Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Medicine

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps i medvetna, sidostagade Möss

1, 2,3, 3, 2,3, 3, 4, 2,3, 2,3

1Diabetes and Obesity Research Center, Sanford-Burnham Medical Research Institute at Lake Nona, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Department of Pediatrics and Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE
     

    Summary

    Den hyperinsulinemic-euglycemic klämma, eller insulin clamp, är den gyllene standarden för bedömning av insulin åtgärder

    Date Published: 11/16/2011, Issue 57; doi: 10.3791/3188

    Cite this Article

    Ayala, J. E., Bracy, D. P., Malabanan, C., James, F. D., Ansari, T., Fueger, P. T., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice. J. Vis. Exp. (57), e3188, doi:10.3791/3188 (2011).

    Abstract

    Typ 2-diabetes kännetecknas av en defekt i insulin åtgärder. Den hyperinsulinemic-euglycemic klämma, eller insulin clamp, anses allmänt vara den "gyllene standarden" metod för bedömning av insulin åtgärder in vivo. Under ett insulin klämma är hyperinsulinemi uppnås genom en konstant infusion av insulin. Euglycemia förs via en samtidig glukos infusion med en rörlig ränta. Denna variabel glukos infusionshastigheten (GIR) bestäms genom att mäta blodsocker med korta mellanrum under hela försöksperioden och justera GIR därefter. Den GIR är ett tecken på hela kroppen insulinaktivitet som möss med ökad insulin åtgärder kräver en större GIR. Insulinet clamp kan innehålla tillförsel av isotop 2 [14 C] deoxyglucose att bedöma vävnadsspecifika glukosupptag och [3 - 3 H] glukos för att bedöma förmågan hos insulin för att dämpa takten av endogent glukos utseende (Endora), en markör för leverns produktion av glukos, samt att stimuleragraden av hela kroppen glukos försvinnande (Rd).

    Miniatyrisering av insulin klämma för användning i genetisk musmodeller av metabola sjukdomar har lett till betydande framsteg inom diabetesforskning. Metoder för insulin klämmor variera mellan laboratorier. Det är viktigt att notera att det sätt på vilket ett insulin klämma utförs signifikant kan påverka resultaten. Vi har publicerat en omfattande utvärdering av olika sätt att utföra insulin klämmor i medveten möss 1 samt en utvärdering av den metabola respons fyra vanligaste inavlade musstammar med olika klämma tekniker 2. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra insulin klämmor på medvetna, ohämmad möss som utvecklats av Vanderbilt Mouse Metabola Fenotypning Center (MMPC, URL: www.mc.vanderbilt.edu / mmpc). Detta inkluderar en beskrivning av metoden för implantering katetrar som används under insulin klämman. Protokollet anställd avVanderbilt MMPC använder en unik två-katetersystem 3. En kateter sätts in i halsvenen för infusioner. En andra kateter sätts in i halspulsådern, vilket möjliggör blodprovstagning utan att behöva begränsa eller hantera musen. Denna teknik ger en betydande fördel att den vanligaste metoden för att få blodprov insulin klämmor som är att prov från den avhuggna spetsen av svansen. Till skillnad från den senare metoden, provtagning från en arteriell kateter är inte stressande att musen 1. Vi beskriver även metoder för att använda isotopiska spårämne infusioner för att bedöma vävnadsspecifika insulin åtgärder. Vi ger också riktlinjer för lämplig presentation av resultat från insulin klämmor.

    Protocol

    1. Beredning av katetrar och mus Antenn för provtagning Access (MASA tm)

    1. Förbered arteriell kateter genom att sätta en 1,3 cm bit av PE-10 (0,011 tum innerdiameter) till en 6 cm bit silastic slang (0,012 tum innerdiameter) som visas i Figur 1A. Bevel spetsen av PE-10 med en skalpell så längden från slutet av silastic till toppen av avfasning är 0,9 cm.
    2. Förbered venkateter genom att skjuta en 1 mm bit silastic slang (0,020 tum innerdiameter) 1,1 cm från avfasade änden av en 6 cm bit silastic slang (0,012 tum innerdiameter) som visas i figur 1B. Den 1 mm bit silastic används som en återhållande pärla.
    3. Att förbereda ett MASA tm, sätter vardera av två 1,3 cm bitar 25 gauge rostfritt stål kontakterna i vardera av två 3 cm bitar av PE-20 (0,015 tum innerdiameter).
    4. Säkra PE-20/connectors till varandra genom att skjuta en 5 mm bit silasticslang (0,040 tum innerdiameter) över det område där stålrör och PE-20 möts.
    5. Böj stålrör till en ~ 120 ° vinkel och separera varje rör med ~ 45 °.
    6. Placera färdig rigg i en klick av medicinsk silikon lim så att PE-20 slangar är vertikal och ändarna av rostfria rör sträcker sig utanför lim (Figur 1C). Låt denna för att ställa till 24h.

    2. Kirurgiska kateterisering

    1. Före operation, sterilisera katetrar med 70% etanol, fylla dem med hepariniserat koksaltlösning (200 E heparin / ml koksaltlösning) och sätta rostfritt stål pluggar.
    2. Bedöva mus, helst med en metod som kontinuerligt levererar anestesimedel (t.ex. inandning isofluran).
    3. Användning av steril teknik, ta bort hår från snittet webbplatser som använder Clippers och / eller en hårborttagningskräm och desinficera huden med alkohol följt av en Betadine scrub. För katetrar, ta bort hår påregion som sträcker sig från underkäken till toppen av bröstkorgen och mellan nyckelbenen. För utläggning av katetrar bakom huvudet, ta bort hår i området mellan skallbasen och interscapular regionen och desinficera huden med alkohol följt av en Betadine scrub.
    4. Lägg musen på rygg på en värmande yta och under visningsområdet för en kirurgisk mikroskop. Fäst svansen och extremiteter med kirurgisk tejp. Fäst huvudet i noskonen leverera anestesi.
    5. Gör en liten vertikal mittlinjen snitt 5 mm cefaliska till bröstbenet. Använd pincett, trubbig dissekera vävnaden att exponera vänster sternocleidomastoideus muskeln. Reflektera denna muskel för att avslöja vänster halspulsådern. Försiktigt retas av bindväv från artär. Det är viktigt att i detta skede att isolera vagusnerven från artären utan att skada vare sig artär eller nerv.
    6. Isolera artär och ligate i cefaliska slutet med silke sutur. Löst knut annanbit sutur på caudal slutet av utsatta fartyget.
    7. Klämma fartyg med en mikro-serrefine klämma på den bakre änden och snitt strax under knyts ihop änden med våren sax. Sätt försiktigt in katetern så långt som till klämman. Försiktigt släpper mikro-serrefine klämma och föra katetern till silastic-PE korsning.
    8. Tie både ligaturer ordentligt i katetern och kontrollera att katetern proverna genom att ansluta den fria änden av katetern till en provtagning spruta.
    9. Gör en snitt 5 mm till höger om mittlinjen och ca 2 mm caudal till det första snittet. Använd pincett, trubbig dissekera vävnaden att exponera och isolera den högra halspulsåder.
    10. Försiktigt ligate i cefaliska slutet med silke sutur och löst knyt en annan bit av sutur vid stjärtfenan slutet.
    11. Snitt strax under cefaliska ligatur med fjäder sax och föra in katetern upp till den återhållande pärla. Knyt en sutur bakom pärla och bekräfta att katetern prover.
    12. TuRN musen över och göra ett litet snitt mellan skulderbladen.
    13. Tunnel en 14-gauge nål under huden från snittet för arteriell kateter, på framsidan av musen, till interscapular snitt på baksidan. Trä arteriell kateter genom nålen till exteriorize det på baksidan av musen. Upprepa detta för halsvenen kateter av tunnling den 14-gauge nål under huden på höger sida av musen från snittet plats på framsidan till interscapular snitt på baksidan.
    14. Kläm fast arteriell kateter med en mikro-serrefine klämma på snittet plats mellan skulderbladen. Skär katetern ~ 1 cm ovanför denna klämma. Placera MASA tm med rostfria kontakterna vända mot huvudet av musen. Anslut arteriell kateter i rostfritt stål kontakten pekade mot den vänstra sidan av musen. Var noga med att det inte finns några hål eller veck på katetern. Upprepa för venkateter,ansluter den till rostfritt stål kontakten vänd mot höger sida av musen.
    15. Sätt MASA tm i snittet mellan skulderbladen. PE-20 slang motsvarande halsvenen katetern bör vara på höger sida av musen och PE-20 slang motsvarande arteriell kateter bör till vänster.
    16. Stäng ventrala och dorsala snitt med nylon sutur. För rygg stängning kan sutur köras genom härdade silikon av MASA tm för att säkra det på plats. Bekräfta öppetståendet av katetrar med en spolning lösning innehållande hepariniserade koksaltlösning och ett antibiotikum att minimera risken för infektion. Placera musen i en varm, ren bur för omedelbar återhämtning. Figur 2 visar den färdiga produkten.
    17. Låt musen för att återhämta sig i minst 5 dagar. Övervaka vikt och allmänna hälsa. Utnyttja lämpliga postoperativa smärtstillande behandling som godkänts av institutionens Animal Care ochAnvänd kommittén.

    3. Hyperinsulinemic-euglycemic klämma

    1. Snabb musen för 5-6h. Som referens hänvisar tiden t = 0 min till slutet av den snabba och början av insulin och glukos infusion (dvs klämma perioden).
    2. Installationen och tidsplan för ett typiskt experiment visas i figur 3. Använd Micro-Renathane eller motsvarande slang för infusion och linjer provtagning. Häng en dual-channel svivel ovanför musen. Detta fungerar som ett nav mellan musen och infusion / provtagning sprutor. Under experimentet är musen i ett hem bur eller liknande behållare och är bundna till den vridbara.
    3. Innan du ansluter musen, fyll arteriell provtagning linje med hepariniserat koksaltlösning (10 E heparin / ml koksalt) och placera en rostfri kontakten i botten slutet av raden. Lämna en spruta med hepariniserat koksaltlösning (clearing spruta) ansluten till toppen av provtagningsledningen. Detta kommer att användas för att dra upp blod provtagning och analyserles.
    4. Fyll raden venös infusion med icke-hepariniserad koksaltlösning början från infusionen hamnen i det vridbara (Segment A i figur 3A) hela vägen till botten av linjen. Anslut den övre änden av linjen och placera en rostfri kontakt (eller en Y-koppling om en bolus ska ges) i änden av linjen. Om en isotopisk glukos spårämne (t.ex. [3 - 3 H] glukos) är infunderas, säkert en 1 ml spruta med spårämne som en infusion spruta. Fyll linje venös infusion med spårljus istället för saltlösning (Figur 3B).
    5. Tre timmar in i snabbt, väger musen och anslut PE-20 för halsvenen och arteriella katetrar med infusionen och linjer provtagning, respektive.
    6. Om administrering av [3 - 3 H] glukos spårämne, börjar en primas-kontinuerlig spårämne infusion vid t = -90 min (figur 3C). En typisk dosen är 1 μCi. Förbered en 0,05 μCi / l [3 - 3 H] glukos Våra produktern i icke-hepariniserade koksaltlösning. Ladda lösningen i en 1 ml spruta och säkra sprutan i en infusionspump. Administrera dosen genom att ingjuta 20 l / min i 1 min. Följ med en kontinuerlig infusion av 0,05 μCi / min (1 ml / min) för en 90 min jämvikt period.
    7. Förbered infunderade lösningarna av insulin och glukos. Insulin är upprättad i icke-hepariniserade saltlösning som innehåller 3% plasma som bärare (en lämplig koncentration av BSA kan också användas). Glukos infunderade lösningarna finns kommersiellt tillgängliga i olika koncentrationer (5, 20 och 50%).
    8. Förbered saltlösning-tvättad erythorocyte infusate genom att få blod från en givare mus, helst av samma stam bakgrund som den experimentella musen. Typiskt 1 ml helblod behövs per undersökning mus. Centrifugera blodet att separera erytrocyter. Tvätta erytrocyterna med 10 U / ml hepariniserade koksaltlösning och centrifugera att göra sig av saltlösning. Bestäm volymen av erytrocyterna och återsuspendera i en lika stor volym av 10 U / ml hepariredovisas koksaltlösning.
    9. Rita varje infusate i en 1 ml spruta och säker varje spruta till en enskild infusionspump. Anslut varje spruta till en 4-vägs kontakt (Figur 3).
    10. Vid t = -15 min ta ett blodprov genom att långsamt utarbeta 50-100 ìl av blod i clearing sprutan. Kläm fast arteriell provtagningsledningen och ta bort clearing sprutan. Med hjälp av en handhållen mätare, ta en läsning blodsocker genom att ta bort klämman på arteriella provtagningsledningen och så att blodet kan flöda in i blodsockermätare remsan.
    11. När glukos mätningen tas, klämma den arteriella provtagningsledningen och infoga en trubbig nål spruta (provtagning spruta) i den arteriella provtagningsledningen. Ta bort klämman och dra en mängd blod (se not) i provtagning sprutan. Kläm fast arteriell provtagningsledningen och ta bort provtagning sprutan. Sätt clearing sprutan tillbaka in i arteriella provtagningsledningen. Dra upp i kolven för att avlägsna eventuella luftbubblor och åter ingjuta50-100 l blod som ursprungligen gjordes.

    Obs: Volymen av samplade blod beror på en analys som utförs. Till exempel, analys av [3 - 3 H] krävs glukoskoncentration 10 ìl av plasma, så 50 l blod dras. Detta ger 20-30 l av plasma, vilket är tillräckligt för analysen plus ytterligare plasma om det behövs. Mätningar av hormoner och andra metaboliter (t.ex. insulin, fria fettsyror) kräva provtagning av ytterligare blod.

    1. Fördela blodet i provtagning sprutan i ett EDTA-belagda mikrorör. Centrifugera och samla in plasma. Håll plasma på is fram till slutet av studien eller omedelbart förvaras vid -20 ° C.
    2. Upprepa steg 3,10 till 3,12 vid t = -5 min. Få ytterligare blod (50 l) för mätning av insulin baslinjen plasmanivåer. Mät baslinjen hematokrit genom att dra blod i ett heparin-eller EDTA-behandlade kapillärrör. De mätningar som erhålls frOm plasmaprov vid t = -15 och -5 min representera baslinjen (dvs. fasta) värden.
    3. Efter provet vid t = -5 min, fyll infusionen linjer för glukos, insulin och saltlösning-tvättade erytrocyter upp till 4-vägs kontakt. Anslut den 4-vägs koppling till slangen ansluten till svängbara infusionen porten (eller slangen ansluts till Y-koppling om infusion [3 - 3 H] glukos) som visas i Figur 3.
    4. Börja infusing saltlösning-tvättade erytrocyter först. Ange infusionshastigheten för att ersätta den totala volymen av blod samlats upp under hela studietiden (t.ex. om totalt 500 l blod samplas över 120 minuter av studien, ställ in infusionshastigheten till 4,2 l / min). I motsats till andra infunderade lösningarna är erytrocyt lösningen röd. Infusion här lösningen först möjliggör eventuella motstånd eller hinder i infusionen linjer identifieras och korrigeras.
    5. När erytrocyt infusate når musen börja insulin ochglukos infusioner. Detta är nu t = 0 min. Insulin är infunderas med en konstant, förutbestämd ränta. En infusion av insulin på 4 mU • kg -1 • min -1 normalt undertrycka endogen produktion av glukos genom 80-100% och stimulera glukos försvinnande med 2-3 gånger. Den initiala glukos infusionshastigheten (GIR) är beräknad utifrån baslinjen blodsockernivåer och tidigare erfarenheter.
    6. Om infusion [3 - 3 H] glukos kan man välja att öka spårämne infusionshastigheten för att matcha den uppskattade ökningen av glukos omsättning (vanligtvis en 2-3 faldig ökning).
    7. Med tanke på den höga glukos omsättning i musen, skall blodprov från den arteriella inte mindre än var 10 min för mätning av glukos koncentrationen under hela experimentet. Justera GIR att uppnå och bibehålla mål euglycemia (figur 3C). Detta mål kan variera beroende på modell och syftet med studien. Ett bra mål glucose koncentrationen är 150 mg • DL-1 eftersom detta är en typisk 6h fastande glukos nivå för en chow-fed C57Bl/6J mus.
    8. Målet är att uppnå euglycemia snabbt, helst inom de första 40-50 min, och att ha glukos och GIR stabil i början av steady-state perioden (t = 80 min).
    9. Om infusion [3 - 3 H] glukos, få ytterligare blod vid t = 80, 90, 100, 110 och 120 min för mätning av plasma [3 - 3 H] glukos specifik aktivitet.
    10. Samla ytterligare blodprover vid t = 100 och 120 min för mätning av plasma insulin och andra hormon (er) eller metabolit (er). Vid t = 110 min, dra blod in i en heparin-eller EDTA-behandlade kapillärrör för mätning av klämma hematokrit.
    11. Efter provet vid t = 120 minuter tas, 2 [14 C] deoxyglucose kan ges för mätning av vävnads-specifika glukosupptaget. Administrera ett 12 μCi bolus i bolus linjen ansluten till våldsam attack provtagningsledningen (Figur 3B
    12. Skaffa blodprov (50 l) från den arteriella provtagningsledningen vid t = 2, 15, 25 och 35 minuter efter administrering av bolus för mätning av plasma-2 [14 C] deoxyglucose nivåer.
    13. Efter det sista provet, söva musen med en infusion av pentobarbital ges direkt i den arteriella linjen. Snabbt dissekera vävnader som behövs för bedömning av glukosupptag (t.ex. skelettmuskler av olika slag, fettvävnad, hjärta, hjärna) och alla andra vävnader (t.ex. lever, mjälte, njurar). Snap frysa vävnad i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C tills analyseras. Tissue glukos analyseras genom att mäta ansamling av fosforyleras 2 [14 C] deoxyglucose i den frusna vävnader och försvinnandet av 2 [14 C] deoxyglucose från plasman.

    4. Representativa resultat

    Ett exempel på resultat från ett insulin klämma experiment visas i Figur 4.Detta exempel visar på möjligheten för en fettrik diet för att framkalla insulinresistens hos möss. Alla presentationer av resultat insulin klämma måste innehålla följande vara tolkningsbara: en tidsperiod av blodsockernivåerna, en tid under GIR och plasma insulinnivåer (baseline och klämma). Som visas här, fasteglukos (Figur 4A) och insulin (Figur 4C) är högre hos möss som utfodrats en fettrik kost, ett tecken på insulinresistens. Presentera en tidsperiod av glukos nivåer i hela klämman studien (Figur 4A) gör det möjligt för läsaren att bedöma hur väl euglycemia bibehölls, vilket tyder på kvaliteten på klämman. Likaså kan en gång under GIR (Figur 4B) läsaren att avgöra hur snabbt en steady-state uppnåddes. Visar dessa uppgifter så tidsförlopp är betydligt mer informativ än de konventionella metoder i musen insulin klämma litteratur att presentera en 2-timmars experimentsom ett enda datum punkt utgör medelvärden från en odefinierad "klämma" period (4-13). I det aktuella exemplet var glukosnivåer lika mellan kontroll och hög fett-matade grupper, men GIR var signifikant lägre i hög fett-fed-gruppen (Figur 4B). Detta är en indikation på en nedskrivning i hela kroppen insulin åtgärder. Clamp insulinnivåer var också högre i högt fettinnehåll matad gruppen (Figur 4C), ytterligare stöder förekomsten av en insulinresistenta fenotypen hos dessa möss. Användningen av isotopiska spårämne infusioner gör för bedömning av insulin åtgärder i specifika vävnader. [3 - 3 H] glukos används för att uppskatta graden av endogent glukos utseende (Endora), som är ett index av leverns produktion av glukos (HGP) och priset för hela kroppen glukos försvinnande (Rd). I insulin helt undertrycker HGP kontroll möss, detta är nedsatt hos möss som utfodrats en fettrik kost (Figur 4D). Likaså möjligheten för iSulin att stimulera Rd kontroll möss äventyras hos möss som utfodrats en fettrik kost (Figur 4E). 2 [14 C] deoxyglucose används för att bedöma indexet glukos metabola (RG), ett mått på vävnadsspecifika glukosupptag. Som framgår av detta exempel är insulin-stimulerad glukosupptag i skelettmuskulaturen försämras hos möss som utfodrats en fettrik kost (Figur 4F).

    Figur 1
    Figur 1: Förberedelse av arteriella (A) och (B) venkatetrar och (C) MASA TM. Arteriella katetrar bereds genom att sätta in en 1,3 cm bit av PE-10 ca 3 mm i en 6 cm bit av 0,012 "ID silastic. PE-10 tips är avfasade så att längden från avfasningen till silastic är 0,9 cm. Venös katetrar görs genom att skjuta en liten bit 0,020 "ID silastic 1,1 cm från avfasade änden av en 6 cm bit av 0,012" ID silastic. Den 0,020 "ID silastic bit fungerar som en återhållande pärla för att se bota katetern till halspulsåder. För montering av MASA TM, var och en av två 1,3 cm 25-gauge-kontakter sitter i vardera av två 3 cm bitar av PE-20. Dessa hålls samman av en liten bit 0,040 "ID silastic. Anslutningarna är böjda att en 120 ° vinkel och separeras i 45 ° vinkel. Hela församlingen är nedsänkt i medicinsk silikon lim.

    Figur 2
    Figur 2: kateter mus. Katetrar är inopererade i vänster halspulsådern och den högra halspulsåder. De fria ändarna av katetrar är externaliserats bakom huvudet och ansluts till en MASA TM. Den MASA tm sätts in subkutant mellan skulderbladen. Detta möjliggör för vaskulär access under experiment insulin klämma utan att behöva hålla tillbaka, hantera eller söva musen.

    jpg "/>
    Figur 3: Avbildningar av installationen och tidsplan för ett insulin klämma experiment. Musen är bundna till en dual-channel svivel som fungerar som ett nav för infusion och sprutor provtagning. Typiska inställningar för experiment inte använda spårämne infusioner (A) och med hjälp av både [3 - 3 H] glukos och 2 [14 C] deoxyglucose (B) visas. En tidslinje av förfarandena för att inrätta och utföra insulin klämma (C) visas också. Under klämma, blodprov ( blod ) Tas varje 10 min för att mäta blodsocker. Den GIR är justeras för att bibehålla euglycemia. Prover för baslinjen blodsocker, plasma insulin, och plasma [3 - 3 H] glukos tas vid t = -15 och -5 min. Prover för klämma plasma [3 - 3 H] glukos tas vid t = 80, 90, 100, 110 och 120 samt klämma insulin vid t = 100 och 120 min. 2 [14 C] deoxyglucose ges efter provet vid t = 120 min och BLood samlas vid t = 2, 15, 25 och 35 minuter efter. Vävnader vidtas efter det att t = 35 min prov.

    Figur 4
    Figur 4: Resultat från en insulin klämma experiment jämförde möss på en kontroll diet (Chow) till möss på fettrik diet (HFD). Tid under arteriell glukos (A) och GIR (B), baslinje och klämma insulin (C), Endora (D) och Rd (E) och skelettmuskulatur (gastrocnemius och vastus lateralis) RG (F) visas. Alla resultat visar effekten av fettrik mat att framkalla insulinresistens.

    Discussion

    Den hyperinsulinemic-euglycemic klämma, eller insulin clamp, anses allmänt vara den "gyllene standarden" metod för bedömning av insulin åtgärder in vivo. Denna teknik har tillämpats på flera arter inklusive människor, hundar, råttor och möss. Med tanke på det växande antalet transgena musmodeller för metabola sjukdomar, har miniatyrisering av tekniken för användning i musen gav betydande förskott till metabolisk forskning.

    Medan begreppen bakom det insulin klämman är enkel, i praktiken finns det olika metoder för att utföra experiment insulin klämma. Detta är inte en trivial punkt, eftersom det sätt på vilket experimentet utförs påverkar resultaten 1. Här presenterar vi de protokoll som används av Vanderbilt MMPC. Den viktigaste skillnaden mellan våra protokoll och andras är att vi använder en arteriell kateter för att få blodprov. Detta står i kontrast till den mer utbredda synsätt OBTaining blodprov genom att bryta svansspetsen 4, 7, 11, 12, 14-17. Fördelen med provtagning från en arteriell kateter är att experimentet utförs på ett medvetet och ohämmad mus. Provtagning från svansen ofta kräver återhållsamhet och ökar index av stress när stora blodprov förvärvas 1. Stresshormoner stimulerar endogena produktion av glukos och försämrar omhändertagande av glukos 18, 19, potentiellt ger intryck av en insulinresistenta fenotyp. Provtagning från avhuggna svans kan kräva särskilda institutionella Djurvård och användning kommitténs godkännande på grund av sin stressiga natur. Det arteriell kateter Förfarandet har utvecklats för att undvika stress till musen för att bryta svansen.

    En viktig aspekt av att utföra insulin klämmor är förmågan att upprätthålla euglycemia. Det finns inga algoritmer som korrekt kan förutsäga hur GIR ska justeras baserat på blodsocker avläsningar. Liksom kirurgi,Personal som utför experiment insulin clamp kommer att bli skicklig på att upprätthålla en rimlig euglycemia endast genom erfarenhet. Det är viktigt att notera att på grund av sin högre ämnesomsättning de uppgifter som erhålls från mus studier kommer att i sig själv högljudd. Detta gör att fullständig presentation av data, inklusive tidsförlopp för glukos och GIR och absoluta värden för plasma insulin, Endora, Rd och RG avgörande för möjligheterna för läsaren att tolka resultaten. Den höga glukos flux priser i musen (ungefär 5 gånger högre än den hos människa) teckningsoption en hög frekvens av glukos provtagning. Medan blodvolymen av musen är begränsad, är ett minimum samplingsfrekvens på gång 10 minuter som krävs för att vara säker på att en lämplig klämma har uppnåtts.

    Som framgår av Figur 4 kan klämma insulinnivåerna vara olika mellan grupperna. Faktorer som kost interventioner, transgena manipulationer eller skillnader i bakgrunden stammar kan påverka FASting insulinnivåer, som sedan kan påverka nivåerna klämma insulin. Tolka resultat när klämman insulinnivåerna är olika kan vara problematiskt. Detta kan experimentellt åtgärdas genom att utföra pilotförsök för att välja kurser insulininfusionen som uppnår likvärdiga nivåer klämma insulin mellan grupper. Alternativt kan somatostatin användas för att hämma pankreas hormonet, och insulin och glukagon kan ersättas vid experimentellt kontrollerade priser. Den senare metoden är mer vanligt i insulin klämmor på råttor än möss. Om dessa experimentella metoder inte vidtas, kan steady-state GIR normaliseras till klämman insulin nivå, eller en insulinkänslighet index (S I) kan härledas från klämman uppgifter som S I = GIR / (G • ΔI), där G är steady-state glukoskoncentration och ΔI är skillnaden mellan fasta och klämma koncentrationer insulin. Ett antagande med antingen metod är att klämma insulin nivå som uppnåddes ärinom det område där känsligheten för insulin är linjärt relaterad till det insulin nivå enligt den grupp som studeras. Det sistnämnda antagande kanske inte gäller vid en jämförelse insulinresistenta och insulin känsliga grupper. Helst bör en insulindos responskurva genereras för att välja lämplig för insulin. På grund av kravet på ytterligare experiment, är detta sällan sker.

    Den mångsidighet som arteriell kateter omfattar experimentella metoder bortom euglycemic klämmor. Till exempel kan hyperglykemiska klämmor, där glukos är infunderas med en rörlig ränta för att upprätthålla hyperglykemi relativt fasteglukos, användas för att bedöma endogena bukspottkörtelns funktion in vivo-2, 20, 21. Mätning av första fasen insulinsekretionen under detta test kräver täta förvärv av blodprov (dvs. varje 2-5 min), vilket inte är möjligt när få prover från svanstippen. Vidareförhöjda katekolaminer följd svans provtagning kan försämra insulinutsöndring och förbättra glukagonsekretionen 22. Insulinet clamp-protokollet kan också ändras för att möjliggöra glukosnivåerna falla till relativt hypoglykemi bedöma kontraregulatoriska svar 2, 23, 24. Arteriell kateter kan också användas för att bedöma dynamiken i glukosmetabolismen under träning 25-30. Detta är betydligt fördelaktigt jämfört med konventionella metoder som bedrivs vid enstaka tidpunkter före och efter träning eller i enstaka muskler ex vivo. De tekniker som presenteras här kan även användas för att bedöma inte bara glukos, men även fettsyremetabolismen 31.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Detta arbete stöddes av Grant 5-U24-DK059637-10 till Vanderbilt Mouse Metabola Fenotypning Center.

    References

    1. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
    2. Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains. Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).
    3. Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism. J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).
    4. Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo. Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).
    5. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).
    6. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).
    7. Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).
    8. Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice. J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).
    9. Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).
    10. Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance. Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).
    11. Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).
    12. Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle. J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).
    13. Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4. J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).
    14. Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies. Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).
    15. Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance. Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).
    16. Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels. Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).
    17. Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis. Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).
    18. Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. Epinephrine-induced insulin resistance in man. J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).
    19. Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man. J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).
    20. Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).
    21. Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo. Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).
    22. Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction. Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).
    23. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).
    24. Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).
    25. Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action. Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).
    26. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice. Diabetes. 53, 306-314 (2004).
    27. Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).
    28. Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).
    29. Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse. J. Biol. Chem. (2004).
    30. Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter. J. Physiol. 582, 801-812 (2007).
    31. Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate. Lipids. 43, 703-711 (2008).

    Comments

    21 Comments

    Dear auther
    I would like to know if the disc accomodating the arterial and venus cathters tunneled under the skin and allowing the catheter antenas to protude is a commercial item and if not how do you produce it ?
    Thank you Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 8:09 AM

    Dear Rona,
    If you are referring to the MASA, please refer to section 1 of this article - "Preparation of catheters and the Mouse Antenna for Sampling Access". This section describes how to make the disc. Bend two 1.3 cm pieces of ²5 gauge steel tubing to about 1²0 degrees. Insert a 3 cm piece of PE-²0 into each steel tube. Secure both pieces of steel tubing to each other with a 5mm piece of silastic tubing. Dip the steel tubes into a drop of medical grade silicone adhesive such that the PE-²0 is vertical and the free steel tube ends come out of the bottom of the drop at about a 45 degree angle separation. Let the adhesive become solid overnight. I hope this helps.
    Best regards,
    Julio Ayala
    Reply

    Posted by: Julio A.November 29, 2012, 8:46 AM

    Dear Julio
    Yes this was my question
    Thank you for the explenation
    All the best Rona
    Reply

    Posted by: Rona S.November 29, 2012, 9:39 AM

    Hello Julio, I wonder how you maintain catheters. Should I flush them with heparinized saline everyday? Even if flushing everyday, catheters are clogged easily. Do I need higher heparin than 200 U/ml for flushing? Give me some advice, please? Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 26, 2014, 1:17 PM

    Hello Teayoun,
    This may depend on the material that you use for the tubing that is attached to the MASA. Originally, we used microrenathane tubing and would flush the lines daily with 200 U/ml hep saline. We have since started using PE-20 instead of microrenathane and find that we do not need to flush the lines (sometimes we will flush the lines 3 days after surgery just for good measure). With either approach, you will inevitably have some catheters clog, but this should not occur often. If you are flushing your lines daily and most of your catheters are still clogging, then there is likely another issue (perhaps the placement of the catheter is not correct?). Is this the arterial or the venous catheter? If it is the arterial catheter, is it sampling on the day of the surgery? How long until it clogs?

    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.March 26, 2014, 2:06 PM

    Julio,

    Thank you for quick response. Yes, I use microrenathane to make venous catheter body, but the tip of catheter is PE-20. If the material itself is problem, I will try PE-20 to make the body part of catheter. The catheter was working well (infusion was easy and smooth as a confirmation after implantation surgery done). Arterial catheter is a commercial one from Alzet (designed for mouse jugular vein, but works well for mouse carotid artery). I've heard some comments from others. heparin causes lipolysis and changing body metabolism and streptokinase may be a problem due to microbial material causing immune response. I'm still not 100% comfortable on catheter maintenance. Metal plug was used, but it's same. I don't know exact reason yet. I wish I could figure it out soon. Thank you,
    Reply

    Posted by: Teayoun K.March 28, 2014, 12:20 PM

    Teayoun,
    I would not recommend using PE or microrenathane for the catheter body (either vein or artery). PE is too rigid and microrenathane is too porous and prone to react (clot). It is my understanding that the Alzet catheters are made with polyurethane which, like the microrenathane, is too porous. I woudl recommend making the catheters as shown in this article (silastic for the vein and silastic with a PE-10 tip for the artery). Heparin will have an effect on lipolysis, but the amounts and frequency with which you flush should not have significant effects on metabolism. Also, when checking the catheters after the surgery, make sure that you can draw blood, not just infuse smoothly. Sometimes you can infuse very smoothly but cannot draw blood, which means that the catheter is not in place.
    Reply

    Posted by: Julio A.March 28, 2014, 3:42 PM

    Dear author,
    Can you please provide a product number and purchasing source for the "medical silicone adhesive" used for MASA construction?
    thank you
    Joe C.
    Reply

    Posted by: Joseph C.April 8, 2014, 5:11 PM

    Hi Joe C.

    You can get it from Fisher:

    FACTOR II INC MEDICAL ADHESIVE SIL TYPE A Catalog No.: NC9938868 Medical Adhesive, Type A

    Good luck!
    Julio
    Reply

    Posted by: Julio A.April 11, 2014, 4:15 PM

    Dear Dr.Ayala,

    We performed surgery following your protocol, 5 days later, animals gain body weight back and both catheters stay open.We try to clamp the blood glucose level around 150mg/dl, The insulin dose is 4mU/kg.min. The fasting glucose level of our mice is around 120, During the H3 tracer infusion phase, the blood glucose level normally dropped to around 100, but will not fluctuate a lot. However when we stared insulin and glucose infusion, the blood glucose can be stable for 40 mins then suddenly drop to below 100. Then we increased GIR, the blood glucose will come back to 150s but will not stay there, after 30 mins to 40 mins it will dip again.
    We dissect the mice after surgery, to make sure there was no leakage.
    We paid attention to small blood sample size,donor blood,and we controlled temperature, we kept environment quiet. We fast mice 3hrs before clamp. Could you please give us some suggestions for trouble shooting? Thanks a lot.
    Reply

    Posted by: Kai M.April 15, 2014, 11:17 AM

    Hello,
    Without seeing our data, particularly the time course of your glucose infusion and glucose levels, I really cannot tell you whether your experience is unusual. When you say that "it dips again", does it dip below 100 mg/dL? Does it dip by 5, 10 mg/dL? How much are you changing the glucose infusion rate? Are these wild-type mice or a transgenic line? You can contact me directly at jayala@sanfordburnham.org if you want to discuss further.
    Reply

    Posted by: Julio A.April 16, 2014, 10:32 AM

    Dear Dr.Ayala,

    I used to use micro-renathane tubing to make venous catheter tip, however Micro-renathane is rigid, half of my catheter penetrate the venous wall, I end up with all my infusate leaked into chest cavity. Then I start to follow your instruction to make venous catheter with silastic tubing. However, I found quite a few my surgery failed because my ligation on the catheter will leak after 3,4 days. No matter how tight I made the ties, or add 1 or two more sutures, it didn't improve. I always found a big lump of infusate formed after clamp subcutaneously near the neck. I am using 6-o silk suture now. Can you please give me some hint to improve the procedure?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 12:32 PM

    Hello Kai. I am Carlo and the hands doing the surgical procedure parts of the video are attached to my body :-). Kidding aside, do the opposite. Try tying over the vessel/catheter with the least possible pressure. The guide is: once you see that the suture knot is deforming the silastic tubing, you are tying too tight! You only need the suture to be snug and it should hold in the vessel without affecting the patency or causing it to leak. Let me know if this tip works.
    Reply

    Posted by: Carlo M.October 2, 2014, 1:29 PM

    Thanks. I will try it!

    Kai
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 4:11 PM

    Dear Kai,
    Are you making the silastic "collar" using 0.020" ID silastic as shown in Fig. 1B? If you tie your suture behind this collar, it should secure the catheter in the vessel.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:05 PM

    Dr.Ayala, Thanks for your reply, Yes I do, the leakage always happens around the ties before the docking beads. The ties can secure the catheter for about 4days. I doubt if my 7-o suture is too sharp, ( I typo a 6-O suture in the previous comment).so the it damage the wall of blood vessel . Can you tell me what size do you use? Another concern is if the silastic tubing is too soft. The leakage rarely happens when I use Micro-renathane tubing. Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:25 PM

    Also, just out of curiosity, are you making your venous catheter as a single 6cm long piece of silastic? I ask because in your original comment, you referred to the "venous catheter tip". I was just wondering if you were trying to make it the same as the arterial catheter. It should just be a single piece of silastic with the collar slipped over it. I just saw that Carlo Malabanan posted a reply as well. He is an expert at this surgery.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:38 PM

    We use 7-0 sutures and silastic tubing and have not had leaking problems with the silastic. I will confer with my colleagues at Vanderbilt to see if they have seen this before.
    Reply

    Posted by: Julio A.October 2, 2014, 1:31 PM

    Dear Malabanan

    Could you kindly explain why 7-o is better than 6?

    Thanks
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 2:56 PM

    Dr.Ayala,

    I called the part in fornt of docking beads the "tip" , yes I used a whole piece of silastic tubing as my catheter.Thanks.
    Reply

    Posted by: Kai M.October 2, 2014, 1:47 PM

    Dr.Ayala and Dr.Malabanan
    I figured out the reason for venous leakage is didn't insert the catheter deep enough, since I worry about the tip of venous catheter penetrating the venous wall, I only use 9mm long tip. Which cause a dead space in the vein where blood will stay and form clot, once the clot block the vein, the pressure will build up and eventually burst the venous wall when I start to infuse.Now as you suggested I am using 11mm long tip, which will stay close enough to the heart, and no clot will form before the opening of catheter. Thanks For your help.
    Reply

    Posted by: Kai M.November 4, 2014, 1:04 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter