Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

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Immunology and Infection

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Summary

Un protocolo específico y rápido para investigar simultáneamente la función del corazón derecho, inflamación pulmonar, y la respuesta inmune que se describe como una herramienta de aprendizaje. Vídeo y figuras describen la fisiología y técnicas de microdisección en un equipo organizado-enfoque que es adaptable para ser utilizado para pequeñas y grandes estudios de tamaño.

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Chen, W. C., Park, S. H., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

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Abstract

La función del corazón derecho es bombear sangre a través de los pulmones, uniendo así la fisiología del corazón derecho y la fisiología vascular pulmonar. La inflamación es un modificador común de corazón y la función pulmonar, mediante la elaboración de la infiltración celular, la producción de citoquinas y factores de crecimiento, y mediante el inicio de procesos de remodelación 1.

En comparación con el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho es una bomba de baja presión que funciona en una zona relativamente estrecha de los cambios de presión. El aumento de la presión arterial pulmonar se asocian con aumento de la presión en el lecho vascular pulmonar y la hipertensión pulmonar 2. La hipertensión pulmonar se asocia a menudo con enfermedades pulmonares inflamatorias, por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica, o enfermedades autoinmunes 3. Dado que la hipertensión pulmonar confiere un mal pronóstico para la calidad de vida y la esperanza de vida, mucha investigación se dirige hacia la comprensión de los mecanismos que might ser blanco de 4 intervención farmacéutica. El principal desafío para el desarrollo de herramientas de gestión eficaces para la hipertensión pulmonar sigue siendo la complejidad de la comprensión simultánea de los cambios moleculares y celulares en el corazón derecho, los pulmones y el sistema inmunológico.

Aquí, se presenta un flujo de trabajo de procedimiento para la medición rápida y precisa de los cambios de presión en el corazón derecho de ratones y la cosecha simultánea de muestras de corazón, los pulmones y los tejidos inmunes. El método se basa en la cateterización directa del ventrículo derecho a través de la vena yugular en estrecha de pecho ratones, desarrollado por primera vez en la década de 1990 como medida indirecta de la presión en la arteria pulmonar 5-13. El equipo organizó enfoque facilita una técnica muy rápida cateterismo cardíaco derecho. Esto hace que sea posible llevar a cabo las mediciones en los ratones que espontáneamente respirar aire de la habitación. La organización del flujo de trabajo en distintas áreas de trabajoreduce el tiempo de retardo y abre la posibilidad de realizar simultáneamente experimentos de fisiología y tejidos cosecha corazón inmune, y pulmón.

El flujo de trabajo del procedimiento descrito aquí se puede adaptar para una amplia variedad de entornos de laboratorio y diseños de estudio, a partir de experimentos pequeñas y enfocadas, a grandes ensayos de selección de fármacos. La adquisición simultánea de datos en fisiología cardiaca que se puede ampliar para incluir la ecocardiografía 5,14-17 y cosecha de los tejidos del corazón, pulmón e inmune reduce el número de animales necesarios para obtener los datos que se mueven a la base de conocimientos científicos adelante. El flujo de trabajo de procedimiento que aquí se presenta también proporciona una base ideal para el conocimiento de las redes que vinculan a pulmón inmune y la función cardiaca. Los mismos principios descritos aquí pueden adaptarse para estudiar otros órganos o adicional según sea necesario.

Protocol

1. Preparación

  1. Preparar las siguientes soluciones y tubos (Tabla 1) como sigue:
    1. Hanks solución, sin calcio, magnesio o indicador con penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml).
    2. Salina tamponada con fosfato (PBS), 1x, calcio no, magnesio no.
    3. Etanol, 70%, hacer 500 ml.
    4. Buffered formaldehído, un 7-10% con PBS, hacer 500 ml.
    5. Anestesia soluciones:
      1. Avertin. Añadir cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Una vez disuelto, mantener solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad. Tomar 0,25 ml de la solución madre y se diluye con 10 ml de 1xPBS en botella de vidrio de fondo. Envolver el frasco con hoja de aluminio, lugar a 37 º C hasta que se disolvió y luego alícuota en tubos de 5 ml de polipropileno y mantener en el refrigerador. Calentar una alícuota en la mañana del experimento.
      2. Barbitúricos. Diluir solución madre con PBS para obtener un 2,6% de barbitúricos sollución. Colocar alícuotas de 3-4 ml en tubos de polipropileno.
  2. Organizar el trabajo-tres áreas (Figura 1).
    1. Zona A: Colocar los siguientes elementos: formulario de estudio para registrar el número de identificación del estudio, la fecha, el peso corporal y peso del corazón derecho, corazón izquierdo y el tabique, balanza de precisión (0-50 g a 0,01 g de precisión) para determinar el peso del cuerpo, escala micro para determinar los pesos del corazón a 0,001 g de precisión; pesan barcos; soluciones de anestesia (claramente marcada); pequeño Dewar con nitrógeno líquido; recipiente aislado con hielo; tubos y la placa de 24-bien para recoger muestras de sangre y tejidos (Tabla 1); instrumentos quirúrgicos ( Tabla 2, Figura 2), y soluciones para limpiar los instrumentos (Tabla 1).
    2. Zona B: Colocar los siguientes elementos: microscopio de disección; catéter pulmonar conectado a una unidad de control de presión que está conectado a un amplificador y un ordenador portátil. El catéter se coloca enun vaso de precipitados que contiene agua. Organizar los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), piezas de corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; cinta (cinta de autoclave es óptimo) corta a la longitud y la anchura óptima y alineados en el banco o en el laboratorio microscopio para facilitar el acceso; hisopos de algodón y pelo removedor de solución. Calibrar el catéter en el inicio del estudio.
    3. Zona C: Coloque los siguientes artículos: lupa lente; cánula traqueal, jeringas de 1 ml, corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; pequeño termo con nitrógeno líquido, recipiente aislado con hielo, tubos y 24-así placa para recoger BAL y muestras de tejido (Tabla 1), y los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), soluciones para realizar BAL y para limpiar la cánula traqueal y los instrumentos (Tabla 1).

2. La cateterización del corazón derecho

  1. Pesar ratón utilizando una balanza de precisión colocando suavemente el ratón en un pesaje bavena. Asegúrese de manejar al animal suavemente y en silencio. Registre el peso. El protocolo descrito funciona mejor para los ratones que son 20 g o más, porque el diámetro de la vena yugular tiene que acomodar la sonda de presión, es posible para la cateterización más pequeños ratones (17 g o más), siempre que la vena es lo suficientemente grande.
  2. Anestesiar el ratón por inyección con Avertin en función del peso corporal (10 l / g), por ejemplo, para dar 20 g 200 l, para dar 25 g 250 l, para dar 30 g 300 l. El volumen de inyección exacta necesita ser ajustado dependiendo de la cepa de ratón. Asegúrese de manejar el animal suave y silenciosamente porque el estrés puede alterar la respuesta a la anestesia.
  3. Una vez que el ratón está sedado, coloque en papel de seda de doble plegado. Tenga en cuenta el número de ID en el papel. Frote suavemente la crema del retiro del pelo en la cara ventral del cuello para limpiar el campo quirúrgico. Coloque el ratón de nuevo en el papel y esperar 1-2 min.
  4. Quitar el pelo de la cara ventraldel cuello suavemente acariciando el cabello contra la dirección del crecimiento del pelo con hisopos de algodón.
  5. Determinar cuidadosamente la profundidad de anestesia mediante la comprobación de la ausencia del reflejo de dedo del pie: el ratón no reacciona a pellizcos de los dedos del pie.
  6. Trabajando rápidamente y relajado, el resto de la cateterización del corazón derecho no debe tomar más de 10 minutos, de manera óptima 3-6 min. Es importante que el tejido no se seque, ya que el catéter debe deslizarse dentro de la vena y se mueven dentro de la vena en una capa de humedad. Tiempo coherente del procedimiento es importante para la generación de los datos que son comparables entre los grupos.
  7. Coloque de nuevo el ratón sobre un pañuelo de papel y la transferencia de papel de seda en la espuma de poliestireno bordo. Fijar las patas y la cabeza en su sitio con cinta de autoclave.
  8. Hacer la incisión de la piel de las mandíbulas hasta el esternón (esternón).
  9. Con cuidado, diseccionar hacia arriba tiroides grandes hacia las mandíbulas para exponer la vena yugular derecha unnd tráquea.
  10. Lugar de espuma de poliestireno bordo Manteniendo el ratón bajo el microscopio de disección con el plano de enfoque ya existentes y la lente de aproximadamente 0,8 x ampliación (ampliación total [x lente ocular] es aproximadamente 8 veces.
  11. Microdissect cuidadosamente la vena yugular derecha mediante la eliminación de tejido conectivo circundante con pinzas quirúrgicas.
  12. Coloque dos piezas de sutura en la parte superior de la vena yugular derecha. Atar la sutura más cercano a las mandíbulas para cerrar el flujo de sangre en la vena para un pequeño goteo, colocar la sutura que está más cerca del esternón / esternón en un nudo flojo alrededor de la vena. Uno puede usar el pequeño goteo de sangre para encontrar más tarde el agujero en la vena, si esto fuera necesario.
  13. Respira y relájate (aflojar los músculos del cuello y la mandíbula) para mantener sus ojos en la vena a través del ocular. Esto se asegurará de que sus manos y dedos se moverán de forma segura, suave y relajado. Mientras sostiene la vena con pinzas en el lado más cercano alas mandíbulas, cortar un agujero en la vena entre las dos suturas utilizando micro-tijeras operados por otra parte. Deja las tijeras microempresas, y mantener esa mano relajada, trate de sentir el catéter. Suavemente recuperar el catéter sosteniéndolo entre el pulgar y el dedo índice (Figura 3). Insertar el catéter en el orificio de la vena.
  14. Avance suavemente el catéter en el corazón derecho (Figura 3). Observe las marcas en el catéter que da un índice aproximado de hasta qué punto el catéter necesita ser insertado y observar el monitor. Una vez que las curvas de presión se muestran, apretar suavemente la sutura inferior alrededor de la sonda. Debido a que el catéter tiene resistencia a la tracción que le da una bobina, y porque la respiración y los latidos del corazón del ratón añadir movimiento, además, fijar el catéter con cinta adhesiva.
  15. Registrar las mediciones de presión durante 2 minutos para su análisis posterior (Figura 4).
  16. Abra la sutura de la celebración de la sonda, luego suavemente RetrieVe catéter. Limpiar la parte detrás del transductor de presión, coloque de nuevo en el vaso de precipitados con agua. No toque el transductor de presión.
  17. Transferir el ratón en la parte superior del papel de seda a la zona A de la eutanasia, la recogida de tejido de la sangre y el bazo. Limpiar instrumentos quirúrgicos.
  18. Iniciar el procedimiento con el siguiente animal. Cuando el tiempo lo permite, inyectar el anestésico mientras espera para registrar la curva de presión (2,15).

3. Toma de muestras de sangre y el bazo

  1. Inyectar solución barbitúricos, 400 l por ratón y esperar 1-2 min. Esto se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio para evitar la posibilidad de que los ratones sin querer recuperarse de avertina-anestesia mientras desangrado. Normalización adecuada del experimento se consigue mediante la inyección de la misma dosis de solución barbitúrico por ratón, y esperando la misma cantidad de tiempo antes de la cosecha de la sangre. Si está permitido por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión ysiempre y cuando los animales son cuidadosamente monitorizados por la profundidad de la anestesia antes de la exanguinación, este paso puede ser omitido.
  2. Hacer incisión en el abdomen. Abrir la vena caudal (vena cava) y recoger la sangre usando una pipeta de transferencia.
  3. Extirpar el bazo, o una pieza del bazo en el tubo de Eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks para la preparación posterior de las células individuales.
  4. Transferir el ratón en la parte superior del papel tisú a C del área de trabajo para la recogida de BAL, pulmón drenaje de ganglios linfáticos, el pulmón y los tejidos del corazón. Limpiar instrumentos quirúrgicos.

4. Recolección de muestras de pulmón y corazón

  1. Disecciona la tráquea libre de músculo y tejido conectivo. Fórceps inclusión en la traquea, saque la sutura a través. Suavemente generar tramo suficiente para cortar un agujero. Mantener el estiramiento suave, inserte la cánula traqueal con un movimiento ligeramente torneado, y la sutura cánula into lugar. Para la inserción de la cánula traqueal, asegúrese de que la tráquea está húmedo, si es necesario añadir una gota de solución de Hanks. Durante todo el procedimiento, respirar, relajarse cuello y músculos de la mandíbula, para mantener movimientos de la mano segura y sin problemas.
  2. Disecciona abrir la caja torácica retirando cuidadosamente el esternón a partir de finales abdominal. No moleste a los contenidos del tórax porque esto hará que sea muy difícil encontrar el ganglio linfático.
  3. Realizar el lavado broncoalveolar (BAL), insertando suavemente 1 ml de tampón Hanks, gire suavemente la jeringa y recupere el líquido de BAL. Repetir 3 veces, el tubo de cierre y colocar en hielo. Durante todo el procedimiento, mantener los ojos en el extremo de la cánula traqueal que se conecta a la jeringa. Una mirada a tórax para observar el inflado y desinflado de los pulmones.
  4. Pulmón cosecha de ganglios linfáticos mediante la celebración de pared de la caja torácica con un juego de fórceps, encontrar y recuperar el ganglio linfático con otros fórceps. Lugar de ganglios linfáticos en placa de 24 pocillos. Es importante kahora dónde buscar: empezando por el cuello, encontrar la entrada de la caja torácica desde el lado derecho del ratón y mirar por encima de la espina dorsal (Figura 5).
  5. Harvest corazón y colocar en papel de seda. Aislar el lado derecho del corazón mediante una cuidadosa disección lado del tabique. Traslado al trabajo de la zona A de pesar, registrar el peso y el lugar en tubos eppendorf para ajustar congelación en nitrógeno líquido.
  6. Coloque sutura alrededor del lóbulo pulmonar izquierdo para cerrar el bronquio principal. Diseccionar el pulmón izquierdo lóbulo libre, lugar en el tubo eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o el lugar en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía solución de Hanks para el aislamiento posterior de suspensiones de células individuales.
  7. Inserte aprox. 0,5 ml solución tamponada de formaldehído a través de la cánula traqueal en los lóbulos pulmonares restantes. Después de la inflación, diseccionar los lóbulos pulmonares fuera del tórax y el lugar en el tubo de 50 ml que contiene una solución de formaldehído. Para un estudio de diseño alternativo, los pulmones se pueden inflar con optimal corte de los medios de comunicación (octubre, se diluyó 1:4 con PBS) y se congeló en un molde que contiene octubre sin diluir para la preparación posterior de secciones congeladas. Otro diseño del estudio podría requerir la obtención de tejido pulmonar congelado complemento y suspensiones de células individuales de los pulmones. En ese caso, no es necesario inflación: diseccionar los lóbulos pulmonares restantes; recuperarlos del tórax y el lugar en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks.
  8. Retire la cánula traqueal, limpio por lavado con tampón de Hanks, limpiar los instrumentos quirúrgicos.

