Name: 세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 학습하세요 수정된 Annexin V/PI 세포 사멸 분석법으로 세포 생물학 연구의 정확성을 높이는 방법을. 포르말데하이드 고정과 RNase A 처리를 통해 기존 방법의 40% 오탐률을 획기적으로 감소시킵니다.

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이 연구는 자연 과학 및 캐나다 (NSERC) 연구 부여 공학 의회와 DRB하는 앨버타 농업 기금 컨소시엄 부여에 의해 지원되었다. AMR은 NSERC 베니 캐나다 대학원 장학금, 앨버타 교육 assistantship와 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금의 대학을 통해 지원됩니다.

이 절차는 500 μL siliconized 튜브 또는 6 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 외과 튜브에서 수행할 수 있습니다. 다른 절차와 함께 생존 분석을 수행하면 후자가 일반적으로 사용됩니다. 주어진 모든 볼륨 6 ML의 폴리스티렌 왕복 하단 외과 튜브위한 것입니다. 500 μL siliconized 튜브의 경우, 1 / 5 모든 볼륨을 줄일 수 있습니다. 유동세포계측법 분석을위한 최적의 농도는 200 μL 볼륨 당 2-4 X 10 6 세포이다. 셀 손실이 절차에서 발생할 수 있습니다 때문에 우리는 각 예제에서는 프로 시저의 시작 부분에 4 X 10 6 세포로 구성하는 것이 좋습니다. 1. 셀 준비 <ol><li> 하베스트 세포는 - 해당 셀 라인 기본 셀 isolations에 대한 구체적인 절차를 참조하십시오. </li><li> 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 2 ML 1 X 인산의 Resuspend 전지 (PBS) 호수 버퍼 - / - (없음 칼슘, 마그네슘 없음). </li><li> 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 1 ML 일 X Annexin V 바인딩을 버퍼에 셀을 Resuspend. </li><li> 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 100 μL 1 X Annexin V 바인딩을 버퍼에 Resuspend 세포. </li></ol> 2. Annexin V / PI의 응용 프로그램 스테인 <ol><li> 제조 업체의 권고에 따라 Annexin V를 추가합니다 [예 : 5 μL Annexin V 알렉사 플루어 488 (분자 프로브, A13201)]. </li><li> 실온에서 15 분 어둠 속에 튜브를 품어. </li><li> 각 반응 관 1 X Annexin V 바인딩 버퍼 100 μL를 추가합니다. 각각의 튜브에 약 200 μL이 있어야합니다. </li><li> 1 X Annexin V 구속력 버퍼 (X Annexin V 구속력 버퍼 9 μL 1 즉, 1 μL PI)에 1시 10분 희석되었습니다 PI 4 μL (시그마, 고양이 # P - 4864 - 10ML)를 추가합니다. 이것은 각각의 샘플 2 μg / ML의 최종 PI 농도를 얻을 수 있습니다. </li><li> 실온에서 15 분 어둠 속에 튜브를 품어. </li><li> 세포를 씻어 500 μL 1 X Annexin V 바인딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 10 분 335 X g에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 500 μL 1 X Annexin V 바인딩 버퍼와 1 %의 포름 알데히드 (정착액) 솔루션을 만들려면 500 μL 2 % 포름 알데히드에 Resuspend 세포. 부드러운 flicking으로 튜브를 섞는다. </li><li> 10 분 얼음에 샘플을 수정. 또한, 샘플은 4 박 저장할 수 있습니다 ° C를 어둠에 약해. 후자의 방법이 선택되면, Annexin V / PI (보상 제어 포함)으로 표시 모든 튜브에 걸쳐 일관되게해야합니다. </li><li> 각 샘플과 flicking에 의해 부드럽게 믹스 - / - 1 ML 1 X PBS를 추가합니다. </li><li> 8 분에 425 X g에서 튜브를 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 단계 2.10와 2.11를 반복합니다. </li><li> 튜브를 flicking하여 Resuspend 펠릿. </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도를 제공 1:100 희석 RNase A (시그마, R4642) 16 μL를 추가합니다. 37 15 분 품어 ° C. </li><li> / - - 1 ML 1 X PBS를 추가하고 flicking으로 가볍게 섞는다. </li><li> 8 분에 425 X g에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 샘플 지금 분석 준비가 된 것입니다. Annexin / PI 염색법 다른 절차를 병렬로 진행되는 경우 또는 샘플이 이후 얼룩 단계에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 거짓 - 긍정적인 PI의 얼룩의 학위를 가지고 다양한 세포 종류와 세포 라인의 예는 그림 1에 표시됩니다. (그림 2B) RNase의 치료 안 세포에 비해, 거짓 - 긍정적인 이벤트의 수가 크게 감소 거짓 - 긍정적인 이벤트에 대한 계정으로, 세포가 수정되었습니다 다음이 결과를 RNase A. 취급. 그림 2C는 RNase 처리 없었다 세포에 비해 RNase 치료를 받았습니다 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 그림 3은 고정 및 RNase 처리 단계를 통해 수정된 Annexin V / PI 프로토콜, 허위 - 긍정적인 얼룩 이벤트의 수를 제한하여 기존 프로토콜에 따라 개선 방법을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 기존 propidium의 요오드화물 얼룩 프로토콜은 거짓 긍정적인 사건의 상당수를 얻으실 수 있습니다. 우리는 이전에 동물 모델의 광범위한 걸쳐뿐만 아니라 세포 라인 10의 다양한 기본 세포를 통해 잘못된 긍정적인 얼룩의 정도를 평가합니다. 대표 이미지는 세 독특한 세포 집단 (- RAW macrophages과 두 가지 기본 세포 - murine 골수 macrophages (BMM)와 금붕어 기본 신장 macrophages (PKM) 1 일반적으로 사용되는 세포주)에서 잘못된 긍정적인 얼룩의 범위를 표시합니다. 