Mikroarray'ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Published 12/17/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Denilen bir tekniği

Cite this Article

Copy Citation

Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays . J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bitki hücre duvarları fizyolojisi ve bitki gelişmesinde önemli bir rol oynar ve insan topluluklarının (örneğin tahta, kağıt, tekstil ve biyoyakıt endüstrisi) 1,2 için hammadde sağlamak heterojen glukanlardır karmaşık matrisler vardır. Bununla birlikte, bu bileşenlerin biyosentezini ve işlevlerini anlamada zorlu kalır.

Hücre duvarı glukanlardır kimyasal ve yapı taşları, glikozil kalıntılarının karmaşıklığı nedeniyle conformationally çeşitlidir. Bu formu çoklu pozisyonlarda bağlar ve halka yapısı farklı, izomerik ya da anomerik konfigürasyon, ve ek olarak, non-şeker artıkları bir dizi ile sübstitüe edilmiştir. Glukanıdır kompozisyonu hatta farklı hücre ve / veya doku tipleri veya tek bir hücre duvarı 3 alt alan adları değişir. Ayrıca, bunların bileşimi, aynı zamanda 1 geliştirme sırasında, ya da çevresel işaret 4 yanıt olarak modifiye edilir.

Ex2.000 genlerin cess Bitki hücre duvarlarının heterojen glukanlardır karmaşık matrisler Arabidopsis 5 hücre duvarı glukanıdır biyosentezi ve modifikasyonu yer alacağı öngörülmüştür olanlarıdır. Bununla birlikte, biyosentez genlerinin göreceli olarak az sayıda işlevsel olarak 4,5 karakterize edilmiştir. Genlerin çoğu zaman farklı olarak hücre tipleri 6 arasında, sık sık düşük seviyelerde ifade edilir çünkü karşıt genetik yaklaşım zordur. Ayrıca, mutant çalışmalar genellikle uygun hücre duvarı işlevi 7 korunmasını sağlamak için gen fazlalık veya telafi edici mekanizmalar tarafından engellenmiştir. Böylece yeni yaklaşımları hızla glukanıdır yapıların çeşitli karakterize etmek ve anlayış hücre duvarı biyosentezi ve modifikasyonu fonksiyonel genomik yaklaşımlar kolaylaştırmak için ihtiyaç vardır.

Monoklonal antikor (mAb) 8,9 Bitkilerde glukanıdır yapısı ve dağılımı belirlenmesi için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu dist tanımakpektinler, xyloglucans, xylans, mannans, glukan ve arabinogalactans gibi bitki hücre duvarının glukanlardır ana sınıfları, içinde bulunan inct epitoplar. Son zamanlarda bunların kullanımı bitki ve doku tipleri eşzamanlı 9,10,11 geniş bir yelpazede glukanlardır göreli bolluğu belirlemek için geniş çaplı tarama deneyler kadar uzatılmıştır.

Burada düşük reaktif ve numune hacimleri ile minyatür bir mikroarray platformu kullanarak ekranlı olması (100 sn) çoklu örnekleri sağlar Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) (Şekil 1 ve 2) 10,11 adlı bir mikroarray tabanlı glukanıdır tarama yöntemi sunuyoruz. Mikroarray üzerinde nokta işaretleri resmen glukanıdır epitop oluşumu hakkında yarı-nicel veri vermek için ölçülebilir. Bu yaklaşım karmaşık biyolojik sistemlerin 12 glukanıdır değişiklikleri izleme ve hücre duvarı kompozisyonları küresel bir bakış sağlamak için uygundur, özellikle önceki bilgilerif Bu kullanılamıyor.

Protocol

1. Doku Toplama ve Hazırlama

  1. Ilgi her doku için en az üç nüsha halinde bitki dokularının 100 mg taze ağırlık (10 mg kuru ağırlığının minimum) toplayın. Aşağıdaki adımları vejetatif doku hücre duvarı malzemesinin hazırlanması açıklanmaktadır. Depolama dokularının durumunda, un istenen nişasta enzimatik olarak daha önce 13 açıklandığı gibi hücre duvarı polimerlerin ekstraksiyon işlemine devam etmeden önce kaldırılır.
  2. 24 boru adaptörü kümeleri ve 3 mm tungsten karbid boncuklar (30 Hz, 2 x 30 saniye) ile, Qiagen TissueLyser II kullanılarak sıvı azot ile birlikte ince toz haline örnekleri homojenize edilir. Sadece birkaç örnek işleniyor Alternatif olarak, eğer bir havanda kullanılır.
  3. 10 ml plastik konik tüpler içine homojenatlarında aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 10 ml% 80 v / v etanol içinde homojenat yıkama ve 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteks hücre çeperi materyali hazırlanır.
  5. 3.500 x g'de santrifüjleyin ve supernatant atın. Süpernatant berrak olana kadar% 70 etanol, özellikle, klorofil içeren dokular için, ya da en az üç kez yıkama tekrarlayın.
  6. % 100 aseton ile son yıkama yapın ve gecede kurumasını bekleyin Alkol Çözünmeyen Kalıntı (AIR) içeren granül bırakın.
  7. Elek AIR ince, homojen toz elde etmek ve kötü, bazen homojenat kalır zemin partikülleri büyük kaldırmak için 0.4 mm 2 mesh ile örnekleri.
  8. Mikrotüpler, numunelerin karışım yardım etmek için bir 3 mm cam boncuk içeren her birine 10 mg AIR örnek tartılır.

2. Hücre Duvarı glukanlardır çıkarımı

  1. Pektinler ile ilişkili pektinler, ve polimer her bir örnek için 50 uM CDtA (pH 7.5), 500 ul ilave edilerek numune çıkarılır.
  2. Kısaca girdap boruları çözücü numune malzeme ile temas halinde olmasını sağlamak ve böylece 8 Hz, 3 saat boyunca TissueLyser ile karıştırılır.
  3. Dikkatle, 12.000 xg'de santrifüjleyin r4 ° C'de süpernatan ve mağaza kaydının silinmesi
  4. 13,000 x g hızında kalan herhangi bir çözücü, girdap ve santrifüj sulandırmak ve çıkarmak için de-iyonize su, 1 ml granül yıkayın. Pelet bozmadan bu adımı yineleyin ve sonraki adıma geçmeden önce tüplerin tüm sıvı kaldırmak.
  5. Çapraz bağlama glukanlardır ardışık olarak% 0.1 ile 4M NaOH ile 500 ul, kalan hücre duvarı peleti elde edilir adımlar 2.1 'de tarif edilen prosedür kullanılarak w / v NaBH4, - CDtA çıkarılması için 2.4. NaBH4 böylece polisakaritlerin soyulma baz engelleyen bir alkol ile polisakaritler azaltılması sonunda aldehit (ya da keto) grubu azaltmak için eklenir.
  6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatan tekrar çıkarılır, 4 ° C de depolanır ve peletlerin bir sonraki ekstraksiyon işlemine geçmeden önce de-iyonize su ile iki kere yıkandı.
  7. Isteğe bağlı bir adım olarak, bu tür selüloz gibi polimerlerin kalıntı, 500 ul cadoxen (% 31 v / v 1,2-diami ile ekstre edilmiştir2.4 - 2.1 adımlar açıklandığı gibi aynı prosedürü kullanarak 0.78 M CdO ile noethane). Alternatif olarak, kalan pelet mutlak selülozik içeriği Asetik / Nitrik testler (Tartışma bakınız) kullanılarak tespit edilebilir.

3. Baskı Mikroarray'ler

  1. Santrifüj süpernatantlar herhangi bir partikül madde kaldırmak için 13.000 xg'de hücre duvarı polimerleri ekstre içeren.
  2. Bir de polipropilen 384 numune doku tipi ve ekstraksiyon tipine göre düzenlenir Önceden tasarlanmış özel bir düzen kullanarak mikrotiter plaka içine her bir örnek 50 ul yükleyin.
  3. Deiyonize su ile 0, 5 ve 25 × seri dilüsyon serisi hücre duvarı polimer örneği seyreltin.
  4. Böyle pin yüksekliği, toplama ve bekleme süresi, ve yıkama adımları gibi parametreler microarrayer kontrol yazılımı ayarlanır.
  5. Baskı bölmesinin nem örnek buharlaşmasını önlemek için% 60 kontrol edilir.
  6. Yazdırma işi LabNEXT softwa ile başlatıldığıyeniden ve mikroarray düzeni karşılık gelen bir program.
  7. Robot makine düz bir levha üstüne tutturulmuş 20 x 20 cm nitroselüloz membran üzerinde numune plaka çözümleri yazdırmak için kılcal kanal işaretçilerine kullanır. Dizisindeki her nokta çözümü 15 nl içerir ve üç nüsha halinde basılır.
  8. Yazdırma işi tamamlandıktan sonra Özdeş mikroarrayler Tek tek dizileri içine membran ve kesim birbirlerine yanında yazdırılır.
  9. Her bir deneyde, diziler daha fazla ya da daha az örnekleri, seyreltici ya da çoğaltır yerleştirmek için modifiye edilebilir.

4. Glukanıdır Mikroarray'ler arasında Sondalama

  1. Baskıdan sonra, spesifik olmayan bağlayıcı azaltmak için fosfat içinde çözüldü ağırlık / hacim kaymağı alınmış süt tozu 2 saat boyunca oda sıcaklığında (Mpbs) tamponlu tuzlu su içinde% 5 bireysel mikrodizileri bloke eder.
  2. Mpbs içinde 2 saat için hücre-duvar glikan epitoplar için spesifik monoklonal antikorlar ile Sondası mikrodizileri. Monoklonal antib çoğunluğuHücre duvarı glukanlardır karşı odies üç firmalardan ticari olarak temin edilebilirler; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Hizmetleri ( www.carbosource.net ) ve PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. Bir negatif kontrol, sadece Mpbs ve birincil antikor ile birlikte inkübe bir mikro içerir.
  4. Fosfat içinde 3 kez spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için (PBS), tamponlu tuzlu su mikrodizileri yıkayın.
  5. 2 saat için Mpbs içinde yabanturpu peroksidaz (HRP) konjuge sekonder antikor ile mikrodizileri kontrol edin. Hücre duvarı glukanlardır karşı en monoklonal antikorlar, anti-fare veya anti-sıçan sekonder antikor gerektirir.
  6. Spesifik olmayan bağlanma kaldırmak için 5 dakika için 3 kez PBS tamponu ile yıkama adımları tekrarlayın.
  7. Kromojenik (3,3-diaminobenzidin) ya da chemil kullanılarak mikrodizileri geliştirmekuminecent (luminol) yüzeyler.

5. Niceleme

  1. Kalkınma sonra, yüksek çözünürlüklü (1200 dpi) masaüstü tarayıcı kullanarak bireysel mikroarrayler taramak ve negatif, 16 bit TIFF dosyaları (Şekil 3) olarak kaydedin.
  2. Otomatik ızgara aracı ile donatılmış Görüntü İşleme Yazılımları (LabNEXT) Xplore kullanarak her nokta ayrılmaz yoğunluğunu hesaplayın. Tamamlayıcı nokta yoğunluğu her bir nokta çevreleyen ızgara alanı içinde piksellerin toplamı elde edilir.
  3. Her mikroarray için grid veri bir txt dosyası olarak ihraç edilir ve manuel analizi için bir Excel elektronik tablo içine alınabilir. Bir çevrimiçi araç ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) otomatik olarak tercüme ve bireysel txt dosyalarından veri işlemek için geliştirilmiştir.
  4. İntegral nokta yoğunluğu baskı çoğaltır genelinde ortalama bir 'ortalama bir nokta elde etmek dilüsyonları edilirHer numune için yoğunluk 'değeri (Şekil 2). Alternatif olarak, bir dizi üzerinde sadece tek bir seyreltme değerine karşılık gelen nokta sinyaller her bir numune için göreli bolluk glikan epitop ölçmek için kullanılır.
  5. Farklı numuneler arasındaki göreceli ortalama nokta yoğunlukları excel veya çevrimiçi heatmapper araçları (koşullu biçimlendirme kullanarak bir heatmap (Şekil 4) olarak sunulmaktadır http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Her antikor tipi için veriler 100 düzeltilir ve% 5 eşik değeri arka sinyal ve yanlış pozitif kaldırmak için uygulanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nicotiana alata çiçeklerden altı doku tipleri (anter filamentler, polen, yumurtalıklar, yaprakları, sepals ve stigma) olarak glukanlardır göreli bolluğu CoMPP kullanılarak belirlendi. Şekil 3A kısmen (düşük) methylesterified homogalacturonan (HG), pektik polisakkaritler 14 oluşur bir epitopu için mAb JIM5 özel ile probed edilmiş bir temsilcisi mikroarray gösterir. JIM5 epitopunu çiçek dokuların CDtA özleri algılanırsa ancak mercek dokusu (Şekil 3A ve 4A) polen ve en düşük en yüksek olduğu. İlginç bir şekilde, JIM5 epitopu da polen içinde NaOH özler tespit edilir, ancak diğer dokularda (Şekil 3A).

Ilgi çekici bir glikan oluşumu ile ilgili kantitatif bilgi mikrodizi üzerinde dahili standartlar (Şekil 3B) gibi polisakkaritler saflaştırılmış da dahil olmak üzere, bir dizi ile elde edilir. Farklı t özler İntegral nokta yoğunluğu mAb JIM5 ile probed sorunları homogalacturonan bir seri seyreltme (metil esterleşme% 25 derecesi, DE) türetilen nokta işaretleri ile eşleştirilir. Over dokusu içinde, JIM5 epitopu içeren homogalacturonan yaklaşık 157 mikrogram toplam hücre duvarı kalıntıları (Şekil 3C) yaklaşık% 1.5 (ağırlıkça) için muhasebe, her örnek mevcuttu. JIM5 epitopu içeren 625 mikrogram homogalacturonan toplam hücre duvarı kalıntısı yaklaşık 6.25% (ağırlıkça) için muhasebe, polen doku mevcuttu oysa.

15 glikan epitopunun nispi bolluk Şekil renk çubukların yoğunluğu her bir numune için düzeltilmiş ortalama nokta yoğunluğu ile orantılıdır 4 içinde bir ısı haritası olarak özetlenmiştir. Bu verilerin bir resimle sunulmasını ayrıca Şekil 5'te gösterilen ve bize hızla farklı bitki dokuları arasında glikan epitop bir oluşum içinde farklılık yorumlamak için izin verir.

ontent "> Bu çalışmanın sonuçları, ayrı epitoplar glikan benzersiz bir şekilde N alata çiçek dokusu arasında dağıtılmıştır işaret etmektedir. Örneğin, LM13 epitopu ((1-5)-α-L-arabinan 15 linearised) anter filamentler ve çanak yaprağı dokularda en bol diğer dokularda (Şekil 5D) ile karşılaştırılmıştır. Bu desen, daha kısa zincirli (1-5)-α-L-arabinan tercihen mAb LM6 (Şekil 5E) 15 tarafından algılanır epitopları. çapraz bağlama glukanlardır bu çarpıcı biçimde tersine olduğu da farklı olması N. alata çiçekler oluşumu desenler. LM10 epitopu (düşük-ikameli (1-4)-β-D-ksilan), diğer dokulara kıyasla leke dokusunda bol olan, fakat yumurtalık doku (Şekil 5G) yoktur. LM15 heteromannans (Şekil 5J) Anter filamentler yüksek iken xyloglycan epitoplar, petal ve anter filament diğer dokular (Şekil 5H) ile karşılaştırıldığında en yüksek olduğu.


Şekil 1. Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) arasında beş temel adımı temsil basitleştirilmiş bir akış şeması.

