Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Biology

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Summary

Este filme eo protocolo são destinados a ajudar o aprendizado de transferência nuclear.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

Transferência nuclear para um ovócito não fertilizado pode restaurar potencial de desenvolvimento de uma célula diferenciada. Isso demonstra que os processos subjacentes de diferenciação, desenvolvimento e envelhecimento são epigenético ao invés de processos genéticos. A reversibilidade desses processos abre perspectivas interessantes na pesquisa básica, e no futuro mais distante, na medicina regenerativa. Em camundongos, as células-tronco embrionárias podem ser derivadas de embriões clonados estágio de pré-implantação. Tais células-tronco embrionárias têm a capacidade de dar origem a todos os tipos de células do organismo adulto. Importante, estas células são geneticamente idênticos ao doador. Se aplicável ao ser humano, isso permitiria que a derivação de células-tronco de um paciente. Essas células poderiam então ser diferenciados para o tipo de célula afetada do paciente e estudou in vitro, ou usado para substituir as células danificadas ou em falta. O estudo da transferência nuclear no mouse continua a ser importante, pois ele pode nos informar sobre os princípios da reprogramação nuclear. Este filme e que acompanha o protocolo se destinam a ajudar o aprendizado de transferência nuclear no mouse, um método desenvolvido inicialmente no grupo do Prof Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Protocol

Preparações:

  1. A descrição detalhada de superovulação e cultura de embriões microdrop pode ser encontrada em outro lugar 2.
  2. Prepare uma placa de Petri com microgotas de meio de cultura de embriões (por exemplo, KSOM, Chemicon). Cubra com óleo mineral (óleo mineral lotes devem ser testados para compatibilidade com a cultura de embriões). Equilibrar a 37 ° C no ar mais 5% de CO 2. (Em Thermo Electron-3110 incubadora de água jacketed ou equivalente)
  3. Preparar um prato para o isolamento de oócitos: Gotas Local de tampão HEPES CZB e hialuronidase (0,1% w / v, Sigma) na metade do prato e HCZB na outra metade. Cubra com óleo mineral. Manter o prato quente em um palco aquecida de um microscópio de dissecação.
  4. Prepare o microscópio: Coloque uma pipeta de realização de um diâmetro exterior de cerca de 50 μ m (ligeiramente menor que o diâmetro do ovócito), e uma abertura de cerca de 20 m μ em um suporte de pipeta. Pipetas segurando são fáceis de fazer com o equipamento necessário, uma agulha extrator (Sutter Instruments) e um microforge (Narishige), mas eles também podem ser comprados a partir de Humagen.

    Carga de mercúrio 3-5 l μ para a cauda de uma micropipeta (diâmetro interno m μ 8). Evitar derramamentos de mercúrio. Prepare um prato com várias pequenas gotas cada de 11% w / v PVP (polivinilpirrolidona) em HCZB e 5 μ g / ml citocalasina B na HCZB. Use a tampa de uma placa de Petri, em vez de o prato-se como a tampa tem uma borda curta que não irá interferir com o movimento da exploração e as pipetas enucleação. Alinhar a pipeta holding e da pipeta enucleação em uma queda HCZB. Aspirar uma HZCB pouco na ponta da pipeta holding.
  5. Preparação de células do doador depende muito do tipo de célula e da experiência do pesquisador pretende executar. Em geral, as células do doador deve ser tratado com uma enzima proteolítica, como tripsina e mantidos em gelo para reduzir a viscosidade até a transferência.
  6. Humanamente euthanize ratos 14-15 horas após a administração de hCG. Ovidutos colheita e dissecá-los na calorosa HCZB-hialuronidase gotas. Depois de aprox. 5 min, oócitos serão na sua maioria livre de células do cumulus. Eles devem ser lavadas várias vezes em HCZB, em seguida, lavadas ainda na pré-gotas equilibrada KSOM, e mantidos na incubadora até enucleação.

Enucleação

Manipulações são feitas com micromanipuladores hidráulicos, (Narishige) em um microscópio invertido, como o TE200 Nikon. Um micromanipulador piezo (Primetech) é usado para a perfuração da zona pelúcida. De ponta chata enucleação e pipetas de transferência pode ser comprado de Humagen. Limpar e lubrificar a pipeta enucleação no PVP gotas de mercúrio, expulsando gotículas microscópicas e, aspirando e expulsando PVP. Para evitar aderência da agulha, o mesmo procedimento deve ser feito entre cada grupo de oócitos que são ou enucleados ou transferidos.

Coloque um pequeno grupo de oócitos na gota B HCZB-citocalasina. O tamanho do grupo deve ser adaptado ao nível de experiência do pesquisador. Oócitos não deve ser mantido no palco por mais de 20-30 min. Mover os instrumentos para o HCZB-citocalasina B gotas. A pipeta holding e da pipeta enucleação devem ser trazidos para o alinhamento com o plano equatorial do oócito. Isso será possível se a pipeta holding tem um diâmetro exterior que é ligeiramente menor que o óvulo em si. Rodar um óvulo até o eixo metáfase diferente de refração pode ser visto. Se um novato não pode ver o eixo, a placa metafásica podem ser identificadas usando o DNA de corante Hoechst e iluminação UV, no entanto, que não é compatível com o desenvolvimento embrionário eficiente. Posição do eixo metáfase às 3 horas e segure-o bem com a pipeta holding. Aplicar pulsos piezo para penetrar na zona pelúcida. Toque na placa metafásica, com a pipeta enucleação. Uma vez que a resistência do eixo metáfase pode ser "sentido", aspirar o eixo e retire a agulha. O citoplasma de oócitos é fluido, o fuso metáfase no entanto move-se como uma moita, quando tocou com a pipeta. Tente reduzir a quantidade de citoplasma que é removida com o fuso. Depois de um grupo de ovócitos tem sido enucleados, lavá-los através de meio de cultura de embriões e colocá-los na incubadora até a transferência. Alguns oócitos enucleados não devem ser transferidos, mas deve ser ativado e servir como um controle para enucleação. Estes oócitos fragmento dentro de algumas horas, indicando enucleação sucesso.

Transferência nuclear

Células lugar em PVP solução (11% PVP na HCZB). Se a parada muitos clones na fase 1-célula, a concentração de PVP deve ser reduzido para 5% ou menos. Células misture bem sagacidadeh PVP. Pick up células com uma pipeta com um diâmetro interno ligeiramente menor que o diâmetro da célula. A membrana da célula deve quebrar em cima aspiração. Em alguns casos, expulsando repetitivo e aspiração, bem como a aplicação de pulsos suaves piezo pode ser usado para quebrar a célula doadora. Uma nova queda de células do doador deve ser feita com cada grupo de oócitos sendo transferido, como células do doador se tornar pegajosa depois de algum tempo. Injetar a célula doadora quebrado logo após a quebra da membrana. Para a transferência, o foco no plano equatorial do oócito em si e não no plano equatorial da zona pelúcida, ea posição da transferência e da pipeta holding no mesmo plano. Segure o ovócito incluindo uma parte de seu citoplasma com firmeza. Penetrar na zona pelúcida utilizando pulsos piezo. Trazer o núcleo do doador até a ponta da pipeta, em seguida, empurre a ponta da pipeta quase para o lado oposto do oócito enucleado, perto da pipeta holding, fazendo um sulco profundo no ovócito. Aspirar uma pequena quantidade de citoplasma de oócitos para a pipeta, aplicar um único pulso piezo fracas para quebrar a membrana do oócito, retire o núcleo do doador, retire a agulha rapidamente, enquanto aspiração da membrana citoplasmática na extremidade direita do sulco. Ao mesmo tempo retirar a agulha e aspiração, deve ser possível para fechar o buraco deixado para trás por NT. Esta "técnica de remoção buraco vai reduzir o número de oócitos que lisar durante NT. Lavar os ovócitos reconstruídos em KSOM e devolvê-los à incubadora de 1-3 horas.

Ativação do oócito

Prepare uma metade de um prato com gotas de cálcio MCZB livre ea outra metade com gotas de cálcio MCZB livre mais 10mM Sr 2 + e 5 μ g / ml citocalasina B para inibir a extrusão corpo polar. Estabilizar durante 30 min. com menos de 5% CO 2 no ar. Lave bem em embriões NT sem cálcio MCZB e depois colocá-los em pequenos grupos em diferentes gotas de cálcio livre MCZB. Devolver o prato para a incubadora e cultura para 5-6 horas. Para controlar o protocolo de ativação artificial e para as condições de cultura de embriões, oócitos enucleados não deve ser usado. Eles irão desenvolver-se como embriões partenogenéticos. Após a ativação, lave os embriões através de embriões KSOM e colocar na incubadora de longo prazo de cultura. Pronúcleos deve ser visível neste ponto do tempo, indicando transferência bem sucedida.

Embrião Cultura Cookbook Mídia

Sais de mestre

Comece com 980 mL ultrapura H 2 O em garrafa estéril L 1

Adicionar componentes seca:

NaCl 4,760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glicose (D) 1000 mg (5,5 mM) Sigma G-6152

Adicionar componentes líquidos

Na-lactato (ácido láctico) 5,3 mL & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 mL Gibco 15140-122

Para Sais de stock MCZB:

Filtro de esterilizar 500 mL sais master (bom para 3-4 meses; armazenar a 4 ° C)

Para Sais de stock HCZB:

Iniciar com 500 mL sais mestre

Adicionar 50 mg PVA (cold-solúvel; Sigma P-8136)

Agitar por 30-60 min e estéril filtro (bom para 3 meses; armazenar a 4 ° C)

Ca + + Free MCZB (para a ativação de oócitos em 5% CO 2)

Comece com 99 mL sais de ações MCZB

Adicionar componentes seca:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na piruvato (ácido pirúvico) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamine 15mg Sigma G-8540

Albumina sérica bovina (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Redemoinho até que todos os componentes são dissolvidos; filtro estéril.

HCZB (por micromanipulação na atmosfera ambiente)

Comece com 99 mL sais de ações HCZB

Adicionar componentes seca:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761

Adicionar componentes líquidos:

128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 mL Sigma C-7902

Ajustar o pH para 7,5 com HCl 1 N

Redemoinho até à dissolução; filtro estéril.

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Discussion

Boa sorte!

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Acknowledgments

DE gostaria de agradecer ao Dr. Esconder Akutsu para compartilhar suas NT truques e Dr. Stephen Sullivan e Garrett Birkhoff para a leitura crítica do protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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