진정한 긍정적인 이벤트가 핵 구획 내에서 PI와 DRAQ5 사이의 예상 공동 현지화 (노란색 영역 PI와 DRAQ5 사이 colocalization를 묘사)를 표시합니다. DRAQ5 매우 membra입니다NE 투과 염색되는 살고 죽은 세포 10,11,12 모두 정확하게 얼룩 핵 구획. colocalization DRAQ5보다 쉽게​​ 시각 결정을위한 얼룩은 녹색 pseudocolour을 받았다. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. PI 핵 얼룩의 정확성을 향상. (A) 우리는 DRAQ5을 잘 특징 핵 얼룩의 숫자 (BrdU, 7 - AAD 및 DAPI)의 유사성의 정도에 따라 PI 핵 얼룩의 정확성을 평가. BrdU는 proliferating 세포의 DNA에 통합하고, 같은 오직 핵 구획 내에 착색하는 합성 뉴클레오입니다. 7 - AAD는 손상 플라즈마 막을 통과하지 못하면, PI와 비슷한 높은 DNA에 대한 친화력과을 가지고 있습니다. DAPI는 DNA에 대한 강한 친화력을 가지고 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 핵은 형광 현미경에 얼룩 있습니다. 유사성의 정도가 정확하게 RAW 264.7 macrophages의 세포 핵을 얼룩이 자신의 능력을 강조, BrdU, 7 - AAD, DAPI와 DRAQ5 사이&gt; 99%되었다. 대조적으로, 기존의 프로토콜을 기반으로 세포질 PI의 얼룩은 DRAQ5에 상대적으로 얼룩의 %의 유사성에 표시된 감소로 연결됩니다. murine 골수 macrophages (BMM)와 금붕어 기본 신장 macrophages (PKM) (B)와 마찬가지로 결과는 테스트를 두 가지 기본 세포에서 관찰됩니다. 50 μg / ML RNase 얼룩 절차 내의 특정 단계에서의 결합이 아닌 핵 PI의 얼룩을 제거하고 크게 DRAQ5 얼룩에 상대적 유사성의 정도를 증가시킵니다. (C) 기본 신장 macrophages의 대표 이미지와 RNase 처리없이 세포에 대한 유사성의 정도를 보여줍니다. 트리 트먼트 차이보다 쉽게​​ 시각 결정을위한, DRAQ5는 녹색을 받았다. 노란색 영역은 BrdU와 DRAQ5, 그리고 PI와 DRAQ5 사이 colocalization을 묘사. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 수정 Annexin V / PI 크게 잘못된 apoptosis / 괴사성 이벤트를 줄여줍니다. 기본 금붕어 신장 macrophages (PKM)는 종래와 수정 Annexin V / PI 프로토콜 물들일되었습니다. Scatterplots는 Annexin V / PI는 금붕어 PKM에 얼룩 묘사. 왼쪽 scatterplot는 PKM 세포의 일반적인 Annexin V / PI 염색법을 (NO RNase)를 보여줍니다. 오른쪽 scatterplot은 수정 Annexin V / PI 프로토콜 (RNase)를 물들일 PKM 세포를 보여줍니다. 거짓 긍정적인 얼룩의 제거에 의한 PI의 얼룩이 표시된 감소 RNase 결과뿐만 아니라. PKM 세포 그런 다음 서로 다른 문화 - 초기 progenitors 이내에 인구 (EP), monocytes (모노)와 성숙 macrophages (매트 MAC)를 기반으로 분석했다. 거짓 긍정적인 사건의 제거로 인해 긍정적인 PI 이벤트의 수가 감소가 작은 초기 전구 세포보다 큰 성숙 세포 대식 세포의 세포에 더 많은 발음입니다. 기존의 프로토콜에 따라 결론이 잘못보다 성숙한 대식 세포의 하위 집합에 대한 세포의 죽음에 긍정적인 상관 관계를 제안 것입니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Annexin V / PI 프로토콜 여기서 제시하는 것은 기존 프로토콜의 수정된 버전이며 계정으로 또한 PI에 대한 높은 친화력을 가지고있는 세포질에서 RNA의 존재를 걸립니다. 얼룩 절차 후반 1 %의 포름 알데히드 고정 단계 다음 RNase (50 μg / ML)의 소개 원자력 PI의 얼룩의 정확도를 크게 향상시킵니다. 대한 부정적인 영향은 핵 PI의 얼룩이나 플라즈마 막 Annexin V의 얼룩에서 관찰되지 않습니다. RNase 치료없이 얼룩 PI 결과의 최대 40 %가 하류 결론 10 잠재적으로 중요하고 부정적인 영향에 이르게 거짓 긍정적인 행사로 이어질 수 있습니다. 우리 수정 Annexin V / PI 염색법 프로토콜은 간단하고 세포 유형 (기본 세포의 광범위한 범위에서 효과적으로 사용되었습니다 murine 골수 macrophages 및 splenocytes, 돼지 폐 재류 세포, 폐 폐포 macrophages, mesenteric 림프 노드 격리, 말초 혈액 leukocytes , splenocytes, 닭고기 배반엽 세포, 금붕어 기본 신장 macrophages, 잉어 말초 혈액 leukocytes, 셀 라인 : RAW 264.7 macrophages, Jurkat T 세포, 돼지 3D4/31 macrophages, CCL - 71 금붕어 지느러미 섬유아 세포, 3B11 메기의 B 세포 10). 세포가 differentially 차 전지는 일반적으로 잘못된 긍정적인 이벤트 10 큰 숫자를 가지고와 잘못된 긍정적인 PI의 얼룩에 의해 영향됩니다하는 것이 중요합니다. 이 세포 집단 간의 차이를 거짓 긍정적인 PI의 얼룩은 부분적으로 셀 크기의 차이로 표시될 수 있습니다뿐만 아니라 RNA 내용의 차이에서 발생할 수 있습니다. 이 절차의 예, 결합은 다른 사람 사이에 활용할 실험 시스템, genotoxic 스트레스를 겪고 세포, 세포주기 체포 등 thymidine 또는 hydroxyurea와 같은 약물, virally 감염된 세포 및 발달 진행 배아 세포 연구로 치료 세포에 특히 관련으로 세포 RN​​A 합성의 이산 변화이 특징입니다.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Annexin V 결합 완충액</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 내 1 mg/mL</td></tr><tr><td>2% Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장 유래 RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td>1 x PBS-/-로 1:60 희석</td></tr></tbody></table>

세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 annexin v / propidium 이우의 apoptosis 분석

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

세포 apoptosis의 연구는 크게 흐름 cytometry 기반 방법의 도입 이후 영향되었습니다. Propidium 요오드화물의 (PI)가 널리 세포가 플라즈마 막 무결성 및 투자율의 1,2의 차이를 통해 가능한, apoptotic 또는 괴사성 있는지 확인하기 위해 Annexin V와 함께 사용됩니다. Annexin V / PI 프로토콜은 apoptotic 세포에게 3 공부를 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그것이 세포가 4,5 생활 염료를 제외하기 위해 능력을 바탕으로, 경제적 안정과 세포 생존의 좋은 지표이기 때문에 PI는 더 자주 다른 핵 얼룩보다 사용됩니다. 셀 입력 PI의 능력은 막의 투자율에 의존적일 수, PI는 손상 플라즈마 막 1,2,6의 존재로 인해 거주하거나 초기 apoptotic 세포를 얼룩이되지 않습니다. 늦은 apoptotic 및 괴사성 세포에서 플라즈마와 핵 세포막의 무결성은 PI가 세포막을 통과 핵산에 사이에 끼어 넣다, 붉은 형광 1,2,9을 표시할 수 있도록, 7,8을 감소시킵니다. 불행히도, 우리는 그런 기존 Annexin V / PI 프로토콜은 세포질 구획 10 시간 RNA의 PI의 얼룩과 관련된 잘못된 긍정적인 사건의 상당수 (최대 40 %)에 리드 찾습니다. 가장 높은 발생 10보기 : (세포질 비율 &lt;0.5 핵) 기본 세포와 동물 모델의 광범위한 셀 라인은 큰 세포와 영향을받습니다. 여기에, 우리는 기존의 방법에 비해 세포 죽음의 평가에 대한 상당한 개선을 제공하는 수정 Annexin V / PI 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다음과 같은 얼룩 세포에 RNase의 진입을 촉진하기 위해 고정 셀 동안 세포 투과성의 변화에​​ 활용합니다. 타이밍 및 RNase의 농도 모두 세포질 RNA의 제거를 위해 최적화되었습니다. 그 결과 종래의 Annexin V / PI 프로토콜 (세포질 PI의 얼룩과 &lt;5 % 이벤트)을 통해 상당한 개선이다.

세포 죽음의 평가에 대한 정확한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 세포 라인과 동물 모델의 광범위한 범위에서 기본 세포 40 % 허위 - 긍정적인 이벤트까지 표시 기존 Annexin V / propidium 요오드화물 (PI) 프로토콜에 따라이 향상됩니다.

세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석

세포 사멸(apoptosis) 연구는 유세포 분석 기반 방법론의 도입 이후 상당한 영향을 받았습니다. 프로피듐 요오다이드(Propidium iodide, PI)는 널리...

