Oprensning af Patogen vakuoler fra

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til isolering og oprensning af intakt

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hoffmann, C., Finsel, I., Hilbi, H. Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes. J. Vis. Exp. (64), e4118, doi:10.3791/4118 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den opportunistisk patogen Legionella pneumophila er en amøbe-resistent bakterie, der også replikerer i alveolære makrofager dermed forårsager den alvorlige lungebetændelse "Legionærsyge" 1. I protozoer og pattedyr fagocytter, L. pneumophila anvender en konserveret mekanisme til dannelse af en specifik, replikations-eftergivende kammer, en "Legionella-holdige vakuolen" (LCV). LCV dannelse kræver bakterielle ICM / Dot type IV sekretionssystem (T4SS), der translokaliserer så mange som 275 "effektor"-proteiner i værtsceller. Effektorerne manipulere vært-proteiner såvel som lipider og kommunikere med sekretorisk, endosomale og mitokondrie organeller 2-4.

Dannelsen af ​​lette erhvervskøretøjer repræsenterer en kompleks, robust og overflødige proces, som er vanskeligt at forstå en reduktionistisk måde. En integreret tilgang er påkrævet for at omfattende forstå LCV dannelse, herunder en samlet analyse af stienogen-vært faktor interaktioner og deres tidsmæssige og rumlige dynamik. Som et første skridt hen imod dette mål, er intakte lette erhvervskøretøjer oprenset og analyseret ved proteomics og lipidomics.

Sammensætning og dannelse af patogen-holdige vakuoler er blevet undersøgt ved proteomik analyse under anvendelse af væskekromatografi eller 2-D gelelektroforese koblet til massespektrometri. Vakuoler isoleret fra enten sociale jorden amøbe Dictyostelium discoideum eller mammale fagocytter husede Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, Salmonella 9 eller Legionella spp. 10. Men, rensning protokoller benyttet i disse undersøgelser er tidskrævende og kedelige, da de kræver fx elektronmikroskopi til at analysere LCV morfologi, integritet og renhed. Derudover har disse protokoller ikke udnytte særlige kendetegn patogenet vacuolen for enrichment.

Metoden præsenteres her overvinder disse begrænsninger ved at ansætte D. discoideum frembringelse af en fluorescerende LCV markør og ved at målrette det bakterielle effektorprotein proteinet SidC, som selektivt forankrer til LCV membranen ved at binde til phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. Lette erhvervskøretøjer er beriget i et første trin ved immuno-magnetisk separation under anvendelse af et affinitetsoprenset primære antistof mod SidC og et sekundært antistof koblet til magnetiske perler, efterfulgt i et andet trin ved en klassisk Histodenz densitetsgradientcentrifugering 12,13 (fig. 1) .

En proteom undersøgelse af isolerede lette erhvervskøretøjer fra D. discoideum afslørede mere end 560 værtscelleproteiner, herunder proteiner associeret med fagocytiske vesikler, mitokondrier, ER og Golgi samt adskillige GTPaser, som ikke er blevet impliceret i LCV dannelse før 13. Lette erhvervskøretøjer beriget og oprenset medprotokollen beskrevet her, kan yderligere analyseres ved mikroskopi (immunfluorescens, elektronmikroskopi), biokemiske metoder (Western blot) og proteom eller lipidomic fremgangsmåder.

Protocol

1. Forberedelserne til LCV Isolering

  1. Streak ud Legionella pneumophila producere DsRed-Express 13,14 fra glycerol bestande på CYE agarplader med 5 mg / ml chloramphenicol (Cam) fire dage før LCV isolation. Inkuber bakterierne ved 37 ° C.
  2. Seed ud 1 x 10 7 D. discoideum fremstilling GFP-calnexin eller RAW264.7 murine makrofager i 75 cm2 vævskulturkolber en dag før infektion. Anvende 10 ml HL5 medium med 20 ug / ml G418 for D. discoideum og inkuber amøber ved 23 ° C. For RAW264.7 makrofager anvende 10 ml RPMI 1640 medium suppleret med 10% FCS (varmeinaktiveret) og 1% glutamin og dyrke cellerne ved 37 ° C og 5% CO2. Brug mindst tre 75 cm 2 flasker pr infektion og prøve (mindst 6 x 10 7 celler).
  3. Podes en kultur natten over med L. pneumophila fra CYE pladen. Tag en 15 ml reagensglas med 3 ml AYE mediumog 5 ug / ml Cam. Inokulere med 100 gl af en bakteriel suspension til opnåelse af en OD 600 nm på 0,1. Inkuber natten over kultur af en overliggende rotationshjulet ved 37 ° C i 21-22 timer.

2. LCV Isolering

  1. Skift medie D. discoideum-celler til fjernelse af antibiotika, som ville interferere med efterfølgende infektion.
  2. Måle OD af den natgamle kultur. Bakterierne har nået deres maksimale infektivitet ved en OD 600 nm på ≥ 3, hvilket svarer til 2 x 10 9 bakterier / ml.
  3. Inficere cellerne ved tilsætning af ca 500 ul af L. pneumophila overnatskultur til cellerne, der vokser i 10 ml HL5 medium (D. discoideum) eller 10 ml RPMI 1640 (makrofager). Dette svarer til en multiplicitet af infektion (MOI) på 50. Derefter infektion synkroniseret ved centrifugering af bakterierne på cellerne ved 500 x g i 10 min. Centrifugering efterfulgtved en inkubation af D. discoideum-celler ved 25 ° C, og RAW264.7 makrofager ved 37 ° C og 5% CO 2, henholdsvis. Infektion på 1 time indbefatter centrifugering.
  4. Efter infektion fjernes mediet og vaskes cellerne en gang for at fjerne ekstracellulære bakterier. Brug iskold SorC buffer for D. discoideum og is-kold PBS for RAW264.7 makrofager. Tilsæt 3 ml HS-puffer suppleret med proteaseinhibitorer (Roche) til hver kolbe og indsamle cellerne ved hjælp af en celleskraber. Pulje de tilsvarende prøver i et 15 ml reagensglas.
  5. For homogenisering af prøven bruge 3 ml plastik Luer-Lock sprøjter og den rustfri stålkugle homogenisator. Sørg for, at du arbejder på is. Før du starter, vaske bolden homogenisatoren med destilleret vand, for at undgå vaskemiddel forurening og skyl det med iskold HS buffer for at slippe af luftbobler. Anvende 8 um clearance kugle.
  6. Fyld de første 3 ml i sprøjten und montere den på the homogenisator. Tryk prøven frem og tilbage ni gange gennem homogenisatoren. Byt sprøjterne bagefter for at undgå forurening med ikke-homogeniserede materiale. Indsamle og samle de homogeniserede proeve i et 15 ml reagensglas og tage en 150 gl prøve til mikroskopisk analyse. Før du fortsætter med en anden prøve afmontere og vaske bolden homogenisatoren.
  7. Blokere homogenatet med 2% CS eller FCS i 30 minutter på et rysteapparat på is eller en overhead-rokken (10-20 rpm) ved 4 ° C.
  8. Efter blokering anvende et affinitetsoprenset primært antistof mod SidC (fortynding 1:3000) eller enhver anden bakteriel markør udelukkende binding til LCV membranen. Vortex antistoffet løsning, før du tilføjer den til homogenatet. Prøven inkuberes i 1 time på et rysteapparat på is eller en overhead-rokken (10-20 rpm) ved 4 ° C.
  9. I mellemtiden forbereder Histodenz gradient. Anvend en 15 ml reagensglas pr gradient og tre 75 cm2 kolber i en prøve. Firm, tilsættes 5,75 ml 35% Histodenz til røret, og for det andet tilsættes forsigtigt 5,75 ml 10% Histodenz opløsning på Top. Bagefter omhyggeligt lægge rør ned vandret for 1 time.
  10. Efter inkubation af homogenatet med blokerende reagens og det primære antistof, centrifugeres ved 600 x g i 15 minutter ved 4 ° C for at pelletere prøven. Bortkast supernatanten og resuspender pelleten i 1,5 ml HS-puffer. Overføre prøver til et frisk 15 ml reagensglas, og tage en 40 ul prøve til mikroskopisk analyse senere.
  11. Inkuber pelleten med det sekundære antistof - MLA ged anti-kanin IgG mikroperler (fortynding 1:25) - til 30 minutter på et rysteapparat ved 4 ° C. I mellemtiden satte søjlerne på MACS magnetholder og ligevægt dem med 0,5 ml HS buffer.
  12. Efterfølgende anvendelse prøverne til søjlen. Indsamle 150 ul af gennemstrømnings-til efterfølgende mikroskopisk analyse. Vaskes søjlen tre gange med 0,5 ml HS-puffer.
  13. Fjern kolonner fra than magnet og eluatet de lette erhvervskøretøjer med 0,5 ml HS buffer ved umiddelbar sprøjter. Tag en 20 gl prøve til mikroskopisk analyse. Oprensningstrinnet ved immuno-magnetisk separation forventes at give pr 1 x 10 7 inficeret D. discoideum-celler ca 1 x 10 6 intakte lette erhvervskøretøjer, som er omkring syv gange beriget i eluatet sammenlignet med gennemstrømnings-13.
  14. Sæt Histodenz gradient rørene tilbage til lodret position og omhyggeligt indlæse eluatet på toppen. Centrifuger rørene ved 3350 x g i 1 time ved 4 ° C.
  15. Efter centrifugering tage 1,5 ml fraktioner fra bunden af ​​reagensglasset ved hjælp af en lang glas Pasteur-pipette. Helt indsamle otte fraktioner, hver fra bunden af ​​røret. Ingen synlige lag er observeret i den løbende Histodenz gradient. Det højeste udbytte af lette erhvervskøretøjer typisk forventes i fraktion 4 i et forhold på ~ 2 x 10 5 intakte lette erhvervskøretøjer pr 1 × 10 7 ipåvirket amøber 13. Mindre mængder af lette erhvervskøretøjer er også til stede i fraktionerne 3 og 5 henholdsvis. Således det samlede udbytte af oprenset lette erhvervskøretøjer er ~ 1 x 10 6 intakte lette erhvervskøretøjer pr 6 x 10 7 inficeret D. discoideum-celler 13. Genvinding af lette erhvervskøretøjer kan udføres ved stuetemperatur (RT) og lette erhvervskøretøjer synes at være stabile i adskillige timer.

3. Mikroskopisk analyse af de indsamlede prøver

  1. Fremstilling af en 24-brønds fladbundede vævskulturplade med poly-L-lysin-overtrukne dækglas.
  2. Pipettere hver prøve taget i LCV oprensningen plus 150 ul af hver densitetsgradient fraktion i 24-brønds plade. Tilsæt 0,5 ml HS-puffer til hver brønd for at fortynde den høje Histodenz koncentration. Derefter centrifugeres pladen ved 600 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Forsigtigt supernatanten fjernes og fastgør prøverne med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter fiksering vaskes prøverne to gange. Ose SorC for D. discoideum og PBS for RAW264.7 makrofager.
    1. Monter prøverne fra GFP-calnexin udtrykker D. discoideum, taget på forskellige trin i løbet af LCV isolation, direkte på glas-dias med f.eks Vectashield.
    2. Inkuber prøverne fra RAW264.7 makrofager udtaget på forskellige trin under LCV isolation med blokerende opløsning (1% BSA i PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur. Anvender et anti-SidC primære antistof til farvning af lette erhvervskøretøjer og inkuberes i 1 time i en våd kammer ved stuetemperatur (affinitetsoprenset kanin-anti-SidC; 1:1000 i blokeringsbuffer). Efterfølgende vaskes prøverne tre gange med PBS. Inkuberes med et sekundært antistof (fx anti-kanin Cy5, 1:200 i blokeringsopløsning) i 30 minutter i en våd og mørkt kammer ved stuetemperatur. Endelig, vaske prøverne tre gange med PBS og montere dem på glas-dias med f.eks Vectashield.
  3. Morfologi, integritet og mængden af de lette erhvervskøretøjer isoleret fra GFP-calnexin udtrykke D. DIScoideum eller fra RAW264.7 makrofager analyseres ved et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre.

4. Repræsentative resultater

Kvaliteten og udbyttet af LCV oprensning ved immuno-affinitets separation og densitetsgradientcentrifugering kan følges ved fluorescensmikroskopi (fig. 1). En oversigt af prøver indsamlet i løbet af LCV isoleret fra D. discoideu m eller makrofager, er vist (fig. 2). Den homogenat af L. pneumophila-inficerede fagocytter viser intakte lette erhvervskøretøjer, men også en masse cellerester og ekstracellulære bakterier. Efter pelletering af prøven, er det billede, der svarer til homogenatet, undertiden lidt tættere. Siden intakte lette erhvervskøretøjer bør holde sig til den kolonne, flow-through indeholder det meste ekstracellulære bakterier og cellerester. Efter eluering af prøven fra kolonnen, indeholder eluatet intakte lette erhvervskøretøjer i store mængder. I vores hænder, LCV purificati den synes at være mere effektiv til D. discoideum end makrofager. I D. discoideum patogenet vakuoler vises rundere og udbyttet af isolerede lette erhvervskøretøjer er mere end 10 gange højere sammenlignet med makrofager (fig. 3). I intakte makrofager LVCs farvet med forskellige antistoffer også forekommer mere uregelmæssigt formet.

Figur 1
Figur 1. Skematisk oversigt over LCV isolation. A) Isolering af lette erhvervskøretøjer ved immuno-magnetisk separation under anvendelse af et affinitetsoprenset antistof mod det bakterielle effektorprotein proteinet SidC, lokalisere udelukkende LCV membranen. En sekundær MACS mikro perle-koblet antistof og en magnet anvendes til at isolere lette erhvervskøretøjer fra cellerester. B) Efter immuno-magnetisk separation lette erhvervskøretøjer renses yderligere ved Histodenz densitetsgradientcentrifugering. Lette erhvervskøretøjer er beriget i fraktion 4.

upload/4118/4118fig2.jpg "/>
Figur 2. Prøver indsamlet i løbet LCV rensning. Billeder fra homogenatet, pellet, gennemstrømnings-og eluat fra D. discoideum eller makrofager er afbildet. Prøverne viser, L. pneumophila producere DsRed-Express (rød) i D. discoideum fremstilling GFP-calnexin signal (grøn, øvre panel) eller makrofager farvet med et anti-SidC antistof (cyan, nederste panel). Barer, 10 um.

Figur 3
Figur 3. Oprenset lette erhvervskøretøjer fra D. discoideum eller makrofager. Prøverne viser fraktion 4 efter Histodenz densitetsgradientcentrifugering af L. pneumophila fremstilling DsRed-Express (rød) i (A) D discoideum fremstilling GFP-calnexin signal (grøn) eller (B) i makrofager farvet med et anti-SidC antistof (cyan). Barer, 10 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I modsætning til tidligere offentliggjorte fremgangsmåder, er denne protokol baseret på to trin, først til adskillelse af lette erhvervskøretøjer af en immuno-magnetisk metode, og det andet oprensningen af ​​lette erhvervskøretøjer ved densitetsgradientcentrifugering. LCV isolation kan let følges ved hjælp af fluorescensmikroskopi, når enten fluorescensmærkede bakterier og GFP-producerende celler eller antistoffarvning anvendes. Protokollen beskrevet her er en simpel, ligetil fremgangsmåde, hvilket resulterer i berigelse af lette erhvervskøretøjer med høj renhed. Vigtigere er proteaseinhibitor i homogeniseringsbufferen kræves for RAW264.7 makrofager, men valgfrit for D. discoideum 13.

I princippet kan protokollen blive indført i de andre patogener eller værtsceller, så længe en specifik selektiv lokalisering markør er til stede, som er nødvendig for separeringstrin. Ideelt adskilt markør er af bakteriel oprindelse, transporteres til vakuolen membran, ennd selektivt at lokalisere der. Målretning af en værtscelle markør sandsynlige resulterer i uønskede co-oprensning af patogenet vakuolen med andre værtscelleproteiner rum.

Når først en karakteristisk markør af patogenet vakuolen er identificeret en egnet polyklonalt eller monoklonalt antistof har hæves. For hver primært antistof koncentrationen og blokeringsreagens bør optimeres, som blokerer andre reagenser end FCS ville være mere passende (f.eks BSA, de-lipiderede mælk, andre kommercielt tilgængelige blokerer reagenser).

Et andet kritisk punkt er infektiviteten af ​​patogenet. De bakterier, der anvendes til infektion bør være i deres mest infektive stadium. L. pneumophila, f.eks skal dyrkes til post-exponential/early stationære vækstfase i flydende kultur. Under disse betingelser, er bakterierne også morfologisk ensartet (~ 2 x 0,5 um), i modsætning til bakterier dyrket på CYE agarplader. Endvidere antibiotics eventuelt anvendes i cellekulturmediet skal fjernes forud for en infektion for at undgå lave infektivitet og skade på bakterierne. For at undgå en negativ effekt på udbredelsen effektivitet bør fagocytter har nået en konfluens på ca 80% (ikke mere) på tidspunktet for infektion. Endelig, skønt en inkubationsperiode på 1 time er standarden infektionen tid for L. pneumophila, hvilket gav en temmelig homogen og robust population af lette erhvervskøretøjer, kan andre tidspunkter vælges til proteom eller biokemiske undersøgelser LCV formationen 13.

Når ovenstående fremgangsmåde er etableret for et givent patogen-værtscelle par, er det også muligt at teste bakterielle mutantstammer og / eller forskellige værtsceller, herunder D. discoideum defineret deletionsmutanter. I almindelighed kan patogen vakuoler oprenset med denne protokol kan analyseres ved forskellige fremgangsmåder, herunder mikroskopi (fluorescens-og elektronmikroskopi), biokemiske assays (Western blot), som vill som proteomics og lipidomics. For de sidstnævnte metoder, er det tilrådeligt at koordinere med den person, der har ansvaret for proteomics / lipidomics analysen buffer betingelser, prøve beløb og nedstrøms behandling af renset patogene vakuoler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Forskning i vores laboratorium blev støttet af Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universitet München, det tyske Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medicinske Infektion Genomics"-initiativet ( 0315834C).

References

  1. Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
  2. Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
  3. Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
  4. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
  5. Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
  6. Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
  7. Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
  8. Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
  9. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
  10. Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
  11. Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
  12. Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
  13. Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
  14. Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics