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Trasplante ortotópico de hígado en ratas

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Summary

Se presenta una revisión fácil de establecer de la clásica banda de dos técnicas para el trasplante ortotópico de hígado en ratas.

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Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic Liver Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (65), e4143, doi:10.3791/4143 (2012).

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Abstract

La evolución clínica en el campo del trasplante hepático ha sido ampliamente apoyado por los animales 1,2 modelos. Desde la publicación del primer trasplante ortotópico de hígado de rata en 1979 por Kamada y col. 3, este modelo sigue siendo el estándar de oro a pesar de diversas técnicas propuestas alternativas 4. Sin embargo, su uso más extendido está limitado por su empinada curva de aprendizaje 5.

En este trabajo de vídeo, se muestra una revisión simple y fácil de establecer de dos manguito Kamada la técnica. La vena cava suprahepática anastomosis se realiza manualmente con una sutura continua, y la vena porta y la vena cava infrahepática anastomosis se realizan utilizando un sistema de banda rápido enlazador 6. La fabricación del kit de rápida-enlazador se muestra en un papel de video separada.

Protocol

1. Operación de los donantes

  1. Anestesie ratas macho que pesaban 200 ± 20 gramos con isoflurano en el cono de la máscara (3% para la inducción, el 2% durante la operación, un flujo de aire l / min, FiO2 70%).
  2. Realice una laparotomía mediana y gran transversal y cauterizar los vasos epigástricos en ambos lados.
  3. Cortar el ligamento falciforme, y separar la vena diafragmática izquierda de la vena cava suprehepatic. Por último, se divide la vena diafragmática entre dos ligaduras de seda 7-0.
  4. Cortar el triangular de la izquierda y los ligamentos gastro-hepáticos.
  5. Divida el ligamento hepato-esofágico y la arteria entre el 7-0 ligaduras (coagulación es una alternativa válida).
  6. Aislar el infrahepática la vena cava hasta la vena renal izquierda. Separe la vena renal derecha de los tejidos circundantes y se divide entre un 10-0 y una ligadura de 7-0, en sus extremos proximal y distal, respectivamente.
  7. Divida la vena suprarrenal derecha entre el 7-0 ligatures libre y el hígado de sus ligamentos posteriores al cortar en una suave tracción.
  8. Aislar la vena gastrosplénico y se divide entre un 10-0 y una ligadura 7-0, en sus extremos proximal y distal, respectivamente.
  9. Divida la arteria hepática adecuada entre 7-0 relaciones.
  10. Aislar la vena duodeno-páncreas y lo dividió entre el 10-0 y una ligadura de 7-0, en su extremo proximal y distal, respectivamente.
  11. Inserte un 22G, 3,5 mm del stent en el conducto biliar común, practicando una pequeña incisión en la distancia de 1 cm desde el hilio hepático. Asegure el stent en la posición con una ligadura de 7-0.
  12. Inyectar 10 UI de heparina, se diluyó en 1 ml de solución salina normal, a través de la vena dorsal del pene.
  13. Canular la vena porta (la medida de lo posible, desde el hilio) con una aguja 21G y lave cuidadosamente el hígado con 20 ml de lactato de Ringer fría (o con otras soluciones de preservación). Al mismo tiempo, cortar la vena cava por debajo de las venas renales para permitir una adecuada outflow. La perfusión del hígado en frío no debe durar entre uno y dos minutos.
  14. Cortar la vena porta debajo de la vena duodeno-pancreático.
  15. Cortar el conducto biliar común distalmente a la ligadura alrededor del stent.
  16. Completa la incisión de la vena cava infrahepática.
  17. Cortar la vena cava suprahepática descremada al diafragma y eliminar el hígado.
  18. Coloque el hígado en un recipiente lleno de lactato de Ringer frío y laicos de la cuenca en una plataforma de hielo.

2. Preparación del injerto

  1. Insertar la vena porta en su manguito, a continuación, volver el recipiente alrededor del borde para exponer la íntima. Asegure el segmento evertido en el manguito con una ligadura de 7-0.
  2. Repita la misma operación en el infrahepática la vena cava.
  3. Coloque una abrazadera de micro-(4-6 mm de longitud) en la parte proximal de la infrahepática la vena cava. Esta operación evita la pérdida de sangre después de la reperfusión del portal.
  4. Revocar el hígado e insertar dos puntos de sutura prolene 8-0en los bordes laterales opuestos de la vena cava suprahepática, de afuera hacia adentro.
  5. Guarde el injerto (sumergido en solución de Ringer lactato) en el refrigerador a 0-4 ° C.

3. Operación del destinatario

  1. Anestesie ratas macho que pesaban 200 ± 20 gramos con isoflurano en el cono de la máscara (3% para la inducción, el 2% durante la operación, un flujo de aire l / min, FiO2% 70) y seguir una almohadilla caliente. Es de destacar que el peso receptores y donantes deben coincidir (± 40 gramos).
  2. Inyectar 10 ml de solución salina normal por vía subcutánea y 0,03 g de piperacilina / tazobactam por vía intramuscular antes de la laparotomía.
  3. Realice una línea media xipho-púbica laparotomía.
  4. Invierta el proceso xifoides con una pinza de auto-estáticos con el fin de exponer mejor el hígado.
  5. Corte los ligamentos anteriores y dividir la vena diafragmática izquierda entre dos relaciones 7-0.
  6. Divida el ligamento hepato-esofágico y la arteria entre las ligaduras (7-0 coagulation es una alternativa válida). No se muestra en el vídeo (idéntico al funcionamiento de los donantes).
  7. Aislar el infrahepática la vena cava hasta la vena renal derecha.
  8. Divida la vena suprarrenal derecha entre el 7-0 ligaduras y sin el hígado de sus ligamentos posteriores al cortar en una suave tracción (no se muestra en el vídeo (idéntico al funcionamiento de los donantes)).
  9. Coloque una ligadura de 7-0 alrededor del conducto biliar común, justo debajo de su división. Dicho de otra ligadura de un milímetro por debajo y cortar en el medio.
  10. Aislar la arteria hepática en el hilio y se divide entre el 7-0 ligaduras.
  11. Suavemente separa las ramas portales izquierda y derecha. Preste atención para no dañar la arteria hepática común o la vena gastro-esplénico.
  12. Coloque el anillo de la vena cava alrededor de la vena cava, cranealmente a la vena renal derecha. A continuación, fije la pared del vaso al anillo mediante la colocación de cuatro puntos cardinales 9-0 puntos de sutura.
  13. Repetir la misma operación con el anillo en el portal de la vena porta. Inyectar 10 UI de heparina, se diluyó en 1 ml de solución salina normal, a través de la vena dorsal del pene.
  14. Establecer la anestesia en 0,25% y la FiO2 en 100%.
  15. Fije el infrahepática la vena cava por encima de la vena renal derecha, y luego fijar la vena porta justo por encima de la vena gastro-esplénico. Por último apretar el vena cava suprahepática y asegúrese de incluir al menos 2 mm de diafragma.
  16. Cortar la vena suprahepática cerca de cava para el parénquima.
  17. Cortar la izquierda y las ramas portales derechas y dividir el tabique en el medio.
  18. Cortar el infrahepática la vena cava cerca del parénquima, teniendo cuidado de no incidir cualquiera de las suturas previamente colocadas. Retirar el hígado y colocar el injerto en la cavidad abdominal.
  19. Lleve a cabo una anastomosis término-terminal entre la vena cava suprahepática del injerto y del receptor. Comience con la sutura de la pared posterior de izquierda a derecha, a continuación, proceder en la pared anterior del derecho a la le-Mantenga pies de la sutura anterior suelta hasta el final con el fin de permitir que un lavado abundante de la luz interior antes de apretar los extremos.
  20. Inserte la rama caudal de la aproximador en el mango del anillo del portal, a continuación, introduzca la vena porta del injerto en la hendidura de la rama craneal de la aproximador, con el brazalete del portal para encontrar su posición en la ranura.
  21. Cerrar la aproximador al enjuagar el recipiente de la vena porta con solución salina normal y permitir que el manguito para insertar en el recipiente. Fije la vena porta del receptor alrededor de su puño con un empate 7-0 circunferencial.
  22. Retire el aproximador. Abra la pinza en la vena cava suprahepática y la vena porta con el fin de: flujo portal está restablecido.
  23. Retire el anillo del portal mediante la reducción de las ligaduras de 9-0, con extra-finas tijeras.
  24. Inserte la rama caudal de la aproximador en el mango del anillo cava, a continuación, insertar el infrahepática la vena cava del injerto en la ranura del cráneo rama del aproximador, con el manguito de la vena cava para encontrar su posición en la ranura.
  25. Cierre el aproximador, durante la descarga del destinatario infrahepática la vena cava con solución salina normal y permitir que el manguito para insertar en el buque. Asegure el receptor la vena cava alrededor de su puño con un empate 7-0 circunferencial.
  26. Retire el aproximador. Abra las microclamps en el infrahepática la vena cava del injerto y receptor, con el fin de: flujo venoso está restablecido.
  27. Realice una incisión parcial del conducto del receptor biliar común, aplique una tracción suave hacia la cabeza, e insertar el lado libre del stent previamente insertado en el conducto biliar del injerto. Asegure el stent con una circunferencia 7-0 empate.
  28. Cerca del animal por capas, con 5-0 puntos de sutura. Deje que el agua libre y comida de despertar.
  29. Administrar analgesia eficaz de acuerdo a protocolos institucionales locales. Una duración mínima de 24 h se recomienda.
_content "> De la nota: de extremo a extremo anastomosis de la arteria hepática puede llevar a cabo, cuando sea requerido por el diseño experimental (la arteria no es necesaria para la supervivencia a largo plazo después del trasplante de hígado de la rata).

4. Los resultados representativos

La técnica descrita puede ser dominado con éxito por nuestro equipo después de aproximadamente 10 cirugías de entrenamiento. Permitió que el 100% a largo plazo (> 21 días) la supervivencia en 36 consecutivos Lewis a Lewis y trasplantes oscuros Agouti a Lewis, después de que el corto periodo de formación (un número de receptores singénicos injerto hepático se han mantenido vivas durante más de 12 Desde hace meses). Post-trasplante syngeneic día 1 pruebas de función hepática mostraron aspartato transaminasa mediana (AST): 84 U / l (51,7 a 92,7) y la mediana de la alanina aminotransferasa (ALT): 172,5 U / l (127,5-240,2). La fase de anhepática medio (desde la vena porta de sujeción a la reperfusión del injerto) fue de 14 ± 2 min, con el paso de ser el más largo de la vena cava suprahepática anastomosis (s corriendoFUTURO) Tiempo de 9 ± 2 min.

El sistema Quick-enlazador permitido el posicionamiento de 1,55 mm de diámetro en la vena porta esposas y 2,40 mm de diámetro puños en la vena cava (receptores de peso de 200 ± 20 g). Por el contrario, cuando tratamos de transplante usando la técnica de Kamada, que no podían exceder de 1,40 mm y 2,16 mm, respectivamente (las ratas de contrapartida para la tensión y el peso). Como se muestra en la Figura 7, rápida-enlazador anillos están diseñados para mantener los vasos receptores en óptimo de estiramiento, permitiendo mínimo pinza y el desgaste de longitud, lo que resulta en el más cercano a fisiológicas resultados hemodinámicos.

Figura 1
Figura 1. Medidas Anillos.

Figura 2
Figura 2. Medidas Microclamps.

Figura 3
Figura 3. Quick-enlazador kit.

Figura 4
Figura 4. Rápido enlazador armado.

Figura 5
Figura 5. Rápido enlazador cerrado.

Figura 6
Figura 6. Abrazadera SHVC.

Figura 7
Figura 7. Classic vs rápida enlazador asistidos por anastomosis del manguito-hemodinámica.

Figura 8
Figura 8. De los donantes y la preparación de la piel del destinatario y la incisión.

Discussion

El hígado de rata actual modelo de trasplante puede establecerse fácilmente. En nuestra experiencia, algunos puntos clave que ayudan a minimizar el riesgo de muerte (≤ 20%). Las muertes tempranas, producidas en las tres primeras horas de la reperfusión, son más a menudo debido a un infarto intestinal, como consecuencia de un portal de tiempo de fijación. Por tanto, se recomienda mantener la fase anhepática en el límite ideal de 15 minutos (20 minutos todavía aceptable). Central de la embolia de aire también puede ser una causa de muerte súbita y es obligatorio para eliminar todas las venas antes de la anastomosis.

Las muertes que se producen entre el día postoperatorio y tres son a menudo debido a la insuficiencia hepática o la trombosis de la vena cava. Uno por lo tanto, deben evitar cualquier injerto agresiva lavado antes de la explantación en el donante (que lavar con 20 ml durante aproximadamente 60 segundos) y garantizar una conservación adecuada en frío (inmersión total en 0-4 ° C solución de Ringer lactato). El riesgo de trombosisse puede disminuir reduciendo al mínimo la manipulación de la íntima y preservar su integridad. No se recomienda el uso de la anticoagulación después de la cirugía.

Las muertes entre los días cuatro y nueve postoperatorio se relaciona a menudo con colangitis bacteriana 7. Basándonos en nuestra experiencia, una sola dosis de piperacilline / tazobactam (0,03 g) dada antes de la laparotomía es suficiente para reducir al mínimo el riesgo de infección del conducto biliar común.

La muerte es un evento raro después del día 10. Sin embargo, debido a la ausencia de flujo arterial, algunos problemas de conductos biliares se puede observar con cholastasis 8. Dependiendo de las necesidades del investigador una arterialización puede considerarse 9. De nota, un tiempo de isquemia fría de hasta 24 horas pueden ser considerados como aceptables 10.

El sistema Quick-enlazador fue originalmente diseñado para llevar a cabo el trasplante de hígado con tres anastomosis del manguito (fase anhepática muy corto). Sin embargo, el TE tres manguitochnique requiere el uso de pinzas muy pequeñas para la vena cava suprahepática (SHVC) del manguito y que no ha sido ampliamente aceptado debido al riesgo de problemas de flujo de salida del hígado 11-14. Por lo tanto, favorecen un rápido enlazador asistida de tres manguito técnica sólo cuando los tiempos de isquemia caliente de menos de diez minutos se requieren. En la mayoría de los estudios sin embargo, las fases de implantación de hasta 15-18 minutos son aceptables, permitiendo el uso de la técnica de dos manguito, y un drenaje SHVC más fisiológico. Como se muestra en este documento de vídeo, de manera rutinaria utilizar el sistema rápido enlazador en la segunda parte de la implantación solamente. Mientras que algunos tiempo quirúrgico adicional es necesario para colocar las asas rápido enlazador, esta parte del procedimiento se asocia con riesgos mínimos y permite un acortamiento de la fase crítica, gracias a anhepática más fácil la inserción en los puños. Otras ventajas del sistema rápido enlazador son un mejor injerto-receptor alineación buque y el uso de amplios puños con mejores resultados hemodinámicos en comparación con eltécnicas descritas previamente (incluyendo el descrito por Kamada y col.) 6 (Fig. 7).

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

TC fue apoyada por la Swiss National Science Foundation (SCORE concesión 3232230 a 126233). El estudio fue apoyado por la Fundación Artères, la Europa de Astellas y la Fundación Boninchi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tool / Reagent Company Catalogue n. Comment
Portal cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1729 800/100/420 Bore : 1.55mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Infrahepatic v. cava cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1733 800/100/540 Bore : 2.40mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Common bile duct stent common 22G venflon    
7-0 silk ties georgetiemann.com 160-1226-7/0  
10-0 prolene ethicon.com    
9-0 prolene ethicon.com    
8-0 prolene ethicon.com    
Straight micro forceps s-and-t.net FRC-15RM-8  
Curved micro forceps s-and-t.net FRS-15-RM-8  
Dissection needle-holder s-and-t.net B-15-8.2  
Anastomosis needle-holder rumex.net 8-021T  
Micro clamps finescience.com 18055-03 6 x 1mm
Micro clamps applicator finescience.com 18057-14  
Suprahepatic v. cava clamp pharmap.ch 13.349.14  
Quick-Linker rings dltchiropody.co.uk PAR 10 modified scalpel blades
Quick-Linker approximator pharmap.ch UD-04-275 modified Kocher’s forcep

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References

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Comments

1 Comment

  1. Dear Professor/s

    Congratulations for an excellent paper and a very neat video of the procedure. It would have been even more remarkable with explanation and commentary while performing the procedures. While performing the procedure every word of an experienced surgeon is worth and it makes learning easy and minimizes mistakes.

    Sincerely

    Pramod Upadhyay
    National Institute of Immunology, New Delhi, India

    Reply
    Posted by: Pramod U.
    July 14, 2012 - 7:16 AM

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