Name: Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Biofilme von Staphylococcus aureus in Drip-Flow- und Rotating-Disk-Reaktoren kultivieren. Diese Methoden ermöglichen die Analyse von Biofilmstrukturen unter definierten Scherkräften.

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NIAID gewähren K22AI081748.

1. Die Drip Flow-Biofilm-Reaktor <ol><li> Die Tropf-Flow Biofilmreaktor (erhältlich bei Biosurface Technologies oder kundenspezifische Versionen können in der Regel von der Universität Werkstätten vorgenommen werden, siehe Abbildung 1) montiert ist und autoklaviert. Montage beinhaltet das Anbringen Coupons in Kammern und Sicherung Kammer Deckel. Die Kammer, zusammen mit Biofilm Medium (CASO-Bouillon 2 g / L und Glucose 2 g / L) und Zulauf Nährstoff-Rohren werden durch Autoklavieren sterilisiert. </li><li> Beimpfung des Tropf Reaktor wird erreicht, indem der Reaktor auf eine flache Oberfläche, Klemmung des Abwassers Schlauchleitungen, Abfüllung jeder Kammer mit 10 ml CASO-Bouillon und Zugabe von 10 ul einer S. vorgeformten aureus Kultur über Nacht in CASO-Bouillon gewachsen. Die beimpften Reaktor wird dann in einem 37 ° C Inkubator Platz für 18 Stunden. </li><li> Nach 18 Stunden Inkubationszeit wird das Abwasser Rohr abgeklemmt und der Reaktor auf einen Holzblock geschnitten, um eine 10 °-Winkel angeordnet. </li><li> Aseptisch verbinden Zulauf Nährstoff Schlauch an der Flasche mit der kontinuierlichen Nährlösung. Feed the Rohrleitung durch die Pumpe und prime die Rohre, indem Sie die Pumpe mit einer maximalen Geschwindigkeit (variiert je nach Pumpentyp). </li><li> Sobald der Zulauf-Schlauch ist grundiert Stopp der Pumpe und befestigen Sie verbinden Nadeln (22 Gauge, 1 Zoll) bis zum Ende jeder Röhre. Wischen Sie die Kammereinlass Stopfen mit einem Ethanol-Wisch-und aseptisch legen Sie die Nadeln durch den Einlass Stopper. </li><li> Schalten Sie die Pumpe und lassen Sie die Medien langsam tropft (Durchfluss bis 125 ul / Minute) über die Coupons. Die Medien sollten nach unten entlang der Kupon vom Einlass Anschlag Anschluss an das Abwasser-Anschluss. Betreiben Sie den Reaktor in kontinuierlichen Fluss für 2-5 Tage (je nach Anwendung), gelegentlich die Überprüfung der Reaktor für eine ordnungsgemäße Entwässerung. </li><li> Zur Ernte der Tropf Reaktor Biofilmen, die Pumpe stoppen und entfernen Sie vorsichtig die Nadeln aus dem Reaktor. Der Reaktor kann dann auf einer ebenen Fläche aufgestellt werden und die Coupons können aseptisch entfernt werden mit einer sterilen Pinzette. Wenn Mikroskopie ist erwünscht, die Coupons können nun entsprechend verarbeitet werden (Abbildung 2B ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer S. aureus Biofilm in einen Tropf Biofilmreaktor gewachsen). Wenn die Quantifizierung des Biofilms Biomasse oder Physiologie Studien das Ziel der Studie sind, kann der Biofilm aus den Coupon mit einem Zellschaber entfernt werden. Halten Sie die Coupons mit einer Pinzette vorsichtig abkratzen der Biofilm aus den Coupon in einem konischen Rohr mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit einem Zellschaber. Hinweis: Zur Quantifizierung der Kolonie-bildenden Einheiten in den Biofilmen, ist es notwendig, die geerntet Biofilmen mit einem Gewebe-Homogenisator zu Klumpen disaggregate und bilden eine homogene Suspension zu homogenisieren. Verschiedene Modelle von Gewebe Homogenisatoren werden für diese Anwendung geeignet. Wir verwenden eine Fisher Scientific Tissuemiser Homogenisator (Produkt # 15-338-420) bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute bis Biofilm Proben zu homogenisieren. Die Nichtbeachtung der Biofilm homogenisieren wird in einer Unterschätzung der Kolonie bildenden Einheiten in der Probe vorhanden führen. </li></ol> 2. Die rotierende Scheibe Biofilm Reactor <ol><li> Die rotierende Scheibe Biofilmreaktor (erhältlich bei erhältlich Biosurface Technologies oder können nach Maß, siehe Abbildung 3) montiert ist und autoklaviert. Montieren Sie den Reaktor durch den ersten Platz die sich drehende Scheibe Coupons in die Schlitze der drehenden Scheibe und legte sie in einen 1-Liter Becherglas mit einem Überlauf-Anschluss. Eine Reihe 15-Gummistopfen mit Löchern darin gebohrt, um Fördermedien-und Entlüftung zu ermöglichen, da der Reaktor Kappe verwendet. Der Reaktor, Biofilm Medien (CASO-Bouillon 2 g / L und Glucose 2 g / L) und Zulaufschlauch werden dann durch Autoklavieren sterilisiert. </li><li> Die rotierende Scheibe Biofilmreaktor ist, indem 250 ml des sterilen Mediums in den Reaktor geimpft und Zugabe von 0,5 ml einer Übernachtkultur S. aureus Kultur in CASO-Bouillon gewachsen. Der Reaktor wird dann auf einer Rührplatte auf 250 rpm gestellt und über Nacht bei der gewünschten Temperatur. </li><li> Nach 16 Stunden Inkubationszeit verbinden Sie den Zulaufschlauch mit dem Anschluss auf mittlere Reservoir und verbinden Sie es mit der Schlauchpumpe. Die Pumpe wird dann auf Turn und Fluss auf ~ 0,25 ml / min (Durchfluss kann je nach Wachstum gewünscht verändert werden). </li><li> Nach 24 Stunden beenden den Reaktor und aseptisch entnehmen Sie die Disc, ohne den Biofilm-Coupons. Entfernen Sie die Coupons mit einer sterilen Pinzette und tauchen jeweils in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung keine lose Bakterien zu entfernen. </li><li> Für antimikrobielle Verbindung testen, können die Chips in die einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit Verbindungen von Interesse platziert werden. Nach der Inkubation werden Chips in 1,5 ml Reaktionsgefäßen mit 1 mL Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung überführt und homogenisiert mit einem Gewebe-Homogenisator auf den intakten Biofilm zu zerstreuen. </li><li> Die Zellen werden dann seriell verdünnt und ausplattiert auf Nähragar Medium, um lebensfähige Kolonie Formi bestimmenng Einheiten. </li><li> Hinweis: viele Varianten finden Sie auf der oben genannten Protokoll vorgenommen werden. Zum Beispiel kann sich drehende Scheibe Coupons mit beschichtet werden oder ausgefertigten potenzieller Anti-Biofilm-Verbindungen, um die Wirksamkeit zu testen. Biofilm Dispergiermittel können auch ausgewertet werden Inkubation Coupons in Dispergiermittel Verbindungen und Quantifizierung von Bakterien angebracht gegenüber abgenommen werden. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Einrichtung Tropf Reaktor ist, wenn Abbildung 1 dargestellt. Nach drei Tagen fließen reichlich Biofilm wird auf dem Coupon Oberfläche, 2A akkumulieren. Die gesamte Biomasse ist abhängig von Bakterienstämmen und präzise Wachstumsbedingungen. Eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines S. aureus Biofilm in den Tropf Reaktor aufgewachsen ist in Abbildung 2B gezeigt. Eine rotierende Scheibe Reaktor ist in Abbildung 3A gezeigt. Das Protokoll beschrieben, kann auf die spezifischen Anforderungen in der Regel keine Mikroorganismus, der Bildung eines Biofilms angepasst werden. Abbildung 3B zeigt die sich drehende Scheibe mit 18 Kunststoff-Platten angebracht. Diese Platte gewachsenen Biofilmen sind besonders gut für antimikrobielle Tests geeignet und liefern gut reproduzierbare Ergebnisse 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Der Tropf Reaktor-Setup. Wichtige Komponenten sind beschriftet. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiel für einen Tropf flow S. aureus Biofilm. A) Dieser Biofilm wurde drei Tage nach dem beschriebenen Protokoll gewachsen. Deckel aus den ersten beiden Kammern des Reaktors entfernt werden, um die gelbe S. zeigen aureus Biofilm Biomasse. B) Sacnning elektronenmikroskopische Aufnahme eines S. aureus Biofilm in den Tropf Reaktor aufgewachsen. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die rotierende Scheibe Reaktor. A) Beispiel für ein laufendes Spinning-Disk-Reaktor. Key-Komponente gekennzeichnet sind. B) Nahaufnahme einer sich drehenden Scheibe.

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</ol>

Biofilme in verschiedenen Reaktoren gezüchtet wird, haben oft unterschiedliche Eigenschaften und jeden Reaktor verfügt über verschiedene Anwendungen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung von zwei Biofilmreaktoren: einen Tropf flow Biofilmreaktor und einer rotierenden Scheibe Reaktor. Drip Strömungsreaktoren sind nützlich für den Anbau von geringer Scherung Biofilmen bei einem Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche und sind für eine Vielzahl von Bedingungen. Wir finden sie sehr bequem für Studien, in denen eine große Me...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Durchflussreaktoren</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Rotating Disk Reaktoren</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die verwendung von drip flow und rotating disk-reaktoren für staphylococcus aureus biofilm analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Die meisten Mikroben in der Natur gedacht, als Aufputz-assoziierten Gemeinschaften in Biofilmen existieren. 1 Bakterielle Biofilme sind in einer Matrix umgeben und an einer Oberfläche. 2 Biofilmbildung und Entwicklung sind häufig im Labor mit der Batch-Systeme, wie Mikrotiterplatten oder Durchfluss studiert Systeme, wie zB Flow-Zellen. Diese Methoden sind nützlich für das Screening von Mutanten und chemischen Bibliotheken (Mikrotiterplatten) 3 oder wachsende Biofilme zur Visualisierung (flow-Zellen) 4. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Protokolle für den Anbau von Staphylococcus aureus in zwei weitere Arten von Flow-System Biofilme: die Tropf-Flow Biofilmreaktor und der rotierenden Scheibe Biofilmreaktor. Drip flow Biofilm Reaktoren sind für die Untersuchung von Biofilmen unter geringer Scherung Bedingungen angebaut konzipiert. 5 Der Tropf Reaktor besteht aus vier parallelen Test-Kanäle, einer Kapazität von jeweils einem Standard-Glasobjektträger großen Coupon oder eine Länge von Katheter oder Stint. Die Tropf-Flow-Reaktor ist ideal für Mikrosensorik Überwachung, allgemeine Biofilm Studien, Biofilm Kryoschneiden Proben, hohe Produktion von Biomasse, medizinisches Material Auswertungen und innewohnenden medical device testing. 6,7,8,9 Die rotierende Scheibe Reaktor besteht aus einem Teflon-Platte mit Aussparungen für herausnehmbare Coupons. 10 Die herausnehmbare Coupons können von jedem zerspanbaren Material. Der Boden der rotierenden Scheibe enthält einen Stabmagneten, damit Plattenrotation zu Flüssigkeitsoberfläche Scher über flächenbündige Coupons zu erstellen. Die gesamte Festplatte mit 18 Coupons ist in einem 1000 mL Glas Seitenarm Reaktor vorgelegt. Eine flüssige Nährmedien wird durch den Behälter zirkuliert, während die Festplatte durch einen Magnetrührer gedreht wird. Die Coupons werden aus dem Reaktor entnommen und dann abgeschabt, um den Biofilm Probe für weitere Untersuchungen oder Mikroskopie zu sammeln. Rotating Disc Reaktoren sind für Laboruntersuchungen von Biozid-Wirksamkeit, Biofilmentfernung und Leistung von Anti-Fouling-Materialien entwickelt. 9,11,12,13

Protokolle für die Nutzung offenes System fließen Biofilmen mit Tropf Strömungsreaktoren und rotierenden Scheibe Reaktoren sind im Detail vorgestellt.

Die Verwendung von Drip Flow und Rotating Disk-Reaktoren für Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Es wird angenommen, dass die meisten Mikroben in der Natur als oberflächenassoziierte Gemeinschaften in Biofilmen existieren.1 Bakterielle Biofilme sind in eine Matrix eingeschlossen und an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Biofilme unter geringer oder mäßiger Scherkraft unter Verwendung entweder eines Tropffluss-Biofilmreaktors oder eines rotierenden Scheibenreaktors anzuzüchten. Die Probenträger im Biofilmreaktor werden zunächst mit Bakterien beimpft und bei 37 Grad Celsius inkubiert, um den bakteriellen Zellen die Anheftung an die Wachstumsflächen zu ermöglichen. Sobald sich die Zellen an den Probenträgern angeheftet haben, wird ein Durchfluss von Wachstumsmedium gestartet, der eine Scherkraft erzeugt, die während der Biofilm-Entwicklung wirksam ist.Ausgereifte Biofilme können anschließend zur Analyse gewonnen werden, um die Biofilme zu beobachten. Mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie kann die Ultrastruktur der erzeugten Biofilme bestimmt werden. Ich bin Blaze Balls.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Durchflusskammern liegt darin, dass eine hohe Biomasseproduktion und die Erzeugung mehrerer identischer Biofilme leicht erreichbar sind. Die Demonstration dieses Verfahrens übernehmen Rachel Stevenson und Kelly Schwartz, eine Technikerin und eine Doktorandin aus meinem Labor. Der Tropffluss-Bio

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung von in vitro Biofilm durch S. aureus in einer Poly-L-Lysin-beschichteten Multiwell-Platte. Die biofilmförmige Platte kann für nachgelagerte Experimente verwendet werden.

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Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Die meisten bakteriellen Infektionen erzeugen einen Biofilm. Biofilm-assoziierte Bakterien sind aufgrund ihrer Umgebung oft phänotypisch resistent gegen Medikamente. Neuartige antibakterielle Moleküle, die Bakterien in Biofilmen abtöten, haben daher hohe Priorität. Wir etablieren einen Assay, um schnell nach antimikrobiellen Verbindungen zu suchen, die bei der Beseitigung von Biofilmen wirksam sind.

Targeting Biofilm Assoziierte<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Verwendung von Resazurin Based Drug-Anfälligkeit Assay

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.

Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

Hier beschreiben wir die Verwendung eines höheren Durchsatz mikrofluidischen Bioreaktors gepaart mit einem fluoreszierenden Mikroskop für die Analyse der Schubspannung Auswirkungen auf Pseudomonas Aeruginosa Biofilms grün fluoreszierende Proteine, einschließlich Instrument zum Ausdruck zu bringen eingerichtet, die Bestimmung der Biofilm Abdeckung, Wachstumsrate und morphologischen Eigenschaften.

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

Dieses Protokoll stellt die Methodik zur Durchführung von Biofilmwachstums- und Biomassemessungen unter Verwendung von selbstmontierten Tiefbrunnen-PCR-Plattengeräten für ein statisches Biofilm-Screening mit 96-Well-Deckel mit hohem Durchsatz vor.

Erzeugung größerer bakterieller Biofilm-Biomasse mit PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Murine Haut-und Weichteilinfektionen Infektionen Modell ist für die Beurteilung der Virulenz Funktion von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und dem Host-Immunreaktionen eingesetzt. Hier präsentierten wir eine subkutane Infektion Modell für Haut-und Weichteilinfektionen.

Subkutane Infektion von Methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus (MRSA)

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