5. El análisis de las curvas de presión generadas a partir del catéter pulmonar

Los datos registrados de presión ventricular derecha se analizan utilizando LabChart 7 software sin conocimiento de la identidad de grupo de cada grabación. Más de 20 curvas se seleccionan al azar y la diferencia entre la máxima y la presión ventricular mínima para cada curva de medición (DP). La? P media se calcula a dar el derecho vpresión sistólica entricular.

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Representative Results

El resultado primario para la obtención de curvas de presión derecho del corazón se logra por la posición correcta del catéter en el corazón derecho. La forma de las curvas de presión de tiempo es crítico porque la correcta colocación del catéter dentro del ventrículo derecho se traducirá en mesetas de presión (Figura 4). Curvas de punta, en cambio, indican un catéter que se mueve por la respiración o el movimiento latido del corazón contra la pared del ventrículo derecho. Para detectar posibles problemas en la etapa de supervivencia de los animales, la desviación estándar de la Delta P, y la frecuencia cardiaca debe ser calculada. Ambos valores se espera que sea no significativamente diferente entre los grupos de tratamiento. Por otra parte, la expectativa es que los valores Ap y la frecuencia cardíaca no muestran una deriva a través del tiempo de grabación. Por ejemplo, aumentando lentamente valores Ap indicaría la vasoconstricción pulmonar hipóxica 18-20. La disminución de la frecuencia cardíaca se móe que el nivel de anestesia es demasiado alta conduce a la muerte del animal. En nuestro laboratorio diferentes personas realizar el procedimiento. En todos los grupos de ratones que habitualmente alcanzar 90-95% las tasas de éxito en la obtención de datos de la presión ventricular derecha.

Si bien el aprendizaje del procedimiento, lo mejor es comenzar con mayores ratones hembra (25-30 g, y más) que tienen una vena más grande yugular y tienden a tener menos depósitos de grasa subcutánea que los ratones machos. La mejor manera de determinar la colocación del catéter es a sacrificar al animal tan pronto como el catéter se fija en el interior de la vena. Diseccionar el animal a partir del corazón para visualizar directamente la colocación del catéter. Esto facilitará en gran medida la resolución de problemas.

El primer resultado para la obtención de fluido BAL es la correcta colocación de la cánula traqueal. Esto se indica por la inflación de los pulmones cuando se inculca tampón Hanks, y la deflación de los pulmones cuando el beneficioer se retira. La recuperación esperada es del 70-80% del volumen instilado en los animales de control, menos (hasta 50%) en los animales que tienen inflamación pulmonar. Espuma en la parte superior del fluido BAL recuperado indica la presencia de tensioactivo. Contaminación de la sangre del líquido BAL recuperado o bien se produce debido a la presencia de inflamación pulmonar significativo, o porque la instilación y la recuperación del fluido de lavado fue demasiado rápido. Es de señalar que algunas medidas aguda de la lesión dentro de los pulmones puede ser inducida por el procedimiento de BAL. Si el diseño experimental es entender estos parámetros lesiones agudas y examen de BAL es también importante, entonces un lóbulo pulmonar necesita ser atado y retirarse antes de la realización de BAL.

En el procedimiento que se muestra aquí, se cosechan los tejidos del pulmón para histología sin inflación estandarizado y la perfusión de los pulmones. En los casos en morfometría histológico exacto es el principal de lectura, los pulmones deben ser inflado a través de la tráquea, y PErfusion se debe realizar a través de la arteria pulmonar, todos bajo presión normalizada.

En el protocolo mostrado, el corazón es disecado para proporcionar el índice de Fulton como medida de la hipertrofia cardiaca derecha (peso del ventrículo derecho / peso del ventrículo izquierdo y el tabique). Además, los métodos se están desarrollando nuevas que se basan en la evaluación histológica del corazón derecho. Emergentes medidas histológicas de la hipertrofia cardíaca derecha son a) el número de núcleos dentro de un área definida de corazón seleccionados al azar derecho, y b) los recuentos de vasos, y el índice de fibrosis por área de corazón.

En nuestro laboratorio, la recuperación correcta de pulmón drenaje ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales (Figura 5) es habitualmente verificada por citometría de flujo debido a que estos tejidos son muy pequeñas en los ratones control. Sin embargo, dependiendo de la microbiota en la instalación de alojamiento y la edad de los animales, el tamaño de los ganglios linfáticos en unchallenGED, ratones de control puede ser lo suficientemente grande para sólo una confirmación visual. Cuando se verifica mediante citometría de flujo, las células de ganglios linfáticos que se distingue de los timocitos. Por accidente, el timo puede fácilmente ser muestreados junto con el ganglio linfático debido a que el timo y los ganglios linfáticos están localizados cerca uno del otro y están contenidos dentro de la caja torácica. La distinción es que el timo está situado cerca del esternón y el ganglio linfático cercano a la columna vertebral. Más difícil es que el timo es muy grande, que contiene muchas células más pequeñas de los ganglios linfáticos. Los timocitos se puede distinguir fácilmente a partir de células de ganglios linfáticos mediante el uso de citometría de flujo y CD3, CD4, CD8 y marcadores. Los ganglios linfáticos tienen característicamente células CD3 +, la mayoría de las cuales son positivas para CD4 o CD8. En contraste, la mayoría de los timocitos son positivos para los tres marcadores (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Además, en la información de profundidad en la localización de nodos linfáticos de ratón se pueden encontrar en el manuscrito porVan den Broeck et al. 21.

Tiempo coherente de cada paso de procedimiento principal (cateterismo cardíaco, la recuperación de la sangre y el bazo, pulmón cosecha de BAL y los tejidos del corazón) es crítico para la generación de datos que permite la comparación robusta entre los grupos de tratamiento. Por lo tanto, se recomienda que al menos dos, y mejor tres, los investigadores colaborar para llevar a cabo el experimento. Además, es fundamental que los investigadores realizar el procedimiento sin el conocimiento de la identidad del grupo de los animales. Por lo tanto, la identificación de los datos tiene que ser hecho de una manera que oculta la identidad de grupo. Finalmente, es también importante que el orden en el que los animales son analizados es aleatorio. Por ejemplo, un identificador simple es la fecha de la prueba y la numeración consecutiva de los animales. Si hay por ejemplo 4 grupos de animales (AD), asignar la identificación y el estudio de los animales en el orden siguiente: date_1: Aa, date_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, y así sucesivamente.

Este flujo experimental permite un análisis en profundidad, el estudio simultáneo de los mecanismos moleculares que controlan la inflamación pulmonar y la función del corazón derecho. Los datos simultáneas y recogida de muestras logra una mejor idea de redes moleculares, y una reducción en el número de animales necesarios para obtener conocimiento biológico novedoso.

Tipo de tubo / vaso Solución (volumen) Utilización
Procesamiento de sangre
Eppendorf, 1,5 ml La sangre para suero
EDTA 2,0 ml recubierto La sangre para el plasma
Eppendorf, 0,5 ml Freeze suero o plasma Procesamiento de BAL
Polipropileno, de fondo redondo, 4,5 ml Recoger el lavado broncoalveolar
Polipropileno, de fondo redondo, 4,5 ml Congelar BAL sobrenadante
Placa de 96 pocillos, bordeó BAL células
Procesamiento de tejido
Polipropileno, 50 ml Formaldehído, 7,5 ml Fijar el tejido pulmonar
Eppendorf, 1,5 ml Ajustar lóbulo pulmonar congelación
Eppendorf, 1,5 ml Encaje corazón congelación derecho
Eppendorf, 1,5 ml Encaje corazón congelado izquierda
24-así placa Tampón Hanks, 0.5-1 ml Quick-almacenamiento de lóbulos pulmonares para su posterior isolation de células individuales
24-así placa Tampón Hanks, 0.5-1 ml Almacenamiento rápido de bazos para el aislamiento posterior de células individuales
24-así placa Tampón Hanks, 0.5-1 ml Almacenamiento rápido de los ganglios linfáticos para el aislamiento posterior de células individuales
Para los procedimientos
Vaso de precipitados de cristal, 300 ml Agua autoclave Hidratación y limpieza de catéter
Tubo de polipropileno, 50 ml Tampón de Hanks, 50 ml Realizar BAL
Tubo de polipropileno, 50 ml Tampón de Hanks, 50 ml Lave cánula traqueal
Tubo de polipropileno, 50 ml Desinfectante solución Limpieza de los instrumentos
Tubo de polipropileno, 50 ml 70% de etanol Clinstrumentos eaning
Tubo de polipropileno, 50 ml El agua del grifo Limpieza de los instrumentos

Tabla 1. Preparación y organización de los tubos y soluciones.

Instrumento Descripción Utilizar
Tijeras extremos redondeados o rectos 5,5 pulgadas, redondos o puntiagudos Zona A
Tijeras redondeado 4,0 pulgadas, finales afilados
Fórceps 4,5 pulgadas, doblado, con los extremos planos, de agarre
Fórceps 4,0 pulgadas, doblado, con los extremos planos, de agarre
Tijeras Delgado Blades/Angled- 9 cm Zona B
Los micro-tijeras Camionetanas Spring Tijeras - 2 mm Cuchillas
Fórceps fórceps (Dumon º 5 Fine)
Fórceps 4,0 pulgadas, doblado, con los extremos planos, de agarre
Fórceps 4,0 pulgadas, recto, con TV, puntas de agarre
Suture Sutura trenzada de seda 6-0
Catéter Presión catéter
Tijeras extremos redondeados o rectos 5,5 pulgadas, redondos o puntiagudos Zona C
Tijeras redondeado 4,0 pulgadas, finales afilados
Fórceps 4,5 pulgadas, doblado, con los extremos planos, de agarre
Fórceps 4,0 pulgadas, doblado, con los extremos planos, de agarre
Cánula Cánula traqueal
Suture Sutura de seda trenzada4-0

Tabla 2. Organización de los instrumentos, sutura, catéter, cánula traqueal.

Figura 1
Figura 1. Modelo esquemático de las áreas de trabajo. A) Trabajo-zona A para la grabación, de pesar, de recogida de sangre y tejido del bazo y el espacio de almacenamiento temporal de los animales. B) El trabajo de la zona B de la cateterización del corazón derecho. C) El trabajo de la zona C para la cosecha de BAL, los pulmones, los ganglios linfáticos del pulmón y los tejidos del corazón.

Figura 2
. Figura 2. Instrumentos utilizados para el procedimiento a) Instrumentos para el trabajo de la zona A; b) Instrumentos para la cateterización del corazón derecho (área de trabajo B), C) instrumentos de trabajo de la zona C. D) cánulas traqueales. La regla muestra el tamaño de los instrumentos.

Figura 3
Figura 3. Catéter cardíaco derecho. Catéter cardíaco derecho se muestra con marcas y cinta (A), o en poder de la mano (B). Los puntos Lápiz para las marcas hechas en el catéter (A). La inserción del catéter (CE): limpieza de la vena yugular derecha (C); vena se sutura a cabo con fórceps, el catéter se hace avanzar hacia un agujero previamente hecho en la vena (D); catéter después de la inserción en la vena (E). Las flechas apuntan hacia el catéter (D, E).

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Figura 4. Traza muestra de los cambios de presión en el corazón derecho. Las trazas muestran los cambios de presión (mmHg) en el tiempo (min: seg), el software muestra cada una de las curvas a dos velocidades diferentes. Las huellas de un ratón control (A), y un ratón con inflamación inducida remodelación pulmonar y la hipertensión arterial (B) se muestran. Curvas utilizadas para la medición de la presión sistólica del ventrículo derecho se destacan. Tenga en cuenta las mesetas clara presión en las curvas resaltadas. La flecha apunta a una curva que tiene un pico que indica un error técnico. Este tipo de punta de curvas no puede ser utilizado para la medición de la presión sistólica del ventrículo derecho. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 5. Localización de un ganglio linfático mediastínico / traqueobronquial en relación con las costillas y la columna vertebral. La flecha apunta al nodo linfático.

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Discussion

El flujo experimental descrito aquí permite la medición rápida y simultánea de la presión sistólica del ventrículo derecho y la cosecha de las muestras para el análisis de las respuestas en los pulmones, el corazón y el sistema inmune en ratones. El procedimiento combina mediciones cardíacas fisiología, micro-disección y posterior cosecha de tejidos para estudios de células vivas, el análisis histológico o ómicas-análisis de los tejidos. El procedimiento completo tarda menos de 20 min por ratón. Debido al flujo de trabajo del área de trabajo organizada, 2-3 animales se pueden estudiar simultáneamente. Por lo tanto, el procedimiento es adecuado para pequeños experimentos dirigidos 12 y las pantallas de gran escala realizadas en una amplia gama de ajustes, desde un pequeño laboratorio para un estudio farmacéutica.

La combinación de mediciones fisiología del corazón y la cosecha de tejidos se abre la posibilidad de realizar análisis diseñado para detectar redes biológicas que controlan o sincronizar corazón, un pulmónnd función inmune, utilizando transgénico y recursos de ratón KO. Una ventaja importante del flujo de procedimiento simultáneo es la reducción en el número de animales necesarios por estudio. Otra aplicación de este flujo de trabajo del procedimiento es la posibilidad de estudiar otros órganos o adicionales del mismo animal, según sea necesario.

El procedimiento descrito aquí genera los datos de presión del corazón derecho muy rápidamente, dentro de 5-10 minutos de la inducción de la anestesia. Esto hace posible el estudio de los animales mientras se respiraba aire ambiente espontáneamente. Una limitación de este enfoque es que es invasivo: los animales se anestesian, se colocan en la espalda, y un catéter se pasa a través de la vena yugular a través de la aurícula al ventrículo derecho. La limitación es también la ventaja de este procedimiento debido a que los datos representan mediciones directas de los cambios de presión en el tiempo en el ventrículo derecho. Otras mejoras técnicas, en particular basándose en la miniaturización del prcatéteres Essure, puede permitir colocar catéteres permanentes, que mora en ratones que permiten la grabación directa de la presión de la arteria pulmonar a través del tiempo de varias semanas, ya que se está realizando en ratas 22-24 y otros animales más grandes. Si la inserción de un catéter de corazón a través de la vena yugular en estrecha de pecho, con respiración espontánea animales no es posible, una grabación alternativa de los cambios de presión sistólica del ventrículo derecho se pueden hacer en animales ventilados por la apertura del tórax y la colocación de la sonda de presión a través de un incisión directamente en el ventrículo derecho 25. Mediciones no invasivas de la función cardíaca derecha se puede hacer mediante ecocardiografía. Este procedimiento puede realizarse antes de la cateterización cardiaca derecha, o ratones pueden ser examinadas por ecocardiografía para múltiples veces para estudiar la progresión de la enfermedad antes de las mediciones invasivas 5,14-17.

Otra aplicación de este procedimiento es obtener additional Datos. Como un ejemplo, utilizando un catéter que puede medir los flujos y la presión, la salida cardiaca derecha podría ser grabada simultáneamente junto con el derecho cambios de presión del corazón. El procedimiento descrito aquí también se puede utilizar para comprender mejor los cambios fisiológicos, celulares y moleculares que son desencadenantes de la hipertensión pulmonar distinta de la respuesta inmune, por ejemplo, mutaciones genéticas 8,10, la exposición al humo del cigarrillo 26, o infecciones microbianas 27-29 .

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, filial Fundadores (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fondo, Nueva York (SHP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

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References

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