Şekil 2,
Şekil 2. Kapsamlı Mikroarray Polimer Profiling (CoMPP) en önemli adımlardan bir illüstrasyon. (A) Bitkisel dokular, çoğaltır üç olarak toplanan homojenize ve% 70 EtOH ve alkol çözülmeyen artıklar (AIR) yapmak için aseton yıkanır. (B) Hücre duvarı glukanlardır ardışık olarak 50 mM CDtA ve 4 M NaOH ile hava örnekleri elde edilir. (C) Çıkarılan hücre duvarı glukanlardır bir mikroarray robot kullanarak nitroselüloz yazdırılır. Her bir numune, üç konsantrasyonda ve dört kopya baskı, bir dizi olarak temsil edilirtes. (D) baskılı diziler hücre duvarı glukanlardır epitoplarını yönelik mAb'li ayrı ayrı probed vardır. (E) Spot sinyalleri txt dosyaları ve bağıl ortalama nokta yoğunluk değerlerini otomatik olarak bir online veri işleme aracı kullanılarak hesaplanmaktadır olarak ihraç mikroarray görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçülür.

Şekil 3
Nicotiana alata çiçek dokuların Şekil 3. Glukanıdır profilleme. (A) bir temsilci mikrodizi monoklonal antikor (mAb) homogalacturonan için spesifik JIM5 (kısmen, düşük methylesterification) ile sondajlanan bir negatif, 16-bit TIFF dosyası olarak belirtilir. (B) ilgi glukanıdır epitopu içeren polisakkarit miktarı polisakkarit standartları bir dizi baskı ile belirlenebilir. (C) ilgi örnek İntegral nokta yoğunluğu mAb tarafından probedJIM5 hesaplanır ve örnek bu epitopu içeren polisakkarit miktarı (mikrogram) tahmin etmek için bir standart eğri ile eşleştirilir.

Şekil 4,
Şekil 4,. Nicotiana alata çiçek dokusu glikan profil bir ısı haritası olarak temsil edilmiştir. Renk yoğunluğu göreceli ortalama nokta kimlik değeri (scale bar) ile orantılıdır. Monoklonal antikorlar (en üstünde listelenen) tarafından tespit edilen 15 glukanıdır epitopların Bağıl bolluk CDtA ve NaOH (sol taraf) ile ekstre altı doku tipleri için analiz edildi. Pektinler, glukanlardır ve Arabinogalaktan proteinler (AGPS) çapraz bağlama; glukanıdır epitopların polisakkaritler üç geniş sınıfa ayrılırlar. Bana, metil-esterleşme; DP, polimerizasyon derecesi; mAb, monoklonal antikorlar; AGP, Arabinogalaktan-protein.


Nicotiana alata çiçek dokusu Şekil 5,. Glikan profil pictorially temsil etmektedir. AL farklı bitki dokularında mAb ile saptanan 12 glikan epitopunun nispi bolluk temsil eder. Skala çubuğu renk yoğunluğu CDtA veya NaOH ekstreleri ya da her ikisi de bir miktar ya da elde edilen göreceli ortalama leke kimlik değeri ile orantılıdır. Bana, metil-esterleşme; DP, polimerizasyon derecesi; mAb, monoklonal antikorlar;. AGP, Arabinogalaktan protein büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CoMPP birkaç gün içinde yüzlerce bitkisel kaynaklı numunelerin glukanıdır kompozisyonu profilleme için hızlı ve hassas bir yöntemdir. Bu yöntem, lektinler, reseptörleri ve antikorları 16 gibi glukanıdır-bağlayıcı proteinler ile karbohidrat etkileşimleri yüksek verimli tarama zaten mevcut bakteriyel veya memeli glukanıdır dizi platformlar tamamlar. Hücre duvarı glukanlardır tespit etmek için kullanılabilir probları geniş bir çeşitliliği ile, bitki hücre duvarı 8,9 polisakkaritlerin tüm ana sınıfa ait glikan epitoplar ile ilgili ayrıntılı bilgiler elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu 8,9 tespit edilmiştir glikan yapıların sadece küçük bir bölümü kapsamaktadır, ve bazı durumlarda CoMPP anlaşılabilirliği sınırlar. Bununla birlikte, bu özelliği son zamanlarda bitki glukanlardır 17 karşı karbonhidrat bağlayıcı modüllerin kullanımı (GAÖ) tarafından genişletilmiş ve aynı zamanda non-glikozil res ile karakterize epitoplara olmuşturBöyle glikozil artıkları değiştirebilir ve glukanıdır işlevi önemli bir rol oynamaktadır fenolik 18 ve asetil artıkları 19 olarak idues.

CoMPP örnek bir kümesi boyunca glukanlardır nispi seviyeleri tespit olmasına rağmen, bilinen standartların (Şekil 3B ve C), ki için spesifik örnekler olarak bağlayıcı sinyalinin karşılaştırılması ile ardışık özler, epitop seviyelerini ölçmek mümkündür. Bir mikroarray tabanlı platform azaltılmış numune hacimlerinin avantajlara rağmen, doğru glukanıdır oluşumu ölçmek yeteneği nokta sinyalinin nokta morfolojisi veya doygunluk farklılıklar tarafından engellendiği edilebilir. Bu sorunlar (yanı false positive gibi) analiz öncesi, hücre duvarı maddesi ayet ekstrenin hacmi miktarının optimize ve bir dizi burada ve memeli glukanıdır dizi yöntemleri 16 özetlenen çoğaltır ve dilüsyonları dahil önlenir. Ayrıca, spot morfoloji farklılıkları (numunelerin difüzyon nedeniyletemas noktasını farklı oranlarda) temassız mürekkep püskürtmeli mikroarray teknolojisi 16 kullanılarak aşılabilir.

CoMPP hücre duvarlarının 20 izolasyonu ve hazırlanması için belirlenmiş prosedürleri ile kombinasyon halinde kullanılır. Aynı zamanda, ilgi örneklerindeki glikan içeriği ile ilgili daha fazla bilgi elde etmek için mevcut biyokimyasal, enzimatik ve fiziksel yöntemler ile paralel olarak kullanılabilir. Bunun yerine selülozik polimerler, asetik / nitrik asit testleri çıkarma Örneğin 20 pektin ve CDtA ve NaOH ile çapraz bağlama glukanlardır sıralı özütleme sonra kalan selüloz miktarı (mg) ölçmek için kullanılabilir. Glukanıdır microarrays 21 Enzim tedavisi de örnekleri arasındaki glukanıdır epitop dağıtımı de farklılıklar ortaya veya mikroarray tespit epitoplarının yapıların özgüllüğü onaylayabilirsiniz. Böyle son açıklanan bağımsız analitik teknikler ile glukanıdır bileşiminin belirlenmesi

Biz glukanlardır N. bir organ veya doku belirli bir şekilde dağıtılır olduğunu göstermek alata çiçekler. Bu bilgiler glukanıdır epitoplar veya glukanıdır bu farklı hücre tiplerinde bulunan enzimler sentez veya değiştirme biyolojik işlevi hakkında fikir verebilir. CoMPP önceden geliştirme 23,24 sırasında veya mutasyon 10,25 yanıt tipi 22 bitki ile ilgili olarak ortaya hücre duvarı değişiklikleri içgörü sağladı. Özetle, CoMPP için değerli bir araçtır glukanlardır ve bitki hücre duvarındaki glukanıdır sentezleme ve değiştirme genlerin farklı rolünü araştırdı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

IEM finansman Danimarka Araştırma Konseyi (FTP ve FNU) kabul etmek istiyorum. ERL bir ARC DP hibe desteği kabul etmektedir. AB Bitki hücre duvarları hibe Mükemmellik ARC Merkezi'nin desteği ile hazırlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Tungsten Carbide beads Qiagen 69997
Collection microtubes (1.2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml microfuge tubes can also be used
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 mm glass beads Sigma Aldrich Z143928
CDTA Sigma Aldrich 34588
Cadmium oxide Sigma Aldrich 202894
1,2-diamin–thane Sigma Aldrich 03550
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) GE-water process technologies EP2HY00010 different pore sized membranes are suitable for different pin types
Xact II microarrayer robot Labnext 001A the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached
Xtend RM microarray pins Labnext 0037-350 pins must be suitable for spotting on membranes
384 well microtiter plates (polypropylene) Greiner 781207
Anti-glycan monoclonal antibodies Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. Sigma A9037 the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc).
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293 the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermoscientific 34080 see above
Xplore Image Processing Software LabNext 008 many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots.
Plant polysaccharides Sigma/Megazyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6, (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54, (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats