El efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en

Immunology and Infection

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Summary

Se demuestra que un dispositivo biomédico desarrollado que implica el tratamiento basado en láser visible continuo o pulsado que se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina), da como resultado un efecto sinérgico estadísticamente significativa que conduce a una reducción en la viabilidad de los

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Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Polak, P., Zalevsky, Z. The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms. J. Vis. Exp. (77), e4370, doi:10.3791/4370 (2013).

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Abstract

Recientemente hubo varias publicaciones sobre el efecto bactericida de la luz visible, la mayoría de ellos afirmando que parte azul del espectro (400 nm-500 nm) es responsable de matar a varios patógenos 1-5. El efecto fototóxico de la luz azul se propuso ser el resultado de las especies reactivas de oxígeno inducidas por la luz (ROS) de formación de fotosensibilizadores bacterias endógenas que en su mayoría absorben luz en la región azul 4,6,7. También hay informes de efectos biocidas de infrarrojos y zona de Red 8, así como la luz verde 9.

En el presente estudio, hemos desarrollado un método que nos ha permitido caracterizar el efecto de la luz Q-switched continua (CW) y pulsada (QS) de alta potencia verde (longitud de onda de 532 nm) de Pseudomonas aeruginosa. El uso de este método también estudiamos el efecto de la luz verde se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina) en la viabilidad de las bacterias. P. aeruginosa es de corriente alternaommon noscomial patógeno oportunista que causa diversas enfermedades. La variedad es bastante resistente a varios antibióticos y contiene muchos predijeron tipo Mex AcrB / RND a múltiples sistemas de flujo de salida 10.

El método utilizado fase bacterias Gram-negativas estacionarias de vida libre (cepa P. aeruginosa PAO1), cultivadas en caldo Luria (LB) expuesto a la conmutación de Q y / o láseres de CW con y sin la adición del antibiótico gentamicina. La viabilidad celular se determinó en diferentes puntos de tiempo. Los resultados obtenidos mostraron que el tratamiento con láser solo no redujo la viabilidad celular en comparación con el control no tratado y que el tratamiento con gentamicina sola sólo dio lugar a una reducción de 0,5 log en el recuento de viables para P. aeruginosa. El láser combinado y tratamiento con gentamicina, sin embargo, dieron lugar a un efecto sinérgico y la viabilidad de P. aeruginosa se ​​redujo en un 8 registro de.

El método propuesto puede ser más implementado a través del desarrollo de catéter como dispositivo capaz de inyectar una solución de antibiótico en el órgano infectado, mientras que al mismo tiempo que ilumina la zona de luz.

Protocol

1. Cultura bacteriana

  1. P. Gram-negativas aeruginosa cepa PAO1 se cultivaron en caldo Luria (LB) a 37 ° C durante 18 hr.
  2. El cultivo de células se centrifugó a 7.500 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 min y el sobrenadante se eliminó.
  3. Las bacterias se resuspendieron en 10% LB y volver a crecer durante otras 2 h para permitir la cultura para volver a entrar fase estacionaria.
  4. La suspensión de bacterias se dividió entonces en dos grupos: en el primer grupo (2 tubos) se añadieron ningún antibiótico, en el segundo grupo hemos añadido el antibiótico gentamicina (50 mg / ml).

2. Determinación de unidades formadoras de colonias (UFC)

  1. Para determinar la viabilidad celular 20 l se tomaron muestras a partir del experimento aproximadamente cada 2 horas dentro del marco de tiempo de 24 horas. Dilución en serie de las muestras se hizo y se sembró en placas de agar LB y se incubó durante la noche a 37 ° C.
  2. Para cada tratamiento, las UFC por plataformae se determinó y se hizo una comparación entre los períodos de tiempo y diversos tratamientos. La reducción log en UFC se calculó como se describe en la ecuación. (1):
    Iniciar reducción = Logu-logC [UFC / ml]
    Donde U es el valor de unidades formadoras de colonias en cada punto de tiempo; UFC es la unidad formadora de colonias, mientras que las unidades de UFC / ml igual a:
    UFC / ml = (número de colonias x factor de dilución) / (volumen inoculado)
    Y C es el UFC encontrado en la muestra de control en el tiempo de inicio. Tenga en cuenta que U designa el factor de formación de colonias en el instante de medición.
  3. El factor de dilución es el número de diluciones, mientras que en cada uno de ellos la concentración de las bacterias se redujo por un factor de 10. El volumen inoculado fue siempre 200 litros micro y está relacionado con el tamaño de nuestra tubo de ensayo.

Por lo tanto, para resumir el punto de vista de la concentración, el antibiótico gentamicina fue a una concentración de 50 g / ml. En cuanto a las bacterias, hasta el final deel proceso que tuvo en general 8 diluciones. Cada dilución fue en un factor de 10 y se hizo en tubos de 200 l. El punto de partida fue 20 l de muestras añadido en el tubo 200 l (y por lo tanto la concentración inicial era 20/200C 0 0.1C0 con C = 0 es la concentración inicial en la 20 l de muestras) y la concentración final fue reducido en un 8 órdenes de magnitud debido a las 8 diluciones.

3. Iluminación

  1. CW láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm y potencia óptica media de 200 mW) se dividió en dos trayectorias ópticas usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm. El tiempo de exposición fue de 24 horas.
  2. Q-switched pulsos láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm, potencia media de 300 mW y potencia de pico óptica de 2,5 MW) también se dividió en dos caminos usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro de la mancha era de 6 mm. El ancho de pulso del láser de conmutación de Q fue de 6 ns y la tasa de repetición era 15Hz. Ladensidad de potencia promedio fue de 106 mW / cm 2 y la densidad de potencia pico fue de 8,83 kW / mm 2. El tiempo de exposición fue de 24 horas.

Tenga en cuenta que la suspensión bacteriana se agitó durante la irradiación y se mantuvo bajo condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento bacteriano (en todos los tubos no había medio de Caldo Luria para permitir que las bacterias crezcan).

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Representative Results

La configuración basada en láser se presenta esquemáticamente en la Figura 1. La primera condición experimental utiliza un CW láser de Nd: YAG que tiene longitud de onda de 532 nm (el segundo armónico de la Nd: YAG) y la potencia óptica media de 200 mW. Este haz se divide en dos trayectorias ópticas usando 50% / 50% divisor de haz óptico de tal manera que cada haz dividido tenía potencia de 100 mW. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm y por lo tanto la densidad de potencia fue de 100 mW / cm 2. El tiempo de exposición fue de 24 horas. Aunque la potencia de iluminación es relativamente alta, no es lo suficientemente alta como para provocar el calentamiento de la muestra.

La segunda condición experimental utilizado un láser pulsado de Nd Q-switched: YAG que tiene longitud de onda de 532 nm (segundo armónico) y diámetro de punto de 6 mm. La potencia media de 300 mW y la potencia máxima óptica de 2,5 MW. El ancho de pulso del láser de conmutación de Q fue de 6 ns y la tasa de repetición era 15Hz. Este rayo también se dividió en dos caminos usando óptico50% / 50% divisor de haz. La densidad de potencia promedio fue de alrededor de 100 mW / cm 2 y la densidad de potencia máxima fue de 8,83 kW / mm 2. Esta densidad de potencia de pico es equivalente a la energía de la fluidez de 88,3 μJ / 2 mm por impulso, ya que cada pulso fue de 10 nanosegundos de largo en el dominio del tiempo. El tiempo de exposición fue de 24 horas. Ambos experimentos se llevaron a cabo bajo condiciones de crecimiento similares a la exposición sin luz (es decir, con y sin gentamicina), que sirvió como control.

En las figuras 2 (a) y 2 (b) el efecto obtenido debido a la iluminación de las muestras con luz láser CW y con Q-switched láser respectivamente con y sin antibiótico sobre P. se presenta aeruginosa.

En las muestras que no fueron expuestos a la luz (es decir, el control) no hubo una reducción en la viabilidad celular con o sin tratamiento con gentamicina. Este resultado sugiere que las bacterias son resistentes a la gentamicina tratamiento, imitandola situación a menudo se encuentra en la clínica.

La luz del láser por sí sola también no indujo ningún asesinato tampoco. Sin embargo, la combinación de la luz láser y gentamicina reduce bacterias viabilidad en varios órdenes de magnitud. El efecto más destacado se midió después de 24 horas en el que la combinación de cualquiera de CW o Q-switched láser reduce la viabilidad de 8 órdenes de magnitud en comparación con las mediciones obtenidas en el grupo de control (antibiótico solo o luz sola).

Este es un resultado importante que puede sugerir una solución de tratamiento para este tipo de bacterias resistentes a los antibióticos. El hecho de que se requieren varias horas con el fin de obtener la destrucción eficaz de las bacterias no reduce el potencial clínico de este enfoque, dado que el tratamiento propuesto puede incorporarse en los catéteres y otros dispositivos utilizados en el hospital. Por ejemplo en la Figura 3 se presenta un ejemplo de un catéter diseñado en el que en Ademásción para el canal de inyección de líquido que hay pluralidad de orificios que permiten difundir simultáneamente iluminación adecuada en el órgano infectado.

El número de muestras utilizadas para las estadísticas fue de 6 (había uno o dos casos de algunos de los tubos que fueron contaminadas accidentalmente y luego fueron sacados de las estadísticas). El valor p fue inferior a 0,05.

Tenga en cuenta que nosotros no repetimos nuestros experimentos para diferentes niveles de concentración de los antibióticos. En todos nuestros experimentos la concentración era muy alta. La razón de esto era demostrar mejor la fuerza de nuestro enfoque como en la más alta concentración de la bacteria aún no se ven afectados de los antibióticos sin iluminación y se destruyó con la iluminación, es obvio que suceder para que las concentraciones más bajas.

Una de las razones para la elección de la longitud de onda de iluminación, fue seleccionar una longitud de onda para la que la bacteriuriaa y los antibióticos son transparentes. Esto se demuestra en la Figura 4. Motivación adicional para el uso de la longitud de onda de 532 nm láser era debido a su disponibilidad en nuestro laboratorio y por el hecho de que nos permitió también para obtener una mayor potencia de iluminación (en comparación con fuente de luz blanca regular con filtros espectrales), así como para la capacidad de sintonización de energía y para el comportamiento temporal de la iluminación.

Figura 1
Figura 1. . Las bacterias configuración de iluminación El láser era o bien CW láser Nd: YAG Q-switched o pulsos láser de Nd: YAG. A la izquierda se puede ver la imagen de la configuración experimental en la que el láser se divide entre dos tubos, uno con antibióticos y uno sin él, con el fin de iluminar tanto de ellos en condiciones idénticas. Ambos tubos son la posición ed en un agitador. Boceto esquemático de la configuración experimental se ve en la parte derecha de la figura.

La figura 2
Figura 2. (A). Efecto de CW-láser y gentamicina sobre P. aeruginosa. Las muestras se iluminaron con una luz láser CW (potencia de 100 mW) con y sin gentamicina (50 mg / ml). Se presenta la media de 3 experimentos. (B). Efecto de la Q-switched láser y gentamicina sobre P. aeruginosa. Las muestras se iluminaron con conmutación de Q de luz láser (1,65 MW) con y sin gentamicina (50 mg / ml) sobre P. viabilidad aeruginosa. Se presenta la media de 3 experimentos.

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Figura 3. El dispositivo basado en catéter propuesto para el tratamiento biomédico frente a P. aeruginosa. Los puntos en la figura representan los puntos de dispersión de la luz causando que la luz se difunda en el tejido tratado.

Figura 4
Figura 4 El espectro de absorción (en au) alrededor de longitud de onda de 532 nm para:. (A). Las bacterias, (b). La gentamicina. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Discussion

La fototerapia ha sido un campo de investigación multidisciplinar avanzado en los últimos años emergentes como un enfoque prometedor para el tratamiento de numerosas enfermedades. En este contexto, el uso de la luz en el rango visible ha sido ampliamente estudiado. Por ejemplo, se ha encontrado que las heridas infectadas pueden ser curadas con mayor eficacia mediante la exposición a la luz visible intensa para fines de esterilización. El mecanismo de acción de este enfoque ha demostrado ser a través de la inducción de radicales de oxígeno inducidas por la luz (ROS) que matan las bacterias 11.

Estudios previos han demostrado 6 cantidades mucho mayores de ROS en bacterias iluminadas con luz azul que los inducidos por la luz infrarroja de color rojo y cercano. Esto explica por qué la mayoría de la evidencia en la literatura se centra en el efecto bactericida de la luz azul.

Otro ejemplo reciente del uso de la luz láser para combatir las bacterias resistentes se demostró por Krespi et al. 12. En ese láser estudio se utilizó la tecnología de onda de choque generada para erradicar las biopelículas. Mediante el uso de una miniatura Q-switched Nd: YAG y fibras finas, sondas especiales generados formación de plasma que produce efecto onda de choque. Los autores mostraron que este método era capaz de perturbar efectivamente P. biopelículas aeruginosa in vitro.

El enfoque que hemos presentado en este estudio fue un tanto diferente 13 como se intentó aumentar la eficacia del agente antimicrobiano no fotosensibilizador con luz láser. Nuestros resultados sugieren que mediante la combinación de tratamiento antibiótico con la iluminación, la actividad antimicrobiana se puede aumentar de forma espectacular.

De hecho, a partir de un fenotipo completamente resistentes, observado en el antibiótico solo las bacterias se convirtieron en sensibles en presencia de tratamiento con antibióticos y la luz. El mecanismo de acción de este efecto no es claro y se requieren más invesde iones. Sin embargo, en las mediciones de resonancia de electrones paramagnéticos (EPR) que hemos llevado a cabo para examinar si ROS se genera durante el tratamiento, se obtuvo una diferencia significativa entre los diferentes tratamientos 13. Estos resultados sugieren que el efecto del tratamiento combinado no implica la producción de ROS y diferentes mecanismos tienen que ser considerados. Puede ser la hipótesis de que el tratamiento de la luz cambia la permeabilidad de la membrana y, finalmente, permite a los antibióticos para penetrar en la célula de las bacterias produciendo su muerte.

Aunque el mecanismo de operación no está totalmente explorado, nuestro enfoque resaltar el potencial de la terapia combinada de la luz con antibiótico comercial que puede haber sido desechado debido a la resistencia antimicrobiana, mientras que mediante la aplicación de esta combinación ahora se puede reutilizar eficazmente en las clínicas.

Obviamente, como se ha señalado en el manuscrito, se necesita la iluminación de varias horas con el fin de linea Hance la eficacia de los antibióticos. Este es de hecho un inconveniente del enfoque propuesto. La realización de este tipo de iluminación se puede conseguir por ejemplo mediante la instalación de la fuente de iluminación en el interior de los catéteres (tal como se propone en la Figura 3). Además de eso, si la herida es externa especial de bandas como el yeso, con fuente de iluminación se puede poner en la parte superior de la herida y se ilumine durante varias horas, por ejemplo, mientras el paciente está durmiendo en la noche. Si la infección es interno y el paciente es hospitalizado y que él / ella está conectada a la bolsa de infusión durante varias horas, para algunos órganos de un canal de iluminación tal como un endoscopio o una fibra especial puede ser abordado al órgano y constantemente se ilumine (con la aplicado el tratamiento con antibióticos), mientras que el paciente es hospitalizado (exactamente como la bolsa de infusión está conectada a la paciente durante muchas horas). Estamos totalmente de acuerdo en que el enfoque no es bueno para el tratamiento de órganos generalmente infectadas.

nt "> Tenga en cuenta que en este manuscrito se presenta la ventaja de la técnica propuesta para la aplicación rápida y práctica, pero con el fin de lograr este otros estudios son necesarios, tales como en los experimentos in vivo. El estudio de toxicidad en fibroblastos o células epiteliales será útil, así ya que se requieren los estudios que demuestran el mecanismo de la terapia propuesta en las células bacterianas. Además, en este trabajo se ha planteado la hipótesis de que los cambios inducidos por la luz de la membrana bacteriana que lo hicieron más permeable a los antibióticos. Obviamente, las cosas serán diferentes en una . clínica donde las infecciones bacterianas se deben a biofilms Luego hay dos grandes problemas:. bacterias biofilm será más resistente en comparación con sus homólogos planctónicas y la penetración de los antimicrobianos en la masa de biofilm estará limitada tanto, la exploración de los efectos de la luz y gentamicina en un modelo de biopelícula P. aeruginosa es el objetivo de nuestro trabajo futuro.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lauria Broth Difco 241420
Gentamycin Sigma G1914
Bacto Agar Difco 231710

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