Hippocampale Insulin Mikroinjektion og

JoVE Journal
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Modulation af hippocampally-afhængig rumlig arbejdshukommelse ved direkte intrahippocampal mikroinjektion, ledsaget og efterfulgt af

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McNay, E. C., Sandusky, L. A., Pearson-Leary, J. Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing. J. Vis. Exp. (71), e4451, doi:10.3791/4451 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Glucosemetabolisme er en nyttig markør for lokal neural aktivitet, danner grundlag for metoder såsom 2-deoxyglucose og funktionel magnetisk resonans billeddannelse. Dog er brug af sådanne metoder i dyremodeller kræver anæstesi og dermed begge ændrer hjernen tilstand og forhindrer adfærdsmæssige foranstaltninger. En alternativ fremgangsmåde er anvendelsen af in vivo mikrodialyse at tage kontinuerlig måling af hjernen ekstracellulære væske koncentrationer af glucose, lactat og beslægtede metabolitter i vågen, uhæmmede dyr. Denne teknik er især nyttig, når den kombineres med opgaver, der skal basere sig på specifikke hjerneregioner og / eller akut farmakologisk manipulation, for eksempel, viser hippocampale målinger under en rumlig arbejdshukommelse opgave (spontan vekslen) et fald i ekstracellulær glucose og stigning i lactat, der er tyder på øget glykolyse 1,2, og intrahippocampal insulin administration både forbedrer hukommelsen og øger hippocampus glycolradiokemiske analyser 3. Stoffer såsom insulin kan leveres til hippocampus via samme mikrodialysesonde anvendes til at måle metabolitter. Brugen af spontan vekslen som et mål for hippocampus funktion er designet til at undgå enhver forvirre fra stressende motivatorer (f.eks fodchok), tilbageholdenhed, eller belønninger (fx fødevarer), som alle kan ændre både opgaveløsning og stofskifte, denne opgave giver også en måling af motorisk aktivitet, der tillader kontrol for ikke-specifikke virkninger af behandlingen. Kombineret, disse metoder tillader direkte måling af de neurokemiske og metaboliske variabler regulerer adfærd.

Protocol

1. Kirurgi Forberedelse

  1. Håndtering. Dyr (mest almindeligt, rotter eller mus, selv om metoden for mikrodialyse og kombination med adfærdsmæssige test er i vid udstrækning tale om en generel enhver krævede artsspecifikke behov tilpasninger, fx til anæstesi) håndteres i mindst 10 min / dag i mindst to dage før kirurgi. Omfattende behandling har vist sig at efterlade dyr i en ubelastet tilstand på tidspunktet for afprøvning og undgå eventuel forvirre 2,4,5. Vi vil bruge rotter i hele denne protokol som eksempel art. Håndtering skal ske uden stress forårsaget ved at trække i pels fra f.eks latex eller nitril-handsker: dette kan bedst opnås ved hjælp af bare hænder i samråd med anlægget dyrlæge og medarbejdernes sundhed embedsmænd. Hvis dette ikke er muligt, bør blød bomuld handsker bæres over barriere handsker for at undgå at trække i rotternes pels.
  2. Sterile område Forberedelse. Forud for påbegyndelse kirurgi, Surgical area fremstilles, et sterilt område fremstillet omkring den stereotaktisk apparat og et sterilt afdækningsstykke placeret på tværs af apparatet, der omfatter en varmepude, der bruges til at opretholde rotte kropstemperatur. En cirkulerende varmt vand pad med nøjagtig termostaten anvendes til at forhindre overophedning af dyret.
  3. Anæstesi induktion. Den isofluran vaporizer kontrolleres til at indeholde optimale niveauer af isofluran og forbundet til induktion kammeret. Forbindelser er kontrolleret for at bekræfte en lukket sløjfe. The air-håndtering vakuum systemet kontrolleres for at være operationel. Isofluran fordampning er tændt, og dyret anbringes i induktionskammer under anvendelse af en 5% isofluran i oxygen mix: det vil sige, 5% isofluran tilsat i en strøm af 100% oxygen og leveret til induktion kammeret.
  4. Anbringelse i apparatet. Dyr er fastgjort i stereotaktisk apparat med earbars og en tand bar. Korrekte earbar placering resulterer i en ubevægelig hoved og ører, der ligger fladt langs earbars. Dyrhurtigt fastgjort og næsen indsat i en specialdesignet anæstetikum næsekegle, levering af fordampet isofluran er slået fra induktionskammer til Næsekeglen og bedøvelsesmidlet blandingen indstillet til at afgive 2-3% isofluran i oxygen strømmen går til Næsekeglen.
  5. Bekræftelse af anæstesi. En kirurgisk anæstesi plan bekræftes ved at levere en hård knivspids til foden og et pust af luft til øjet, ej heller burde føre til en reaktion. Disse tests er gentages med omkring 15 minutters intervaller gennem hele operationen at bekræfte opretholdelse af en kirurgisk anæstetisk plan. Hår er fjernet fra snitstedet inden den føres ind i det sterile område.

2. Kirurgi

  1. Animal initial behandling. Ophthalmisk salve anvendes på hver øjeæblet for at forhindre udtørring. 1 ml sterilt saltvand gives sc at forhindre dehydrering under kirurgi, og kroppen er dækket med et sterilt afdækningsstykke. Betadine påføres hovedbunden, og podet fra centrumud med en vatpind, 70% ethanol pensles ligeledes, og de to pensling trin gentages to gange mere for at sikre en passende incisionssted. Hudkontakt tid til Betadine og alkohol bør være mindst 3 minutter før incision. Anæstesi opretholdes og kontrolleres løbende gennem kirurgi, en enkelt subkutan injektion af carprofen 5 g / kg) gives at indlede analgesi, og aseptisk teknik anvendes. Analgesi gives efter induktion af anæstesi for at minimere eventuelle stress fra injektion.
  2. Incision og kraniet forberedelse. En 3-4 cm snit sagitally i midten af ​​kraniet. En 1:1 blanding af bupivicain: adrenalin påføres topisk for at give yderligere analgesi og minimerer blødning. Hovedbunden er holdt væk fra indsnittet med kirurgiske klemmer og sterile vatpinde anvendes til at fjerne overliggende membraner fra kraniet. Koordinater til boring måles ved hjælp af bregma som et referencepunkt, markeret med en steril bor (eller alternativt en håndholdt cautery Device), og genbekræftet for nøjagtighed før boring starter. Koordinater for specifikke hjerneregioner af interesse (f.eks her hippocampus) bestemmes med et hjerneatlas. For hippocampus mikrodialyse, bruger vi en borestedet på 5,6 mm posteriort for bregma, 5,0 lateral og 3,0 ventral fra dura.
  3. Boring. Tre huller er boret gennem kraniet, med omhu er truffet for at anvende kun minimal kraft, således at traumer til dura og underliggende membraner er minimal eller fraværende. Et hul er ved den målte sted kanyleindføringsdel, de andre to er placeret som bekvem til indføring af kraniet skruer. Formål mellemstore skruer (f.eks 1,17 mm selvskærende skruer, Fin Science Tools) er indsat i disse huller uden at påvirke hjernen under og bruges som ankerpunkter til efterfølgende dental cement ansøgning.
  4. Kanyle placering og lukning. Kanylen placeres ved indsættelse koordinater, som igen bekræftet at være det sted, hvor hullet,og derpå langsomt sænket til måldybden. Når placeret korrekt, er kanylen på plads med dentalcement. Hvis det er nødvendigt, er en steril kirurgisk sutur anvendes til at lukke såret. En stilet er indsat i kanylen for at opretholde passabel tilstand. I denne protokol bruger vi en CMA12 sonde og guide kanyle (CMA / mikrodialyse).
  5. Akut post-kirurgisk behandling. 3 ml sterilt saltvand gives sc til fortsat hydratisering, en enkelt subkutan injektion af carprofen 5 g / kg) gives også at indlede analgesi. Dyr fjernes fra apparatet og anbringes i en opvarmet opvågningsstuen, i et rent bur og monitoreres indtil de er fuldt udvindes fra anæstesi. Fuld helbredelse vurderes ved restaurering af stabilitetsrefleks og normal bevægelse. Dyrene vendte derefter tilbage til deres hjem bur og regelmæssig bedrift værelse.
  6. Kortsigtede opfølgende behandling. Bure af dyr, der har gennemgået kirurgi er mærket med datoen for kirurgi. Dyrene kontrolleres mindst en gang hver dag i mindst three dage efter kirurgi, og i betragtning af en carprofen tygbar tablet (2 mg) dagen efter kirurgi og hver af de to følgende dage. Hvis dyrene ikke forbruge carprofen, kan injicerbar carprofen gives for at sikre tilstrækkelig analgesi. Overvåge både den generelle sundhed af dyret og tilstanden af ​​sårstedet (for infektion, rødme, etc.) efter institutionelle dyrene passes retningslinjer og søge hjælp eller rådgivning fra dyr plejepersonale eller den dyrlæge, hvis det er nødvendigt. Vigtigere bemærke, at passende håndtering og akklimatisering til eksperimentatoren er afgørende: dyr skal behandles omfattende, herunder manipulation af kanylen, indtil der ikke tegn på nervøsitet eller stress forbliver når de håndteres af eksperimentatoren.
  7. Efterfølgende dyr pleje og behandling. Dyrene vil følge de relevante prøvningsstandarder og eutanasi procedurer efter den godkendte protokol og deres specifikke forsøgsgruppe.

3. Mikrodialyse (MD)

  1. Perfusspiste præparat. Kunstig ekstracellulære væske (AECF) er lavet med 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM glucose, pufret ved pH 7,4 6 Bemærk at nøjagtig væskesammensætning er væsentlig. Unøjagtigheder eller anvende af andre, mindre fysiologiske væsker, såsom Ringers eller PBS til mikrodialyse vil resultere i markant fejlagtige resultater 6. Konkret opmærksom på, at den ioniske sammensætning af den ekstracellulære væske (ECF) ikke er den samme som for FSR, som vi viste i en 2004 detaljeret undersøgelse af den hippocampale ECF 6. På dagen for test, serumalbumin bovint (BSA) tilføjes til 2% vægt / vægt og helt opløst, hvilket reducerer tab af peptider, såsom insulin fra tilslutning til røret, og også reducerer risikoen for fluidtab (ultrafiltrering) ved sonden membran. Efter tilberedning skal perfusatet filtreres gennem et 0,2 um filter.
  2. Hvis en behandling såsom insulin skal leveres til brai område af interesse (her hippocampus), forberede denne behandling under anvendelse af en alikvot af den fremstillede AECF med den passende lægemiddelkoncentration. For insulin, er en koncentration på 400 nM (66,7 g enhed / ul) til levering via reverse mikrodialyse vist sig at påvirke hippocampus metaboliske og kognitiv funktion 7. Bemærk, at den resulterende vævskoncentration af insulin ikke måles her og forbliver ubekendt.
  3. Opsætning mD sonde og linjer. Der fremstilles en frisk mikrodialysesonde og linje dagen før prøvning. Opret to separate linjer for "tilgang" og "udstrømning". Brug PE50 slange til at forbinde to 1 meter lange stykker FEP rør og sikre, at der er minimal dødrum mellem linjerne. Tilslut indstrømning slangen til en 1 ml Hamilton-sprøjte fyldt med sterilfiltreret, deioniseret H 2 0 (dH 2 0), og derefter fastgøres den til proben.
  4. Mikrodialyse swivel. For at muliggøre fri flytning af dyr, mens du tager målinger, skal du tilslutte et flydende svirvel til inflow og afgang linjer, tæt på pumpen, ved hjælp af ekstra FEP slange. Husk at tage det indre volumen af ​​denne drejning og rør i betragtning overvejer timingen af ​​prøveindsamling (nedenfor).
  5. Opsætning mD pumpe. Tænd mD pumpen og køre ved 1,5 ul / min, indtil du ser dH 2 0 forlader udmunder på sonden. Derefter, mens pumpen slukket og den anden linie mellem udmunder, og en prøve opsamlingsrør. Forsøg 5 ml gennem røret og placere sonden i et hætteglas indeholdende sterilt dH 2 0 overnight, at sondens spids altid forbliver våd.
  6. Pre-sondering forsøgsperson. 24 timer før testen, skal du fjerne dummy stiletten fra rotten hoved og indsætte et mD sonde (bruges kun til dette formål, ikke for prøveudtagning) i 10 min. Derefter erstatte dummy stiletten og sætte rotten tilbage i sit bur. Denne procedure er designet til at minimere nogen effekt af reaktiv gliosis på testdagen 8 og i vores hænder, giver det god results, der svarer til data fra andre teknikker, og synes at afspejle hippocampal aktivering 2,5,7,9, mens andre er anvendt en lignende fremgangsmåde som forlader sonden på plads i 24 timer før måling, som også er en god fremgangsmåde, hvis beskadigelse af probe overnight kan undgås.
  7. Probe ækvilibrering. På dagen for mikrodialyse, fylde Hamilton-sprøjte og scintillationshætteglas med filtreret AECF og pumpe gennem at ækvilibrere i 1 time. Om nødvendigt fyldes endnu en Hamilton-sprøjte med præpareret behandling (fx insulin-AECF) og anbringes i sprøjtepumpen.
  8. Probe insertion. Når ligevægt er færdig, skal du fjerne dummy stiletten og indsæt forsigtigt den ækvilibrerede mD sonde ind i rottens hjerne via kanyle. Placere rotten i en klar plastkasse, der indeholder nogle af rottens home sengetøj. Sørg for at opveje røret: vedhæfte et 1,6 ml mikrocentrifugerør fyldt med vand til røret udenfor buret på en sådan måde, at tyngdekraften holder microdiANALYSE linjer unkinked men ikke stramt. Lad probe ækvilibrere i rotte i 2 timer. I starten af ​​denne periode, bekræfter, at strømmen af ​​perfusat er ublokeret: Dette er lettest ved at indsamle perfusatet udstrømning over en bestemt periode og veje prøven for at bekræfte, at den forventede volumen er spændende systemet. Enhver probe, som udbytter <90% af forventet volumen, og ikke selv korrekt efter fjernelse og reintegration, bør erstattes (ellers ødem ved probespidsen vil medføre). Hvis strømningen er fortsat lave eller fraværende, check alle forbindelser for lækage, i mangel heraf, frakoble slangen i etaper for at se, om blokeringen kan isoleres. Hvis problemet ikke er identificeret, skal du udskifte sonden, hvis problemet ikke løser, kan det være nødvendigt at starte på en frisk med ny sonde og linjer fra afsnit 3.3. Den to-timers ækvilibreringsperiode tillader blodhjernebarrieren at forsegle omkring sonden og undgå akut virkning af probe insertion.
  9. Indsamling af prøver. Sørg for, at correlation mellem prøve dialyse (fra hjernen) og indsamling (i rør) er nøjagtigt beregnet. For eksempel, under anvendelse af to meter FEP rør mellem drejning og proben er et totalvolumen mellem probe og opsamling af 30 fil og dermed det tager 20 min ved 1,5 gl / minut strømningshastighed for prøven at passere gennem sonden, slanger, stik og drej at nå slutningen af ​​slangen til opsamling. Når indsamling af prøver at sikre, at du samler nok volumen til at have koncentration er nødvendig for dine analyser. Her vil vi bruge 5 min samplekasserne, og dermed samle 7,5 pi dialysat i hver kollektion rør.
  10. Baseline prøver. Når ligevægt er færdig, begynder prøvetagningen. Saml mindst tre prøver, når rotten er i hvile i hjemmet kammer til at etablere en stabil basislinje af målinger
  11. Behandling timing. Vær omhyggelig med at beregne krævede timing for initiering af behandling før forsøget: Husk, at ligesom der er en tidsmæssig forskydning mellem dialyseog prøveindsamling, er der en forsinkelse (normalt identiske) mellem perfusat forlader sprøjten og nå frem til dyrets hippocampus. Derfor, i vores setup med en 30 ul volumen mellem sprøjte og sonde, ændre sprøjten til det, der indeholder behandling-perfusat 20 min før du ønsker behandling for at begynde ankommer til hippocampus.
  12. Ændring af sprøjter. En flydende kontakt kan anvendes, hvis det ønskes, men er ikke nødvendigt: på det rette tidspunkt, afbryde simpelthen indstrømningen linje fra kontrol-perfusatet sprøjte og hurtigt forbindelse til behandling-perfusatet sprøjte. Det bør ikke tage mere end 5 sek for at undgå betydelig afbrydelse af perfusatet flow. Bemærk, at denne proces bør vendes efter den ønskede dosering er blevet leveret, hvis en tidsbegrænset levering af behandlingen er ønsket. Alternativt kan behandlingen fortsættes, så længe prøveudtagning (se figur 2). Luftbobler bør ikke indføres i linien ved kobling afsprøjter, da de kan akkumuleres ved dialysemembran og reducere probe effektivitet.
  13. Behavioral tests. Hvis du udfører en adfærdsmæssig opgave, skal du følge denne procedure (se afsnit 4 nedenfor). Bemærke, at samarbejdet med levering af behandlingen til hippocampus er vigtig. For eksempel bør levering af insulin være timet at forekomme 10 min før påbegyndelse prøvning 10. Derfor bør der skiftes til en insulin-holdigt perfusat forekomme 30 minutter før adfærdsmæssige test (20 min for perfusat at passere gennem linjerne plus 10 min ønskede leveringstidspunkt foran test).
  14. Afslutning af prøvetagning. Efter opsamling af de ønskede prøver fjernes forsigtigt sonden fra dyrets hoved, igen huske at tage hensyn til tidsforsinkelsen mellem dialyse og prøveindsamling. Sende dyret tilbage til sit hjem bur og observere nøje for eventuel post-eksperimentel ændring i helbred eller adfærd indtil dyret aflives, og hjernen fjernes for at bekræfte korrektsonde placering. Hvis offer ikke vil opstå umiddelbart returnere dummy stilet til kanylen for at undgå introduktion af fremmed materiale.
  15. Analyse. Analysemetoden vil variere afhængigt af analytten (erne) af interesse. Fordi dialyse sampling ikke tillader fuldstændig analyt ligevægt ved sonden membran, bør prøvekoncentrationer korrigeres for at give ECF koncentrationer ved hjælp af nul-net-flux metode 11,12.

4. Behavioral Testing

  1. Placering på labyrint. Efter baseline prøver (dvs. efter mindst tre prøver har afsluttet dialyse, men kan stadig være i udstrømningen slangen, der indsamles), forsigtigt flytte rotten ind i det adfærdsmæssige testapparater. Enhver passende opgave kan anvendes; dataene i figur 1 blev opsamlet under anvendelse af en fire-arm plus-formet labyrint og måling af spontan vekslen, hvilket er et mål for rumlig arbejdshukommelse: rotten indledningsvis placeret i center af labyrinten og får lov til at udforske frit 9,13. Fordi enhver adfærdsmæssige test kan anvendes, er fokus i denne protokol er ikke på den specifikke opgave brugt som et eksempel her (som er detaljeret andetsteds 9,14,15), men kort fortalt, er dyrene lov til at udforske labyrinten (den periode, Den grå boks i figur 1) og brug hippocampally-afhængige processer at bevare hukommelse hvilke arme er for nylig blevet besøgt.
  2. Dialyserør bevægelse under testning. Hold slangen, således at den kan bevæge sig frit, hverken hindrer rottens bevægelse eller fået tilladelse til at flytte foran dyret og distrahere den. Forblive på plads og minimere din egen bevægelse, så du ikke påvirker rottens adfærd.
  3. Fortsat prøvetagningen. Som under baseline, flytte udstrømningen slangen til en ny opsamlingsrør hver 5 min.
  4. Vekslen testning. Så dyret kan frit undersøge labyrinten i 20 minutter. Optag sekvensen og timingen af ​​arm poster enten viaen videooptagelse eller i hånden til senere opgavevaretagelse analyse 9,15.

5. Post-test

  1. Final prøvetagningen. Efter afprøvning, rotte fjerne forsigtigt fra labyrint og vende tilbage til at styre kammer. Fortsæt mikrodialyse prøvetagning i mindst fire prøver at dække perioden for inddrivelse fra opgaveløsningen.
  2. Probe fjernelse. Når alle prøver er indsamlet, skal du forsigtigt fjerne sonden fra dyrets hoved og sted i et lager hætteglas, sende dyret tilbage til sit hjem bur.
  3. Probeholder. Efter hjemkomsten dyr til hjemmet bur og færdiggøre indsamlingen af enhver resterende dialysat, skylles sonden grundigt med dH 2 0 og opbevares i et scintillationshætteglas fyldt med dH 2 0 og dækket med parafilm. Skylle slangen ved at skifte til en sprøjte indeholdende en opløsning på 1:10.000 Kathon i dH 2 0 for at forhindre mikrobe vækst. Prober kan genanvendes så længe de opretholder god strømning og haringen skader på membranen, med omhu bør dette rutinemæssigt være i mere end ti anvendelser.
  4. Histologi. Aflive dyret og fjerne hjernen. Skive på en kryostat og anvende standard histologiske teknikker (f.eks cresylviolet farvning) for at bekræfte korrekt probe placering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rotter skal komme sig hurtigt efter operationen og være på vagt, motile og aktiv inden for 30 min efter ophør af anæstesi. Virkningen af ​​kanylen hætten bør være minimal, hvis indgrebet udføres rent og minimal dentalcement anvendes. Hvis nogen tegn på infektion er bemærket under den postoperative overvågning eller rotten er på nogen måde viser tegn på angst eller ubehag, skal du straks afslutte eksperimentet, der skal være yderst sjældent. Under håndtering før prøvning, bør dyrene være opmærksom, frit bevægelige, venlige og nysgerrige. Well-håndteres dyr skal have det væsentlige ingen observerbar stress tilbage fra kirurgi, post-kirurgisk opsving, eller tilstedeværelsen af forsøgslederen, og dette kan bekræftes, hvis det ønskes ved måling af plasma stresshormoner (adrenalin, glukokortikoider) og / eller glucose 2,4 , 5.

Brain ECF glucose er typisk i området fra 0,5 til 1,5 mM, varierende som hjerne region, men højere værdierkan ses i diabetiske dyr i hippocampus, er baseline glucosekoncentrationer på snæver størrelsesordenen 1,25 mM 6,12. I mangel af eksogent behandling, bør en dukkert i ECF glukose (og, almindeligvis, en stigning i ECF lactat) ses under opgaveløsningen, i de områder af hjernen, der er involveret i formidling denne opgave (se figur 1 for eksempel), hvilket afspejler den forøgede metaboliske aktivitet fremkaldt af den kognitive belastning 9,14,16. Lignende ændringer kan tages som bevis for, at en bestemt behandling øger lokale metabolisme, som det ses for eksempel efter akut indgivelse af insulin via tilsætning til perfusatet 7 (figur 2).

Generelt bør et godt håndtag dyr udføre adfærdsmæssige test uden tegn på nød og uden tegn på bevidsthed om mikrodialyse slange: tegn på overdreven pudsning, immobilitet, nogen indikation af smerte eller forsøg på dyr for at fjerne sonden tydersandsynligvis utilstrækkelig håndtering og / eller infektion omkring sonden site, og bør tages som en indikation for at afslutte det eksperiment.

Dyr, der modtog insulin administration bør, ud over forhøjet hippocampus metabolisme, viser markant forbedret rumlig hukommelse 7. Control, være ubehandlede dyr har gennemsnitlig vekslen ydeevne på 4-armet labyrint af mellem 65 og 75% 7,9,14.

Figur 1
Figur 1. Task-associeret dukkert i hippocampus ECF glukose (tilpasset fra 9). Grå boks er den periode, labyrinten test på spontan vekslen (SA). Lilla linje viser hippocampus glukose i dyr uden labyrint test (men der var ellers håndteret identisk). Rød linje er målinger i dyr udfører 4-armet SA opgave, orange linie viser målinger i dyr udfører lettere3-arm version af SA.

Figur 2
Figur 2. Ændringer i hippocampus glucose og lactat efter administration af insulin via optagelse i perfusatet (tilpasset fra 7). Insulin når hippocampus ved punktet angivet med pil og administreres derefter jævnt. Dyr blev testet i deres bure, uden adfærdsmæssig manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alle opløsninger anvendt i mikrodialyse skal filtreres umiddelbart før brug under anvendelse af et 0,2 um filter. Efter indføring af sonden ind i føringen kanyle, observere at bekræfte, at strømningen er uhindret og prøveudtagning finder sted. Hvis flow stopper efter indsættelse, den mest sandsynlige årsag er skader på sonden membran forårsaget af utilstrækkelig pleje på indsættelse, og en frisk sonde skal erstattes.

Som bemærket ovenfor, en væsentlig fordel for disse fremgangsmåder er den manglende forvirre, tillader både adfærdsmæssige og neurokemiske foranstaltninger i vågen, frit bevægelige dyr: for at drage fordel af dette, omfattende håndtering før afprøvning er afgørende for, at dyret skal ubelastet under målinger. Den ækvilibreringsperiode er generelt tilstrækkelig til at sikre en stabil metabolisk baseline, men mad kan fjernes i 1-2 timer før afprøvning, hvis det ønskes, for at sikre ensartede blodsukkerniveauer tværs dyr.

The to væsentligste begrænsninger mD som stikprøveudtagningsteknik er (i) begrænset størrelse af analyt og (ii) muligheden for tab af analyt grund af vedhæftning i slangen. Førstnævnte kan afhjælpes i en vis udstrækning ved anvendelse af mD prober med et større molekylvægtafskæring. Typiske kommercielle prober tillader cutoffs på op til 100 kD, således at molekyler på op til måske 50 kD vil passere gennem relativt uhindret, men anvendelsen af ​​lavere cutoff membraner anbefales vidt muligt at minimere enhver prøvetab via ultrafiltrering ved probespidsen. Adhæsion af målmolekyler til slangen er et problem primært i tilfælde af peptid målinger, hvoraf mange vil have en tendens til at klæbe til FEP slanger og dermed reducere både analyt genfinding og nøjagtighed. Dette problem kan minimeres ved (i) forbehandling af det indre af røret med et perfusat, hvortil 2% bovint serumalbumin er tilføjet, som et blokerende middel, og (ii) ved at minimere længden af ​​afkastet slange: hvis needed, kan en let samling hætteglas fastgøres tæt ved udstrømning af sonden, selv om dette medfører yderligere problemer med at skifte opsamlingsrør uden at forstyrre dyret, især i adfærdsmæssig testning. En fordel ved teknikken er, at prøverne er fremstillet i en form fri for cellerester eller store molekyler, såsom enzymer, og er generelt egnede til direkte analyse via injektion i HPLC, MS eller andre analytiske maskiner, som de er uden behov for yderligere oprensning , hvilket tillader også i mange tilfælde analysen af flere analytter i hver prøve (såsom glucose og lactat målinger vist i figur 2).

En variant af anvendelsen af ​​revers mikrodialyse at afgive farmakologiske behandlinger er anvendt dobbelt mikroinjektion-mikrodialysen prober, er tilgængelige fra flere kilder. Imidlertid boringen i injektionsporten er generelt meget smal og udsat for blokering, og det kan være vanskeligt nøjagtigt atstyre tidspunktet og / eller mængden af ​​behandlingen levering. Dette alternativ er derfor kun anbefales til behandlinger, der ikke egner sig til levering via optagelse i perfusatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDDK (DK077106 til ECM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

The majority of reagents are standard laboratory grade and can be obtained from a supplier of choice. Similarly, equipment such as syringe pumps and tubing can be used from any of several manufacturers. Specific items used here for which details are important include:

CMA 12 microdialysis probes CMA/ Microdialysis CMA-12-XXX These are available in various membrane lengths and cutoffs, indicated by specific codes in the 'XXX.'
Human insulin (Humulin) Eli Lilly N/a
Liquid swivel Instech 375/D/22QM This specific swivel has very low torque and internal volume, as well as a nonreactive quartz lining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (6), 2881 (2000).
  2. McNay, E. C., Gold, P. E. Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56, (2), 66 (2001).
  3. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiol. Learn. Mem. 75, (3), 325 (2001).
  4. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  5. McNay, E. C., Sherwin, R. S. Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats. Diabetes. 53, (2), 418 (2004).
  6. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  7. McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood. Neurobiology of Learning & Memory. 75, (3), 325 (2001).
  8. McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia. Diabetes. 55, (4), 1088 (2006).
  9. McNay, E. C., Sherwin, R. S. From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements. Journal of Neuroscience Methods. 132, (1), 35 (2004).
  10. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiology of Learning and Memory. 93, (4), 546 (2010).
  11. Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat. Journal of Neurochemistry. 49, (3), 729 (1987).
  12. Benveniste, H., Diemer, N. H. Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus. Acta Neuropathologica. 74, (3), 234 (1987).
  13. McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (6), 2881 (2000).
  14. McNay, E. C., et al. Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance. Neurobiol. Learn Mem. 93, (4), 546 (2010).
  15. Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans. American Journal of Physiology. 1987, E228 (1987).
  16. McNay, E. C., Gold, P. E. Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate. 72, (2), 785 (1999).
  17. Lalonde, R. obert The neurobiological basis of spontaneous alternation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26, (1), 91 (2002).
  18. Richman, C., Dember, W., Kim, P. Spontaneous alternation behavior in animals: A review. Current Psychology. 5, (4), 358 (1986).
  19. McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus. Physiol. Behav. 87, (2), 298 (2006).
  20. McNay, E. C., Gold, P. E. Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task. Journal of Neuroscience. 18, (10), 3853 (1998).
  21. Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis. Physiol. Behav. 98, (4), 467 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics