FISH para el diagnóstico genético preimplantacional

Medicine
 

Summary

En este artículo se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicadas al diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en un entorno clínico.

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Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis . J. Vis. Exp. (48), e2570, doi:10.3791/2570 (2011).

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Abstract

El diagnóstico de preimplantación genética (PGD) es una alternativa establecida para el diagnóstico prenatal, y consiste en la selección de embriones previo a la implantación de una cohorte generados por la tecnología de reproducción asistida (ART). Esta selección puede ser requerido por familiares enfermedad monogénica (fibrosis quística, por ejemplo), o por una pareja lleva un reordenamiento cromosómico (por ejemplo, una traslocación recíproca de dos vías). El DGP está disponible para las parejas que han tenido anteriormente los niños afectados, y / o en el caso de reordenamientos cromosómicos, abortos involuntarios recurrentes o infertilidad. Los ovocitos aspirados estimulación ovárica siguientes son fecundados por inmersión en vitro en el semen (FIV) o inyección intracitoplasmática de espermatozoide un individuo (ICSI). Pre-implantación el estadio de división de embriones se realiza una biopsia, por lo general por la eliminación de una sola célula en el día 3 después de la fertilización, y la célula de la biopsia se analiza para establecer el estado genético del embrión. Hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de las células de la biopsia fija con el objetivo específico de sondas de ADN es la técnica de elección para detectar desequilibrios cromosómicos asociados con reordenamientos cromosómicos, y para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X para el que no se no hay mutación específica de la prueba. De pescado también ha sido utilizado para seleccionar embriones de aneuploidías cromosómicas espontáneas (también conocido como SPG o PGD AS-) con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida, sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina. Se describe la selección de sondas adecuadas para una sola célula FISH, las técnicas de difusión de los núcleos de blastómeros, y la hibridación in situ y la puntuación de la señal, aplicado al DGP en un entorno clínico.

Protocol

1. Lisis y Difusión de un núcleo de una biopsia de blastómeros

  1. Buffer de lisis celular de las células de la difusión (0,2% de Tween 20 en 0,01 M de HCl, pH 2,0) deben estar preparados 24 horas de antelación y se almacenan a -20 ° C. La preparación de 100 ml y filtrar 20 en un recipiente estéril de 30 ml universal, utilizando una aguja estéril jeringa de 20 ml y el filtro de la jeringa. Dispensar alícuotas de 1 ml en tubos de 1,7 ml 10-15 estéril de microcentrífuga, cierre y etiqueta de los tubos antes de la congelación. Es recomendable contar con dos lotes diferentes es el uso, el nuevo lote y el lote anterior, lo que ha sido probado y se puede utilizar si el nuevo grupo no es satisfactoria.
  2. Descongele el tampón de lisis a temperatura ambiente 30 minutos antes de la biopsia. A efectos prácticos la temperatura de trabajo será entre la temperatura ambiente y temperatura de la mano.
  3. Marca un círculo pequeño (aproximadamente 5 mm de diámetro) en la parte inferior de una diapositiva amina recubiertos (por ejemplo, Genetix) utilizando una pluma de diamantes y la etiqueta antes de la diapositiva con el número de caso, número de la diapositiva única, y la fecha de la biopsia. Utilice una diapositiva por separado para cada blastómero en orden numérico, y la etiqueta con el número de embriones. Las diapositivas deberán estar etiquetados con un lápiz duro como 4H, y "borrado" con un guante de látex para eliminar el polvo de grafito.
  4. Coloque una pequeña cantidad de solución amortiguadora de lisis dentro del círculo.
  5. La transferencia de la biopsia de blastómeros en el tampón de lisis. Si es necesario agregar solución amortiguadora de lisis dentro del círculo hasta que la célula comienza a lisar, lisis de la célula debe por completo y el citoplasma se dispersan antes de que se seque el buffer.
  6. Observe el núcleo para asegurar que se mantiene dentro del círculo y no se pierde, y si el celular no tiene un núcleo o tiene múltiples núcleos, la biopsia otra celda.
  7. Salga de la diapositiva se seque al aire a temperatura ambiente.

2. Hibridación in situ en un núcleo único blastómeros

  1. Prepare una serie de etanol (70, 90 y 100%) prepararse en agua destilada estéril.
  2. Activar y configurar el bloque de calor (por ejemplo, Hybaid Omnislide o Hybrite Vysis) a 75 ° C.
  3. Descongele las sondas, vortex y centrifugar. Los reactivos deberán ser testigo y se comprueba su correcto antes de hacer la mezcla de sondas. Pipeta volúmenes según lo especificado por el fabricante para hacer la mezcla de la sonda en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml estéril y agitar y centrifugar antes de su uso. El volumen total de la mezcla de la sonda debe ser suficiente para permitir que l 2 por núcleo para ser probado y se redondea con una precisión de 10 l para permitir un margen de seguridad.
  4. Pre-lavado de los portaobjetos en jarras Coplin con tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) por 5 min a temperatura ambiente.
  5. Enjuague los portaobjetos dos veces en agua destilada estéril.
  6. Deshidratar las diapositivas con la serie de etanol (70, 90 y 100%) durante 2 minutos cada uno, a temperatura ambiente y el aire seco. Asegúrese de que las diapositivas se sumerge por completo y si el polvo de grafito flota a la superficie, cubra con un paño limpio.
  7. Registrar la posición del núcleo dentro del círculo mediante la visualización con un microscopio de contraste de fase.
  8. Deshidratan con etanol al 100% durante 2 min a temperatura ambiente y el aire seco.
  9. Aplicar 2 l de la mezcla de la sonda, y cubrir con un cubreobjetos de 9 x 9 mm (un cuarto de 18 x 18 mm cubreobjetos n º 1).
  10. Sellar los bordes del cubreobjetos con goma de cemento (por ejemplo, goma de vaca, de corrección de la vaca).
  11. Codenature las diapositivas en un bloque caliente a 75 ° C durante 5 minutos, y después se hibridan las diapositivas durante la noche (16-20 h) en una cámara húmeda a 37 º C. Mezcla de la sonda que consisten enteramente de las sondas centrómero (es decir, ligada al sexo de los casos), dará un resultado satisfactorio después de 60 minutos de la hibridación.
  12. Prepare un baño de agua con suficientes recipientes de Coplin y el calor a 71 ° C.
  13. Preparar un 0,4 x citrato salino estándar (SSC) de solución de lavado estrictas (pH 7,0 a 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mm C 6 H 5 O 7 Na 3 .2 H 2 O) y el calor en el baño de agua.
  14. Vierta 50 mL de lavado estrictas por frasco Coplin necesario y comprobar que la temperatura es de 71 ° C inmediatamente antes de su uso mediante un termómetro limpio.
  15. Retire con cuidado el cemento de caucho de cada diapositiva y enjuagar el cubreobjetos con 4x SSC/0.05% de Tween 20 (pH 7,0) a temperatura ambiente.
  16. Se lavan los portas en el lavado de 0,4 x SSC estrictos a 71 ° C durante 5 min. Lavado de no más de 6 diapositivas por jarra de Coplin.
  17. Se lavan los portas en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min.
  18. Si la mezcla contiene la sonda sonda indirectamente etiqueta (s), la fuga de las diapositivas de exceso de líquido y aplicar 20 L de anticuerpo conjugado con fluorescencia en un cuadrado de 20 x 20 mm de Parafilm.
  19. Incubar en una cámara húmeda a 37 ° C durante 15 min.
  20. Retire el Parafilm y lavar de vez en Tween20 4x SSC/0.05% a temperatura ambiente durante 2 min.
  21. Lavar dos veces durante 2 minutos en PBS unat la temperatura ambiente y de drenaje de las diapositivas.
  22. Aplique 6 l de DAPI / Vectashield (160 ng de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihidrocloruro de 1 mL de medio de montaje Vectashield, Vector Laboratories) a un 22 x 22 mm no. 0 cubreobjetos y se invierte el portaobjetos sobre el cubreobjetos.
  23. Blot y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.

3. Análisis utilizando un microscopio de fluorescencia debidamente equipados con los filtros adecuados para las sondas utilizadas.

  1. Señales de puntuación mediante la visualización directa utilizando un microscopio de fluorescencia y un solo filtros pasa banda para cada fluorocromo en el ensayo. Cada núcleo debe ser anotado por dos analistas. Como regla general, debe conducir a la puntuación de una sola señal en dos señales muy próximas entre sí menos de un dominio (la señal de ancho) de distancia, sin embargo, el juicio basado en la experiencia debe ser ejercido para interpretar las señales de diferente tamaño, intensidad, y la separación.
  2. El uso del software de imágenes (por ejemplo, Isis, MetaSystems, Altlußheim, Alemania; CytoVision, Genetix) para capturar una imagen del núcleo de la confirmación del diagnóstico visual y archivo de imágenes como parte de un plan de garantía de calidad de laboratorio.

4. Los resultados representativos:

Metafase y núcleos en interfase de cultivo de linfocitos de sangre periférica debe ser examinado para confirmar que las sondas seleccionadas son específicas para los cromosomas de translocación, informativo de los puntos de ruptura (las sondas de hibridación subtelomere debe sólo a los segmentos de translocación y la sonda centrómero (s) a la céntrica segmento (s)) y las señales de los núcleos en interfase debe ser brillante y discreto. Anotar el número de señales para cada sonda en 100 núcleos en interfase de cada socio, se recomienda evaluar la eficiencia de la prueba. En este caso, dos señales se anotó en el 95% -99% de los núcleos de cada sonda. La figura 1 muestra una metafase y el núcleo de la interfase de una preparación para una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9.

Las señales en los núcleos en interfase de blastómeras de embriones debe ser brillante y discreto y anotó con distintos filtros de paso de banda de los colores utilizados. La figura 2 muestra un núcleo blastómero con un patrón de señal normal (2 copias de todos los loci a prueba), en consonancia con un complemento cromosómico normal o equilibrado para el cromosoma 5 y 9, y un núcleo con un patrón de señal anormal en consonancia con un producto de la translocación desequilibrada que ha monosomía (una copia) para el segmento translocado del cromosoma 5 y la trisomía (tres copias) para el segmento translocado del cromosoma 9.

Figura 1
Figura 1 Una extensión metafase y una interfase núcleo preparado a partir de cultivos de linfocitos de sangre periférica de un portador de una translocación recíproca entre los brazos cortos de los cromosomas 5 y 9, con puntos de interrupción en 5p14.3 y 9p24.1:. 46, XY, t (5 , 9) (p14.3;. p24.1) ISH t (5; 9) (5ptel48, 9ptel30 +; 9ptel30, 5ptel48 +, 9cen +). Sondas de FISH fueron seleccionados para ambos segmentos translocados (5p14.3 → 5pter, rojo Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, verde Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) y el segmento centrado en el cromosoma 9 (9p24.1 → 9qter, azul Abbott CEP 9 alfa satélite SpectrumAqua).

Figura 2
Señales de la figura 2. Núcleos en interfase blastómero de tres días-embriones capturado utilizando un filtro diferente para cada fluorocromo y se fusionaron para formar una imagen compuesta. (A) dos señales para cada sonda que indica dos copias de cada lugar, lo cual es consistente con un complemento normal o equilibrado de los cromosomas de translocación. (B) Una luz roja, tres señales de color verde y dos señales de color azul indicando una copia del segmento translocado del cromosoma 5, tres copias del segmento translocado del cromosoma 9 y dos copias del segmento centrado del cromosoma 9, lo cual es consistente con la adyacente -1 segregación de la translocación que resulta en un producto desequilibrado con monosomía para 5p14.3 → 5pter y la trisomía para 9p24.1 → 9pter.

Discussion

La aplicación de la hibridación in situ fluorescente (FISH) en una celda de un solo embrión (blastómero) presenta desafíos especiales tanto en los aspectos prácticos y en la interpretación del patrón de la señal. La célula de la biopsia debe ser extendido en un área predefinida en la diapositiva con el fin de facilitar su localización PESCADO siguientes; extremo cuidado se debe tener para garantizar que la célula se lisa, que el citoplasma se ha dispersado, y que el núcleo es visible e intacto, y, como el diagnóstico depende de los resultados de esta célula, puntuación e interpretación estricta directrices se deberían aplicar. Sin embargo, en manos experimentadas, el pescado es una técnica robusta para el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en la práctica clínica. El principio de la DGP por FISH es que se dirigen a sondas de ADN específicas marcadas con fluorocromos diferentes haptenos puede ser utilizado para detectar el número de copias de loci específicos, y por lo tanto para detectar desequilibrio cromosómicas asociadas con la segregación meiótica de redistribución de cromosomas (1), incluyendo robertsoniana translocaciones, translocaciones recíprocas, inversiones y reorganizaciones complejas (2). Los peces también pueden ser utilizados para seleccionar los embriones femeninos en las familias con la enfermedad ligada al cromosoma X, por lo que no hay ninguna prueba de la mutación específica (3, 4). Más polémico, el pescado ha sido utilizada para detectar aneuploidías cromosómicas esporádicas con el fin de tratar de mejorar la eficiencia de la reproducción asistida (5, 6), sin embargo, el valor predictivo de esta prueba con FSIH es probable que sea inaceptablemente bajo en la mayoría de la gente las manos y no se recomienda el uso clínico de rutina (7). Este artículo se centra en los aspectos técnicos y las limitaciones de FISH clínica aplicada a una sola célula diagnóstico.

Los métodos de difusión y fijación de blastómeros independientes, incluyen metanol / ácido acético (5, 8), Tween / HCl (9), y una combinación de Tween / HCl y metanol / ácido acético (10). Las variaciones incluyen el tratamiento hipotónico de las células antes de la difusión y / o la pepsina y el tratamiento de paraformaldehído después de la fijación. El método debe ser validado adecuadamente para el laboratorio (14). El método de interpolación / HCl se describe en detalle en este artículo. El método de interpolación / HCl es técnicamente sencilla y altamente reproducibles en diferentes laboratorios. Este método puede ser utilizado para preparar los núcleos individuales para el diagnóstico FISH de la determinación del sexo y la redistribución de cromosomas con una precisión aceptable de diagnóstico (7).

Mezcla de la sonda puede combinar directamente etiquetados y marcados indirectamente sondas y las sondas de diferentes fabricantes. Sondas para conocer las regiones cromosómicas polimórficos (11, 12), o que se sabe que hibridizan de forma significativa con otros cromosomas (13) se debe evitar, aunque se puede utilizar si se demuestra que ser específico y adecuado para PGD por las pruebas a las dos partes antes de la reproducción . Fluorocromos disponible / haptenos y estrategias para las sondas de la discriminación son los siguientes: Texas Red (TR), isotiocianato de fluoresceína (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, sondas con biotina detectados con TR-avidina, FITC avidina-, o Cy-5 estreptavidina (visualizado usando un filtro FarRed), una mezcla de sondas rojas y verdes para producir una señal amarilla, una segunda ronda de hibridación y un tercer color creado por la captura secuencial de SpectrumOrange con un TexasRed y un filtro de SpectrumGold).

Una sonda conjunto con tres sondas, específicas para las regiones del centrómero de los cromosomas X e Y y un autosoma, se recomienda para la determinación del sexo (14), la sonda autosómico se utiliza para establecer la ploidía y modo de diferenciar entre X trisomía (2n, de 47 años , XXX) y la triploidía (3n, 69, XXX), y entre tetrasomía X (48, XXXX) y tetraploides (4n, 92, XXXX). Una sonda típica situada a aplicar en este contexto es la mezcla AneuVysion Abbott que contengan alfa-satélite X, Y, y 18, este conjunto de la sonda se ha demostrado que tienen una tasa de polimorfismo muy bajo, y por lo tanto el tratamiento previo con el trabajo de los socios de reproducción no es necesario (14).

La mezcla de sondas para cualquier reordenamiento específico debe: Lo ideal sería que contienen sondas al menos suficiente para detectar todos los productos que se espera de la reorganización con desequilibrio cromosómico. Si esto no es posible, la sonda se mezcla en los productos desequilibrada detectados han sido evaluados como no viables en un embarazo reconocible y es probable que tengan una prevalencia muy baja puede ser aceptable (14). Ser probado en cultivos de linfocitos metafases de ambas partes reproductivas. Por lo menos diez se extiende metafase deben ser examinados por la especificidad de la sonda, los polimorfismos y la hibridación cruzada, y, para el transportista reordenamiento cromosómico, para asegurarse de que las sondas de hibridación como se esperaba a los diferentes segmentos de la reordenación. Además, al menos 100 núcleos en interfase de estos preparados debe ser anotado para evaluar la especificidad de la señal, el brillo y discreto (14).

Commercial sonda fija PGS están disponibles (por ejemplo, Abbott MultiVysion PB o PGT), dirigido a los cromosomas más frecuentemente encontrado para ser aneuploides en los productos de la concepción, y que comprende una sola sonda por cromosoma objetivo. Normalmente, el núcleo puede tener una segunda hibridación con sondas para los cromosomas adicionales que proporcionan un análisis de los cromosomas 13, 15, 16, 18, 21, 22, y XY (14). El valor predictivo de esta prueba con la difusión y la técnica de FISH se describe aquí es probable que sea inaceptablemente bajo en las manos de la mayoría de la gente y no se recomienda para el uso clínico de rutina (7, 15).

Técnicas tales como la hibridación genómica comparativa (CGH) aplicada a células individuales son capaces de probar el número de copias de cada cromosoma (Wilton et al. 2001), y el uso de polimorfismos de nucleótido único (SNP) y las matrices de análisis cuantitativo (Wells et al . 2008) o "karyomapping" de genotipado (Handyside et al. 2009) son prometedoras técnicas alternativas para detectar aneuploidías cromosómicas. Sin embargo, el límite de la resolución y la precisión de desequilibrio segmento sigue siendo incierto y es probable que el pescado siguen siendo la técnica de elección para la participación de los reordenamientos cromosómicos en pequeños segmentos.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hydrochloric Acid, 2.5L VWR international 101254H
Sodium Chloride, 5Kg VWR international 443827W
Potassium Chloride, 250g VWR international 26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g VWR international 102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g VWR international 10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g VWR international 28245.265
Tween20, 500mL VWR international 663684B
Ethanol, 2.5L VWR international 8.18760.2500 Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg VWR international 27833.363
Cow Gum, 250mL Cow Proofings Ltd. No longer available Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul Cytocell Ltd. DES500L 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL Boots 10088316001
Amine-coated Slides, 25 Genetix K2615
DAPI, 0.1mL Sigma-Aldrich D-9542
Vectashield, 10mL Vector Laboratories H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL Vector Laboratories A-2016
FITC-avidin, 0.001mL Vector Laboratories A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL GE Healthcare PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 Thistle Scientific AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 Thistle Scientific AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400 Sterilin 128B Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick VWR international 451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes Fisher Scientific PMK-300-052R
Dissecting Microscope Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes NHS SUPPLY CHAIN MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays VWR international 682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece Scientific Laboratory Supplies LTD HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter Fisher Scientific FDM-340-010U
Diamond Pen VWR international 818-0021
Hot Block for Slides Thermo Fisher Scientific, Inc. HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll NHS SUPPLY CHAIN MJT004
Schieferdecker Jar VWR international 631-9313
Coplin Jar VWR international 631-9331
Forceps, Fine VWR international 232-2123
Forceps, Blunt VWR international 232-2113
1000mL Beaker VWR international 213-1642
Phase Contrast Microscope Nikon Instruments E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 Fisher Scientific SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 Scientific Laboratory Supplies LTD MIC3206
1mL Syringe, box of 100 NHS Supply Chain FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 Thistle Scientific AX-T-1000-C-L-R
Incubator LEEC
Waterbath Grant Equipment W22
Alcohol Thermometer Various sources available
pH Meter Jenway 3305
pH Electrode VWR international 662-1759 BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer Bibby HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 Scientific Laboratory Supplies LTD PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m VWR international 291-1214

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References

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Comments

1 Comment

  1. tanks very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:49 AM

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