본 실험의 전반적인 목적은 세포 사멸(apoptosis) 및/또는 괴사(necrosis)에 의한 세포 사멸 평가를 위한 기존의 Annexin five 및 Propidium iodide 염색 기술의 현재 문제점들을 극복하는 것입니다. 연구 결과, 광범위한 세포주 및 일차 세포에 대한 기존의 염색 방식은 최대 40%의 위양성 사건을 초래하는 것으로 나타났습니다. 이러한 위양성 사건은 세포질 RNA의 염색으로 인해 발생합니다.반대로, 본 프로토콜은 염색 과정의 특정 단계에 고정 및 RNA 분해 단계를 도입함으로써 위양성 발생 빈도를 획기적으로 줄입니다. 염색 과정에서는 먼저 일반적인 절차에 따라 세포 사멸을 감지하기 위해 cells를 Annexin V와 propidium iodide로 염색합니다. 그다음, 1% formaldehyde로 cells를 고정하여 세포막의 투과성을 높입니다. 마지막으로, 고정된 cells를 RNase A로 처리하여 세포질 RNA를 분해함으로써 위양성을 유발하는 propidium iodide 염색을 제거합니다.많은 세포 생물학자들과 마찬가지로, 당사에서도 세포 사멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis)를 검출하기 위해 기존의 nexin five 및 propidium iodide 유세포 분석법을 사용해 왔습니다. 그러나 최근 여러 세포주와 일차 세포에서 이 방법이 최대 40%에 이르는 상당한 수의 위양성 결과를 초래한다는 것을 발견하였습니다. 본 업데이트된 방법은 이러한 한계점들을 극복하였습니다.본 방법은 절차 전반의 특정 단계에서 세포 고정과 RNA 소화를 활용하여, 이러한 위양성 결과의 직접적인 원인이 되는 세포질 RNA를 선택적으로 제거합니다. 실험 분석에 사용할 세포를 수확하십시오. 본 영상에서는 생쥐 대식세포를 사용합니다. 예시로, 샘플을 4°C에서 335 Gs로 10분 동안 원심 분리하고, 상층액을 따라낸 후 세포를 2 mL의 1X PBS에 다시 현탁하십시오.그 다음, 동일한 조건에서 세포를 다시 세척합니다. 이번에는 1 X NX and five binding buffer 1 mL에 세포를 재부유시킵니다. 샘플을 원심 분리하고 상층액을 따라낸 후, 1 X NX Xin five binding buffer 100 µL의 최종 부피로 세포를 다시 재부유시킵니다.제조사의 권장 사항에 따라 각 세포 샘플에 Xin five를 추가하십시오. 예를 들어, 이 영상에서는 각 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 2.5 µL의 Xin five zi를 추가하고 있습니다. 튜브를 실온의 암소에서 15분 동안 배양하십시오.그 다음, 각 반응 튜브에 1X NX in five binding buffer 100 µL를 추가합니다. 이제 각 튜브에는 약 200 µL의 용액이 들어있어야 합니다. 다음으로, 1X NX in five binding buffer를 사용하여 propidium iodide(PI)를 1:10으로 희석하여 준비합니다. 희석된 PI 4 µL를 각 튜브에 추가하여, 각 샘플의 최종 PI 농도가 2 µg/mL가 되도록 합니다.튜브를 다시 상온의 암소에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 500 µL의 1X NX-5 결합 버퍼로 세포를 세척하고, 4 °C에서 335 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 세포를 500 µL의 1X NX-5 결합 버퍼와 500 µL의 2% formaldehyde에 다시 현탁합니다.1% formaldehyde 용액을 제조하려면 튜브를 가볍게 튕겨 섞어줍니다. 고정 후 샘플을 얼음 위에서 10분 동안 고정합니다. 각 샘플에 1x PBS 1 mL를 첨가하고 가볍게 튕겨 섞어준 뒤, 세척 과정 동안 4°C에서 425 ×g로 8분간 세 차례 세포를 원심분리합니다.1X PBS에서 RNA A를 1:100로 희석하여 준비하고, 튜브를 가볍게 튕겨 펠렛을 재현탁한 후, 희석된 RNA A 용액 16 µL를 첨가하여 최종 농도가 50 µg/mL가 되도록 합니다. 그 다음, 샘플을 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 이어서, 1 mL의 1X PBS로 세포를 세척하고 튜브를 가볍게 튕겨 부드럽게 혼합한 뒤, 4 °C에서 425 ×g로 8분 동안 원심분리합니다.이제 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 또는 N-X-M-P-I 염색을 다른 절차와 병행하여 수행하는 경우, 샘플을 후속 염색 단계에 사용할 수 있습니다. 대표적인 이미지 스트림 유세포 분석기 이미지는 세 가지 고유한 세포 집단에서 나타나는 위양성 염색의 정도를 보여줍니다.흔히 사용되는 RAW macrophage 세포주 하나와 골수 macrophage 및 금붕어 일차 신장 macrophage를 모사한 두 가지 일차 세포주를 사용하였습니다. 금붕어 일차 macrophage의 사용은 다양한 세포 플랫폼 전반에 걸쳐 이 기술의 적용 가능성을 강조합니다. 진양성 이벤트에서는 핵 구획 내에서 PI와 drac 사이의 예상되는 공국소화가 나타납니다.PI는 노란색 염색으로 확인되는 바와 같이 살아있는 세포와 죽은 세포의 핵 구획을 정확하게 염색하는 막 투과성이 매우 높은 염료입니다. 본 연구에서는 D dr five BRDU seven A.A D DPI 및 DRAC five와 비교하여 PI 핵 염색의 정확도를 유사도 정도로 평가하였습니다. RAW 264.7 대식세포 세포주에서 DPI 및 DRAC five는 핵을 정확하게 염색하는 능력에 있어 99% 이상의 유사도를 나타냈습니다. 반면, 기존 프로토콜을 사용할 때 발생하는 세포질 PI 염색은 d dr five 대비 핵 염색 유사도 백분율의 현저한 감소를 초래하였습니다.이 그림에서 50 µg/mL RNase A를 첨가하면 핵 이외의 PI 염색이 제거되며, murn, 골수 대식세포 및 금붕어 일차 신장 대식세포에서 ddr5 염색 대비 유사도가 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 그림의 일차 신장 대식세포 대표 이미지는 RNase A 처리 시 세포질 구획의 RNA 염색이 소실됨을 보여줍니다. 금붕어 일차 신장 대식세포의 이러한 산점도는 수정된 nexin PI 프로토콜로 준비된 세포에서 위양성 세포사멸 및 괴사 사건이 유의하게 감소했음을 보여줍니다.새로운 프로토콜에 따르면 세포의 84.9%가 생존해 있는 것으로 나타났습니다. 게이트는 형광 및 형태학적 특성을 평가하는 병렬 이미지 스트림 샘플을 기반으로 설정되었습니다. 한 예시에서, 초기 전구체 단핵구와 성숙한 대식세포를 이 비디오에서 설명한 수정된 NX in five PI 프로토콜 또는 이 그림의 기존 방법으로 염색했습니다. 수정된 프로토콜로 염색된 세포는 RNase 처리를 통해 위양성 이벤트가 제거됨에 따라 PI 양성 이벤트 수가 시각적으로 감소한 것을 보여주었습니다.또한, 이러한 효과는 크기가 작은 초기 전구 세포보다 크고 성숙한 대식세포에서 더 두드러지게 나타났습니다. 기존 프로토콜에 기반한 결론은 더 성숙한 대식세포 하위 집합에서 세포 사멸의 양의 상관관계가 있다는 잘못된 시사점을 주었을 것입니다. 이 염색 절차 이후에는 세포 분리물 내의 하위 집단에 관한 특정 질문에 답하기 위해 세포 내 또는 표면 염색과 같은 추가 단계를 수행할 수 있습니다. 이 기술의 관련성은 면역학적 질문을 넘어, 예를 들어 유전독성 스트레스를 겪는 세포, 세포 주기 억제제(thymidine 또는 hydroxyurea와 같은 약물) 처리 세포를 이용하는 실험 시스템, 그리고 세포 RNA 합성의 불연속적인 변화로 발달 과정이 특징지어지는 배아 세포 연구에도 적용 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

이 비디오에서는 형광 Annexin V 염색을 사용하여 적혈구 프로그래밍된 세포 사멸의 정도를 측정하기 위한 Annexin V 결합 분석을 시연합니다. 세포사멸 적혈구는 세포막의 내부에서 외부 소엽으로 포스파티딜세린 전좌를 보여주며, 이로 인해 형광단 태그가 지정된 Annexin V가 전좌된 포스파티딜세린에 결합하여 형광 신호를 방출합니다.

Annexin V 결합 분석: 포스파티딜세린 라벨링을 통해 세포사멸 적혈구를 식별하는 형광 기반 기술

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

교류 cytometry 또는 차등 원심 분리를 사용 하 여 워크플로 검색, 계량 및 apoptotic 시체는 apoptotic 샘플 고 순도 분리 개발 된다.

검색 및 Apoptotic 몸 높은 순도 절연

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

아폽토시스는 초기 및 후기 아폽토시스 바이오마커의 유세포 분석에 의해 특성화될 수 있다. 자궁경부암 세포주인 SiHa는 벤치탑 유세포 분석기를 사용하여 Actinomycin D로 처리한 후 세포자멸사 바이오마커를 분석했습니다.

Actinomycin D-Treated SiHa 자궁경부암 세포에서 세포사멸 바이오마커의 유세포 분석

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

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Pyrosequencing은 (R) polymorphisms을 분석하는 데 사용 날짜에 가장 철저한 아직 간단한 방법 중 하나입니다. 이 방법은 많은 임상 관련 polymorphisms을 포함하여 신속하고 효율적인 단일 염기 다형성 평가되었다. Pyrosequencing의 기술과 방법론을 설명합니다.

Pyrosequencing : 정확한 Genotyping을위한 간단한 방법

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세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석

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