Passaging Hues humane embryonale stamcelle-linjer med Trypsin

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I denne videoen viser vi hvordan vår lab rutinemessig luftveiene fargetoner humane embryonale stamcellelinjer med trypsin Humane embryonale stamceller er gjenstander av cellekultur, og har en tendens til å erverve karyotypic unormalt med høy befolkningstetthet doblinger. Riktig passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn, udifferensiert, karyotypically normal Hues menneskelige embryonale stamceller kultur. Først blir en ekspanderende kultur vasket i PBS for å fjerne rester av media og celleavfall, da cellene er kledde med en minimal mengde varme 0,05% Trypsin-EDTA. Trypsin er igjen på cellene for opp til fem minutter, da cellene er forsiktig forskyves med en 2ml serologisk pipette Cellesuspensjonen samles og blandes med et stort volum av fargetoner media, blir deretter cellene samles ved forsiktig sentrifugering. Den inaktiverte trypsin media blanding fjernes, og cellene resuspendert i forvarmet fargetoner media. En passende Delingsforholdet beregnes (vanligvis 01:10-01:20), og celler re-belagt på en 1-2 dagers gammelplate som inneholder en monolayer av bestrålte mus embryonale fibroblast mater celler. Den nylig sådd Hues kultur plate er igjen urørt i 48 timer, så media blir endret hver dag etterpå. Det er viktig å ikke trpsinize ned til en enkelt celle suspensjon, da dette øker risikoen for å innføre karyotypic misdannelser.

Protocol

Generelt

Vi anbefaler tining ikke mer enn én prøve på et gitt tidspunkt for å sikre enkel håndtering. Behandleren bør vokte seg for å forlate kulturer ved romtemperatur og lave CO2 i lange perioder av gangen. Alle sentrifugering av levende celler er gjort på 500-600 xg i 5 min ved romtemperatur.

MEFs (Mus Embryonale Feeder Cells)

  1. Pre-varme MEF media til 37 ° C. Fjern MEF hetteglass fra -80 ° C og umiddelbart senk den nederste halvdelen av røret i en 37 ° C vannbad. Det tar cirka 30-45 sekunder før cellene er 80% tint (liten frossen del igjen).
  2. Raskt bringe slangen til laminær panseret, spraye ned med 70% alkohol, og overføre celler til forvarmet media.
  3. Aspirer gelatin løsningen fra platene forberedt tidligere.
  4. Delmengde 2 ml av MEF løsning i en dråpe klok måte i hver av de seks brønnene. Pass på å fordele MEFs jevnt om brønnen. Datoen MEFplate, og plasser i en 37 ° C inkubator natten for å tillate MEFs å feste på plate.
  5. Etter 6 timer MEFs vil bli festet til plate. Det er best å bruke MEF plater 24-48 timer etter plating. IKKE bruk en MEF plate som er over fire dager gammel.
  6. Pre-varme fargetoner media og 0,05% Trypsin / EDTA til 37 ° C Under panseret, prelabel en steril 50 ml konisk rør.
  7. Nøye aspirer nyansene media fra kultur til deles. Vask forsiktig brønnene med 2 ml 1X fosfatbufret løsning (PBS) per brønn. Aspirer PBS. Legg 0,75 ml 0,05% Trypsin / EDTA til brønnen.
  8. Sett lokket, og observere celler under 4x forstørrelse. Den MEFs rundt fargetoner koloniene skulle begynne å trekke. Når MEFs er tilstrekkelig avrundet og grensene for nyansene koloniene er grovt, returnere platen til panseret. Denne prosessen tar ca 5 min, absolutt INGEN lenger enn 10 minutter eller dine celler vil ikke re-vokse.
  9. Forsiktig Pipetter opp og ned, vask bunnen av the vel, inntil MEF monolayer er helt løsrevet (monolayer er klissete og kan forbli i ett stykke).
  10. Overfør cellesuspensjon til en 50 ml konisk rør som inneholder flere fargetoner media. Spinn røret av celler 500xg i 5 minutter, Aspirer av media, være forsiktig for ikke å forstyrre cellepelleten.
  11. Slik plate på en ny plate av MEFs, legger hensiktsmessig å fastsette volum av celler til flere fargetoner media, og pipetter løsningen 5-7 ganger med en automatisert pipette.
  12. Fjern MEF media fra en fersk plate av MEFs.
  13. Delmengde nyansene løsningen dråpe lurt til hver brønn, og pass på å fordele synker jevnt om brønnen. Uten risting platen, forsiktig tilbake cellene til en 37 ° C inkubator natten for å la Hues kolonier frø.
  14. Fargetoner celler som kommer ut av en splittet bør oppføre seg på samme måte som de som kommer ut av en tin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan vi rutinemessig passasje fargetoner humane embryonale stamcellelinjer i vårt laboratorium. Effektiv og regelmessig splitting og passaging er avgjørende for å opprettholde en sunn humane embryonale stamceller linje. Trypsin mediert passasje er en betydelig fordel av fargetoner cellelinjer, er det imidlertid viktig å ikke over trypsinize kulturer eller å ha en stor andel av enkeltceller under re-platting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats