Name: Transferência nuclear em oócitos de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Aprenda a técnica de transferência nuclear em oócitos de camundongos para reprogramação celular. Este método demonstra como núcleos diferenciados retornam a estado embrionário, auxiliando pesquisas em medicina regenerativa e clonagem.

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DE gostaria de agradecer ao Dr. Esconder Akutsu para compartilhar suas NT truques e Dr. Stephen Sullivan e Garrett Birkhoff para a leitura crítica do protocolo.

Preparações: <ol><li class="jove_step"> A descrição detalhada de superovulação e cultura de embriões microdrop pode ser encontrada em outro lugar 2. </li><li class="jove_step"> Prepare uma placa de Petri com microgotas de meio de cultura de embriões (por exemplo, KSOM, Chemicon). Cubra com óleo mineral (óleo mineral lotes devem ser testados para compatibilidade com a cultura de embriões). Equilibrar a 37 ° C no ar mais 5% de CO 2. (Em Thermo Electron-3110 incubadora de água jacketed ou equivalente) </li><li class="jove_step"> Preparar um prato para o isolamento de oócitos: Gotas Local de tampão HEPES CZB e hialuronidase (0,1% w / v, Sigma) na metade do prato e HCZB na outra metade. Cubra com óleo mineral. Manter o prato quente em um palco aquecida de um microscópio de dissecação. </li><li class="jove_step"> Prepare o microscópio: Coloque uma pipeta de realização de um diâmetro exterior de cerca de 50 μ m (ligeiramente menor que o diâmetro do ovócito), e uma abertura de cerca de 20 m μ em um suporte de pipeta. Pipetas segurando são fáceis de fazer com o equipamento necessário, uma agulha extrator (Sutter Instruments) e um microforge (Narishige), mas eles também podem ser comprados a partir de Humagen. Carga de mercúrio 3-5 l μ para a cauda de uma micropipeta (diâmetro interno m μ 8). Evitar derramamentos de mercúrio. Prepare um prato com várias pequenas gotas cada de 11% w / v PVP (polivinilpirrolidona) em HCZB e 5 μ g / ml citocalasina B na HCZB. Use a tampa de uma placa de Petri, em vez de o prato-se como a tampa tem uma borda curta que não irá interferir com o movimento da exploração e as pipetas enucleação. Alinhar a pipeta holding e da pipeta enucleação em uma queda HCZB. Aspirar uma HZCB pouco na ponta da pipeta holding. </li><li class="jove_step"> Preparação de células do doador depende muito do tipo de célula e da experiência do pesquisador pretende executar. Em geral, as células do doador deve ser tratado com uma enzima proteolítica, como tripsina e mantidos em gelo para reduzir a viscosidade até a transferência. </li><li class="jove_step"> Humanamente euthanize ratos 14-15 horas após a administração de hCG. Ovidutos colheita e dissecá-los na calorosa HCZB-hialuronidase gotas. Depois de aprox. 5 min, oócitos serão na sua maioria livre de células do cumulus. Eles devem ser lavadas várias vezes em HCZB, em seguida, lavadas ainda na pré-gotas equilibrada KSOM, e mantidos na incubadora até enucleação. </li></ol> Enucleação Manipulações são feitas com micromanipuladores hidráulicos, (Narishige) em um microscópio invertido, como o TE200 Nikon. Um micromanipulador piezo (Primetech) é usado para a perfuração da zona pelúcida. De ponta chata enucleação e pipetas de transferência pode ser comprado de Humagen. Limpar e lubrificar a pipeta enucleação no PVP gotas de mercúrio, expulsando gotículas microscópicas e, aspirando e expulsando PVP. Para evitar aderência da agulha, o mesmo procedimento deve ser feito entre cada grupo de oócitos que são ou enucleados ou transferidos. Coloque um pequeno grupo de oócitos na gota B HCZB-citocalasina. O tamanho do grupo deve ser adaptado ao nível de experiência do pesquisador. Oócitos não deve ser mantido no palco por mais de 20-30 min. Mover os instrumentos para o HCZB-citocalasina B gotas. A pipeta holding e da pipeta enucleação devem ser trazidos para o alinhamento com o plano equatorial do oócito. Isso será possível se a pipeta holding tem um diâmetro exterior que é ligeiramente menor que o óvulo em si. Rodar um óvulo até o eixo metáfase diferente de refração pode ser visto. Se um novato não pode ver o eixo, a placa metafásica podem ser identificadas usando o DNA de corante Hoechst e iluminação UV, no entanto, que não é compatível com o desenvolvimento embrionário eficiente. Posição do eixo metáfase às 3 horas e segure-o bem com a pipeta holding. Aplicar pulsos piezo para penetrar na zona pelúcida. Toque na placa metafásica, com a pipeta enucleação. Uma vez que a resistência do eixo metáfase pode ser &quot;sentido&quot;, aspirar o eixo e retire a agulha. O citoplasma de oócitos é fluido, o fuso metáfase no entanto move-se como uma moita, quando tocou com a pipeta. Tente reduzir a quantidade de citoplasma que é removida com o fuso. Depois de um grupo de ovócitos tem sido enucleados, lavá-los através de meio de cultura de embriões e colocá-los na incubadora até a transferência. Alguns oócitos enucleados não devem ser transferidos, mas deve ser ativado e servir como um controle para enucleação. Estes oócitos fragmento dentro de algumas horas, indicando enucleação sucesso. Transferência nuclear Células lugar em PVP solução (11% PVP na HCZB). Se a parada muitos clones na fase 1-célula, a concentração de PVP deve ser reduzido para 5% ou menos. Células misture bem sagacidadeh PVP. Pick up células com uma pipeta com um diâmetro interno ligeiramente menor que o diâmetro da célula. A membrana da célula deve quebrar em cima aspiração. Em alguns casos, expulsando repetitivo e aspiração, bem como a aplicação de pulsos suaves piezo pode ser usado para quebrar a célula doadora. Uma nova queda de células do doador deve ser feita com cada grupo de oócitos sendo transferido, como células do doador se tornar pegajosa depois de algum tempo. Injetar a célula doadora quebrado logo após a quebra da membrana. Para a transferência, o foco no plano equatorial do oócito em si e não no plano equatorial da zona pelúcida, ea posição da transferência e da pipeta holding no mesmo plano. Segure o ovócito incluindo uma parte de seu citoplasma com firmeza. Penetrar na zona pelúcida utilizando pulsos piezo. Trazer o núcleo do doador até a ponta da pipeta, em seguida, empurre a ponta da pipeta quase para o lado oposto do oócito enucleado, perto da pipeta holding, fazendo um sulco profundo no ovócito. Aspirar uma pequena quantidade de citoplasma de oócitos para a pipeta, aplicar um único pulso piezo fracas para quebrar a membrana do oócito, retire o núcleo do doador, retire a agulha rapidamente, enquanto aspiração da membrana citoplasmática na extremidade direita do sulco. Ao mesmo tempo retirar a agulha e aspiração, deve ser possível para fechar o buraco deixado para trás por NT. Esta &quot;técnica de remoção buraco vai reduzir o número de oócitos que lisar durante NT. Lavar os ovócitos reconstruídos em KSOM e devolvê-los à incubadora de 1-3 horas. Ativação do oócito Prepare uma metade de um prato com gotas de cálcio MCZB livre ea outra metade com gotas de cálcio MCZB livre mais 10mM Sr 2 + e 5 μ g / ml citocalasina B para inibir a extrusão corpo polar. Estabilizar durante 30 min. com menos de 5% CO 2 no ar. Lave bem em embriões NT sem cálcio MCZB e depois colocá-los em pequenos grupos em diferentes gotas de cálcio livre MCZB. Devolver o prato para a incubadora e cultura para 5-6 horas. Para controlar o protocolo de ativação artificial e para as condições de cultura de embriões, oócitos enucleados não deve ser usado. Eles irão desenvolver-se como embriões partenogenéticos. Após a ativação, lave os embriões através de embriões KSOM e colocar na incubadora de longo prazo de cultura. Pronúcleos deve ser visível neste ponto do tempo, indicando transferência bem sucedida. Embrião Cultura Cookbook Mídia Sais de mestre Comece com 980 mL ultrapura H 2 O em garrafa estéril L 1 Adicionar componentes seca: NaCl 4,760 mg (81mm) Sigma S-5886 KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773 KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655 EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635 Glicose (D) 1000 mg (5,5 mM) Sigma G-6152 Adicionar componentes líquidos Na-lactato (ácido láctico) 5,3 mL &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 mL Gibco 15140-122 Para Sais de stock MCZB: Filtro de esterilizar 500 mL sais master (bom para 3-4 meses; armazenar a 4 ° C) Para Sais de stock HCZB: Iniciar com 500 mL sais mestre Adicionar 50 mg PVA (cold-solúvel; Sigma P-8136) Agitar por 30-60 min e estéril filtro (bom para 3 meses; armazenar a 4 ° C) Ca + + Free MCZB (para a ativação de oócitos em 5% CO 2) Comece com 99 mL sais de ações MCZB Adicionar componentes seca: NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761 Na piruvato (ácido pirúvico) 3 mg Sigma P-4562 L-Glutamine 15mg Sigma G-8540 Albumina sérica bovina (BSA) 500 mg Sigma A-3311 Redemoinho até que todos os componentes são dissolvidos; filtro estéril. HCZB (por micromanipulação na atmosfera ambiente) Comece com 99 mL sais de ações HCZB Adicionar componentes seca: Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784 NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761 Adicionar componentes líquidos: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 mL Sigma C-7902 Ajustar o pH para 7,5 com HCl 1 N Redemoinho até à dissolução; filtro estéril.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Por favor verifique para composições adicionais buffers na parte Protocol.

transferência nuclear em oócitos de camundongos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Transferência nuclear para um ovócito não fertilizado pode restaurar potencial de desenvolvimento de uma célula diferenciada. Isso demonstra que os processos subjacentes de diferenciação, desenvolvimento e envelhecimento são epigenético ao invés de processos genéticos. A reversibilidade desses processos abre perspectivas interessantes na pesquisa básica, e no futuro mais distante, na medicina regenerativa. Em camundongos, as células-tronco embrionárias podem ser derivadas de embriões clonados estágio de pré-implantação. Tais células-tronco embrionárias têm a capacidade de dar origem a todos os tipos de células do organismo adulto. Importante, estas células são geneticamente idênticos ao doador. Se aplicável ao ser humano, isso permitiria que a derivação de células-tronco de um paciente. Essas células poderiam então ser diferenciados para o tipo de célula afetada do paciente e estudou in vitro, ou usado para substituir as células danificadas ou em falta. O estudo da transferência nuclear no mouse continua a ser importante, pois ele pode nos informar sobre os princípios da reprogramação nuclear. Este filme e que acompanha o protocolo se destinam a ajudar o aprendizado de transferência nuclear no mouse, um método desenvolvido inicialmente no grupo do Prof Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Este filme eo protocolo são destinados a ajudar o aprendizado de transferência nuclear.

Transferência nuclear em oócitos de camundongos

A transferência nuclear para um oócito não fertilizado pode restaurar o potencial de desenvolvimento de uma célula diferenciada. Isso demonstra que os processos subjacentes...

Portanto, realizamos transferência nuclear NU porque nosso grupo tem interesse em reprogramação. Este é um processo fascinante no qual o núcleo diferenciado pode ser reprogramado para um estado embrionário. Estes são os reagentes caso SUM e HCCV e esta é a hialuronidase.E primeiro preparo um prato com, e isso irá para os incubadores para equilibrar com CO2. Estas são gotas, várias gotas para Turing que são cobertas com óleo mineral. Assim, eles calibram a atmosfera de CO2.Agora, prepare uma gota de HCZB. Isso será usado para lavagem. Isso é mantido em dias elevados e novamente coberto com este óleo mineral.Este alto, este cai com hialuronidase. Esta parte aqui são apenas gotas de HCCP. Estas são para lavagem.Isso é para remover as células ulu do lado O. Esta etapa é aquecida, então ela aquecerá até que eu volte e retire os sinais de óleo dos camundongos e cubra tudo com óleo mineral. Aqui estão gotas de PVP para a limpeza da agulha e para colocar as células, e isto é HCCB mais Cyla B. E aqui realizarei as manipulações.Ok, esta aqui é uma agulha colorida. O que estou fazendo agora é puxar uma agulha. Pronto, agora tenho uma agulha muito boa, bem fina.E agora isto é uma micro-fornalh

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Este vídeo descreve a injeção pronuclear de vetores lentivirais no espaço perivitelino de um embrião de camundongo fertilizado. O lentivírus contém o transgene, que é incorporado ao genoma do embrião fertilizado, dando origem a camundongos transgênicos.

Injeção de perivitelina baseada em vetor lentiviral: um método para transduzir o gene de interesse em oócitos de camundongo unicelular fertilizados

Aqui apresentamos um protocolo para a caracterização de oócitos antrais de rato com base na organização nucleolar.

Isolamento e Caracterização do mouse Antral Oócitos Baseado em Nucleolar organização da cromatina

Nós descrevemos um método melhorado dramaticamente para clonagem de rato usando tricostatina A, vitamina C e desionizada albumina de soro bovino. Mostramos um protocolo simplificado, reprodutível, que suporta o desenvolvimento eficiente de embriões clonados. Assim, este método pode tornar-se um procedimento padronizado para clonagem de rato.

Combinacional tratamento de tricostatina A e a vitamina C melhora a eficiência da clonagem de ratos por transferência Nuclear de células somáticas

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

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Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

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Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

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Capturando a agitação baseada no citoesqueleto do núcleo do ovócito de camundongo em escalas espaciais

Este protocolo ilustra a técnica para extrair óvulos ou embriões em estágio inicial fertilizado do oviduto de camundongos. A capacidade de identificar o infindibulum e inserir uma agulha na extremidade sem corte, é essencial a correta execução do procedimento.

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