 MT 실험에 UC 버클리 동물 사용위원회 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다 지원했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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