Küçük Moleküler CLT1 Peptide Hedefli Kontrast Agent ile Prostat Kanseri MR Moleküler Görüntüleme

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Fare prostat kanseri modelinde tümör stroma içinde pıhtılaşmış plazma proteinlerine özel bir MRT-kontrast maddesi hedefleyen küçük peptid ile MR kanser moleküler görüntüleme göstermek için.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wu, X., Lindner, D., Yu, G. P., Brady-Kalnay, S., Lu, Z. R. MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent. J. Vis. Exp. (79), e50565, doi:10.3791/50565 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tümör hücre dışı matris Kanser, moleküler görüntüleme için biyolojik olarak kullanılabilir kanseri ile ilgili proteinlerin bol miktarda vardır. Bu çalışmada, tümör stromasında pıhtılaşmış plazma proteinlerine özel bir hedef MRI kontrast madde olarak Gd-DOTA monoamid kompleksi hedefleyen küçük bir molekül peptit ile etkili MR kanser moleküler görüntüleme gösterdi. Biz bir fare orthotopic PC-3 prostat kanseri modelinde MRG ile prostat tümör non-invaziv tespiti için ajanın etkinliğini değerlendirmek deney gerçekleştirdi. Hedeflenen kontrast maddesi Gd 0.03 mmol / kg 'lik düşük bir dozda anlamlı tümör kontrast üretmek için etkilidir. MRI kontrast ajanı hedeflenen peptit prostat tümörünün MR moleküler görüntüleme için umut vericidir.

Introduction

Kanseri ile ilgili moleküler hedeflerin etkili görüntüleme erken kanser teşhis ve tanıyı doğruluğunu artırmak için büyük önem taşıyor. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) yüksek uzaysal çözünürlük ve hiçbir iyonizasyon radyasyon 1 ile güçlü bir klinik görüntüleme yöntemidir. Ancak, hedeflenen kontrast ajan klinik MR kanser moleküler görüntüleme için kullanılabilir. Hedeflenen MRG kontrast maddelerin Yenilikçi tasarımı ve gelişimi büyük ölçüde MR kanser moleküler görüntüleme uygulamasını ilerlemek olacaktır. Önemli çabalar, kanser hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilen biyolojik MR görüntüleme için hedeflenmiş kontrast maddelerin geliştirilmesi için girişimlerde bulunulmuştur. Nedeniyle MRG ve bu biyolojik düşük konsantrasyonda nispeten düşük duyarlılığı, küçük moleküler hedefli kontrast maddeleri 2,3 kullanarak etkili MR moleküler görüntüleme için yeterli kontrast oluşturmak için bir meydan okumadır. Yeterli donanım elde edilmesi amacıyla, çeşitli iletim sistemleri sucparamanyetik Gd (III) şelatları yüksek bir yük ile, lipozomlar, nano partiküller ve polimer birleşiklerinin olarak h, hedef merkezler 4,5 kontrast maddelerin lokal konsantrasyonunu artırmak için hazırlanmıştır. Bu iletim sistemleri, hayvan modellerinde önemli tümör geliştirme elde etmek mümkün olmasına rağmen, bunların büyük boyutlarda ciddi bir güvenlik kaygıları 6 neden olabilir toksik Gd (III) iyonları, uzun süreli birikimi ile sonuçlanan, vücuttan yavaş ve eksik ortadan kaldırılması ile sonuçlanmıştır. Son zamanlarda, bazı çalışmalar, moleküler görüntüleme için MR sınırlamaları lezyonlarında yüksek lokal bir ifade ile, uygun belirteçler molekül seçilerek ve kolayca 7,8 atılır olabilir küçük moleküler maddeler kullanılarak aşılabilir göstermiştir. Bu ajanların en önemli özelliği normal dokularda çok az varlığı ile hastalıklı dokuda bol miktarda moleküler işaretçileri hedef olmasıdır. Kontrast maddelerin yüksek bir konsantrasyonu ile sonuçlanır yeterliyken, bu hedeflere bağlanabiliretkili MR moleküler görüntüleme için cient kontrast. Boyutları renal filtrasyon eşik değerinden daha küçük olduğu için, bağlanmamış kontrast maddeleri hali hazırda düşük arka plan gürültüsü ile vücuttan atılır. Biz bol tümör stroma var evrensel kanserle ilgili biyogöstergesini, pıhtılaşmış plazma proteinleri, seçilmiş ve normal dokularda 9 nadiren mevcuttur var. Biz güçlü PC3 prostat tümörü modeli 10 bağlanabilen spesifik ve dört Gd-DOTA monoamid çelatlar gösteren küçük bir hedef peptit CGLIIQKNEC (CLT1), ihtiva eden bir hedef kontrast ajanı sentezlendi. Burada, farelerde tümörleri tespit etmek için MR Kanser, moleküler görüntüleme için bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol Bir önceki çalışmada 11 uyarlanmıştır.

1.. CLT1 Peptide Gd-DOTA Konjügasyon

  1. Standart katı-faz peptid sentezi kullanılarak, bir 2-klorotritil klorür reçinesi (1.0 mmol) üzerine, Fmoc-korumalı amino asitlerden CLT1 peptid (CGLIIQKNEC) sentezler.
  2. Nihai amino asit ilave edildikten sonra, 2 saat boyunca 0 ° C'de DMF içerisinde talyum (III) trifloroasetat (1.09 g, 2.0 mmol, 2 eşdeğer) ile reçine lineer peptid (20 mi) dönüşür.
  3. Daha sonra, PEG konjugatı ve Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3.0 mmol) ile arka arkaya reaksiyona sokulması ile reçine üzerinde CLT1 peptid (1.0 mmol) of N-terminaline lisin sekans, ve Fmoc-Lys (Fmoc)-OH, (6 mmol) ihtiva eden bir ikinci parti.
  4. Piperidin ile Fmoc çıkarın. DOTA-tris (t-Bu) (4.58 g, her bir amino grubuna 8.0 mmol, 2 eşdeğer), 2 saat için reçine üzerindeki lizin dendrimer üzerindeki dört serbest aminler ile reaksiyona ekle.
  5. Son olarak, ayrılması ve ürünün korumasını kaldırmaktrifloroasetik asit, su, ve oda sıcaklığında 8 saat boyunca triisobutylsilane (TBS) (20 mi, 95/2.5/2.5) bir kokteyli ile muamele etmek suretiyle reçineden. Trifluoroasetik asit (TFA) ile yıkanarak, ardından süzme ile reçine çıkarın. Birleştirilen süzüntüler soğuk etil eter (200 mi), damla damla ekleme ile santrifüj ve etil eter ile 4x yıkayın. Renksiz bir katı (1.99 g,% 61 verim) vermek üzere vakum altında kurutun.
  6. 10 dakika boyunca Çözücü A içinde 20 dakika ve% 40-90 çözücü B için% 0-40 çözücü B bir gradyan çözücü içinde asetonitril (% 0.1 TFA) (% 0.1 TFA sulu solüsyon) kullanılarak hazırlayıcı HPLC ile ham ürün saflaştırarak .
  7. CLT1-dL-(DOTA) DI su içinde 4 (250 mg, 0.077 mmol) (15 mi) çözülür ve 1 M NaOH ile pH'ı 6'ya ayarlayın. Gd (OAc) 3 .4 H 2 O ekleyin (472 mg, 0.462 mmol, DOTA monoamid 1.5 eşdeğer) çözeltisine, kısımlar halinde, 1 M NaOH ile pH 6 olarak muhafaza edilirken. 48 saat için oda sıcaklığında reaksiyon çözeltisi ilave edin.
  8. Kompleks e kalıntı Gd (III)thylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (90 mg, 0.31 mmol) eklendi ve nihai ürüne CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 (169 mg,% 57) vermek üzere bir ebat eksklüzyon kolonu ile ham ürünü temizler.

2. Kontrast Ajanları karakterizasyonu

  1. Indüktif eşleşmiş plazma optik emisyon spektroskopisi ile Gd (III) içeriği ölçün.
  2. Bir matris olarak 2,5-dihidroksibenzoik asit (2,5-DHB) ile doğrusal modda matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon time-of-flight (MALDI-TOF) kütle spektrumları elde edin.
  3. Bir relaxometer ile CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4'ün kontrast ajanları ve nontargeted kontrol maddesi 60 MHz (1.5 T) farklı konsantrasyonları ile sCLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 sulu çözeltinin gevşeme süreleri ölçmek 37 ° C'de T 2 ölçmek için 500 yankıları ile T 1 ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill dizisi ölçmek için bir inversiyon-kurtarma darbe dizisi kullanın. T 1 ve T inci 2 relaksivitelerine hesaplayınGd konsantrasyonlara karşılık 1 / T 1 ve 1 / T 2 araziler yamaçlarından e ajanlar.

3. Ortotopik PC3 prostat tümörü ile Hayvan Hücre Kültürü Modeli Geliştirme

  1. / Ul PBS 2.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda,% 5 fetal sığır serumu ve penisilin / streptomisin / fungizon, tripsinizasyon ile hasat ve tekrar süspansiyon ile desteklenmiş RPMI ortamı içinde, yeşil floresan proteini (GFP) yapısal ifadesi ile kültür PC3 prostat kanseri hücreleri.
  2. CWRU Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir hayvan protokole göre Atimik Hayvan Core Tesisleri'nde, Case Western Reserve Üniversitesi (CWRU) at (4-5 haftalık) erkek NIH atımık çıplak fareler koruyun.
  3. Cerrahi yüzeyler% 2 klorheksidin çözeltisi püskürtüldü ve daha sonra emici perdeler ile örtülmüştür. Steril cerrahi eldiven işlem sırasında giyilirdi. Hayvan Ameliyattan önce, ip anesthetiz için Avertin (250 mg / kg) enjektefareler e. Seçenek olarak ise, ketamin / ksilazin / asepromazin 50/5/1 mg / kg 'lik bir konsantrasyonda kullanılabilir. Oftalmik merhem anestezi sırasında yeterli nemi korumak için fareye uygulanmıştır.
  4. Steril bir bisturi bıçağını kullanarak, yaklaşık 1 cm'lik bir uzunluğa da alt orta hat boyunca deri ve periton içinden küçük bir insizyon keserek ameliyat başlayın. Bir steril cerrahi örtü hayatta kalma ameliyatları sırasında insizyon etrafında kaplıydı.
  5. Yavaşça exteriorize ve prostat maruz prostat dorsal lobları stabilize. Bir 30 gauge iğne ile prostatın içine PBS (20 ul) in-GFP PC3 hücrelerinin süspansiyon enjekte edilir. Nihayet 12 AutoClip yara ile kesi kapatın.
  6. Post-prosedür izlenmesi için, 1 hafta boyunca günde iki kez hayvanları izlemek. Hastalığın belirtileri yeme eksikliği, üretra çevresindeki koyu idrar toplama ve zımba içinde mesane enfeksiyonu veya tıkanıklığına işaret olabilir kararsız yürüyüş içerir.
  7. 10 gün sonra, t kaldırmako zımba zımba sökücü kullanıyor. Tümör büyüklüğünü ve bu kilo kaybı, davranış sapmaları, ve motor kusurlar gibi ağrı herhangi bir kanıt değerlendirmek için günlük hayvan izleyin. Tümör büyüme sırasında ağrı etik izin verilen sınırı veya delil aşan bir tümör büyüklüğünü gösterdi hayvanları Euthanize.

4. Floresan Görüntüleme ve Histoloji ile peptidlerin tümör bağlanma özelliğinin teyidi

  1. Tümör hücrelerinin aşılanmasından sonra tümör büyümesinin yaklaşık 4 hafta görüntüleme ile başlamadan önce izin verir. Önceki peptid sondaların enjeksiyon, tümör varlığını doğrulamak için bir floresan kamera üzerinde canlı farelerde ile GFP floresan görüntü kazanır.
  2. IV Texas Red 10 nmol / fare 'lik bir dozda taşıyan farelerin tümör etiketli peptidleri enjekte edilir.
  3. Servikal dislokasyon ile daha sonra fareler 2 saat Kurban, tümör ve önemli organları toplamak ve bir floresan kamera üzerinde hemen görüntü. GFP (uyarma için yeşil ışık filtreleri kullanın: 444-490 nm; emisyon: 515 nm uzun-pass filtre, satın alma ayarları: 500-720 10 nm adım) ve Texas Red (uyarma için kırmızı ışık filtreleri: 576-621 nm; emisyon: 635 nm uzun geçiş filtresi; edinimi ayarları: 630-800 10 nm adım). GFP ve Texas Red için 150 msn 10 msn maruz kalma süresi.
  4. Hemen bütün doku floresan ölçümünden sonra, tümör dokuları toplamak formalin ile düzeltmek ve cryosection 5 mikron dilimler halinde.
  5. PBS ile yıkandıktan sonra, hemen konfokal lazer tarama mikroskobu 4 içeren bir montaj orta 1 damla ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), görüntü ile monte edilir.

5. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI)

  1. Yaklaşık 4 hafta, tümör hücresi aşılamasından sonra tümörler çapı 0,3-0,6 cm kadar büyümeye olanak sağlar. MRG çalışma için bir hacim radyo frekansı (RF) bobini ile 7 T MR tarayıcı kullanın.
  2. Izofluran indüksiyon odası içinde bir% 2 izofluran-oksijen karışımı ile fare anestezisi. Ophthalmic merhem anestezi sırasında yeterli nemi korumak için fare uygulanmıştır.
  3. Heparinize tuzlu su ile dolu bir 1.0 m uzunluğunda bir boru içine bir 30 gog iğne takın. Fare kuyruk damarı içinde kendi kendine yapılan kateter yerleştirin.
  4. Mıknatıs içine fare koyun ve bir burun konisi üzerinden% 1.5 izofluran-oksijen inhalasyon anestezi altında tutmak.
  5. Hızı ve solunum derinliği izlemek için karın üzerinde bir izleme sistemine bağlı bir solunum sensörü yerleştirin. Bir geri besleme kontrol sistemi vasıtasıyla mıknatıs içine sıcak havanın üflenmesi ile 37 ° C 'de vücut ısısını korumak.
  6. Tümör konumunu (TR / TE = 200/3.7 msn, FOV = tanımlamak için bir lokalizasyon dizisi kullanarak sagital kesit görüntüleri ile Başlayan 3.0 cm, kesit kalınlığı = 2.2 mm, dilim sayısı = 16, ortalama = 2, çevirme açısı = 45 °, matriks = 128 x 128).
  7. CE-MR (TR / TE = 151.2/1.9 msn, FOV = 3.0 cm x 3.0 cm, 2D eksenel görüntüler elde etmek için bir 2D T1-ağırlıklı gradient yağ baskılama sırasını kullanabilirsiniz sbitleri kalınlığı = 1.2 mm, dilim sayısı = 12, ortalama = 1 flip açısı = 80 °, matriks = 128 x 128).
  8. Enjeksiyon öncesi taban çizgisi MR Görüntü alındıktan sonra, 200 ul serum fizyolojik ile yıkanarak 0.03 mmol Gd / kg 'lik bir dozda hedef madde veya kontrol maddesi enjekte başlar.
  9. Kadar 30 dakika boyunca farklı zaman noktalarında CE-MRI görüntüleri elde etmek için devam edin.

6. Görüntü İşleme ve Analizi

  1. Görüntü analizi için görüntüleme yazılımı kullanın.
  2. Iki boyutlu görüntüleme düzlemde bütün tümör üzerinde faiz (ROI) ve bölgeleri ve böbrekler çizin ve ortalama sinyal yoğunluğunu ölçmek.
  3. (S 0 - ΔSNR = (S t / σ t): CE-MRG verileri ölçmek için, aşağıdaki denklem kullanılarak kontrast öncesi SNR aşırı kontrast sonrası SNR'de artışın hesaplanmasında ile tümör veya böbrek kontrast (ΔSNR) ölçmek / σ 0), S 0 ve S t varolmadığı iddiası sinyalini göstermek neredeya da ya da böbrek önce ve kontrastı ve σ 0 ve σ t sonra kontrast önce ve sonra arka plan havadan ölçülen gürültü standart sapmadır.
  4. P <0.05 istatistiksel anlamlılık varsayarak, öğrencinin iki yönlü t-testi kullanılarak p değerlerini hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, bu hedef kontrast madde CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 ve deney genel düzeni sentezini tasvir etmektedir. Klinik Gd-DOTA (Tablo 1) 'den CLT1-dL-(Gd-DOTA) Şekil 4, çok daha yüksek relaksivitesi. 1.5 T de, PBS içinde CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 (pH 7.4) gadolinyum başına T 1 relaksivitesi Gd-DOTA 10 daha yaklaşık 3 kat daha fazladır. Spesifik olmayan (sCLT1-TR) (Şekil 2) bağlama çok az bir tümör göstermektedir peptidi karıştırılmış ise Maestro görüntüleme, Red normal organlarda ve dokularda çok az bağlanma ile tümöre CLT1 (CLT1-TR) etiketli Texas bağlanmasını güçlü özgün teyit etmektedir. Şekil 3 tipik öncesi gösterir ve gelişmiş enjeksiyon sonrası kontrast (CE) T 1-ağırlıklı görüntüler. Hedeflenen madde hedefli olmayan karıştırılmış etkenlerle karşılaştırıldığında, tümör dokusunda daha büyük ve daha fazla geliştirme ile sonuçlanır. Mesanede kontrast geliştirme giderek üzerinde artarzaman, kontrast maddeler, renal filtrasyon yoluyla atılır olduğunu göstermektedir. Kantitatif sinyal analiz hedef madde, 30 dakika kadar olan kontrol maddesi (p <0.05), tümör dokusunda daha büyük bir sinyal artırmakta olduğunu ortaya koymaktadır. Çalışma biyolojik dağılım maddesi enjeksiyondan 2 gün sonra, ana organlarda ve dokularda minimal Gd tutmaya sahiptir gösterir. Bizim ön-hazırlık veri CLT1 MRI kontrast ajanları, özellikle nispeten düşük bir doz (klinik dozun üçte biri) de tümör teslim edilebilir hedef olduğunu göstermektedir.

r 2 (mM -1. s-1) r 1 (mM -1. s-1) Gd içeriği (mmol-Gd / g)
başına Gd molekül başına başına Gd per molekül
CLT1-(Gd-DOTA) 4 10.1 ± 1.0 40.4 ± 3.0 13.0 ± 3.1 52.0 ± 9.6 1.05 ± 0.10
sCLT1-(Gd-DOTA) 4 11.5 ± 1.4 46.0 ± 5.0 12.4 ± 0.3 49.6 ± 1.3 0.97 ± 0.08
Gd-DOTA 4 2.9 * 2.9 * 3.2 * 3.2 *

Tablo 1. 1.5 T de hedef karıştırılmış ve MRI kontrast ajanları fiziko kimyasal özellikleri, 37 ° C (* 37 ° C sıcaklıkta su içinde Gd-DOTA için relaksiviteler referans 10) bulunuyor.

Şekil 1
> Şekil 1,. Sentez prosedürü ve genel deney grafiksel anlatımı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. CLT1-TR bağlanmasını Tümör. CLT1-TR (A) ve hedefli olmayan sCLT1-TR (B) Hedeflenen 10 nmol / fare 'lik bir dozda ortotopik PC3-GFP prostat taşıyan çıplak farelere, atimik damardan enjekte edilmiştir. 2 saat sonra, tümör ve çeşitli organlar toplandı ve görüntülenmiş. Yeşil floresan görsel PC3-GFP tümör hücrelerinden bulunmaktadır. Red floresan görsel CLT1-TR (A) ve sCLT1-TR (B) probları vardır. 1.. tümör, 2. dalak; 3. kalp, 4. böbrek, 5. testis; 6. karaciğer, 7. akciğer; 8. kas, 9. beyin.565fig2highres.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Şekil 3,. Örnek T1 ağırlıklı aksiyal gradient 2D ortotopik PC-3 insan prostat tümörü görsel CLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 (A) ve sCLT1-dL-(Gd-DOTA) 4 (B) damar içine enjekte edilmesinden önce ve sonra en nu / nu fareler kırmızı bir daire ve yeşil bir daire ile etiketlenmiş mesane ile etiketlenmiş. Tümör 0.03 mmol Gd / kg. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritik Adımlar

Uygun Biyomarker ve küçük peptid Hedefleme Seçimi

Başarılı küçük boyutu ile bir hedef kontrast madde geliştirmek için, iki önemli noktaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, normal dokularda çok az varlığı ile hastalıklı dokuda bol miktarda mevcut olan, uygun moleküler belirteçler seçmek önemlidir. Bizim seçilmiş kanserle ilgili belirteçler, pıhtılaşmış plazma proteinleri, bu gereksinimi karşılar. Yeterli kontrast maddeler yeterli kontrast sonuçlanan bu hedeflere bağlanan, böylece İkinci olarak, seçilen hedeflenen düşük moleküler maddeler, biyolojik için yüksek bağlanma afinitesine sahip olmalıdır. Bu çalışmada, 11 tümör de pıhtılaşmış plazma proteinlerine güçlü özgün bağlanma gösteren pıhtı-bağlama peptidi CLT1 seçtik.

Ajan Synthesis Kontrast

Peptit sentezi içerir öküzNihai siklik CLT1 peptid oluşturmak üzere, lineer peptid molekülde iki tiyol grubu idizing. Peptit siklizasyon genellikle potansiyel toplanmasını, dimerizasyonu ve oligomerizasyon en aza indirmek için düşük bir konsantrasyonda çözelti içinde yapılır iken, on-reçine siklizasyon yalancı seyreltme olgusunun yararlanır yanı sıra basit yıkama ve süzme 13 ile reaktiflerin kaldırılması. Bizim sentez prosedürü, biz onu tutarken talyum (III) trifloroasetat çok zehirli ve bakımı olmasına rağmen, yüksek verim ve az eşleşme ile iyi çalışır triflüoroasetat talyum (III) kullanarak-reçine halkalandırma alınması gerektiğini bulabilirsiniz. İkinci bir yaklaşım, düşük peptid konsantrasyonda çözelti içinde,% 20 DMSO kullanır. Bununla birlikte daha fazla adım DMSO çıkarmak için gerekli olan ve büyük hacimli solüsyon liyofilize daha uzun sürer. Her iki yöntem kullanılarak, moleküller arası disülfid bağının tam oluşumu emin olmak için önemlidir. Gd sahip peptid ligand kompleks olduğunda, serbest tioller uyarabilirönemli toplamalardan tampon maddesi içinde eser metaller polimerizasyonun 14 oluşturmak için sistein overoxidation sonuçlanan hava oksidasyonunu katalize için. Bu, genellikle önemli ölçüde nihai ürünün verim ve saflıkta azaltır. Emin tam disülfid bant oluşumu için, öncelikle dimer ya da daha yüksek oligomer oluşumu ile sonuçlanan moleküller arası disülfid bağının oluşmasını önlemek için hafif oksitlenme koşulları kullanmak gerekir. İkinci olarak, yeterince uzun reaksiyon süresi, tüm tiol grupları Gd birleşme aşamasından önce okside emin olmak için muhafaza edilmelidir.

Fare kuyruk damarının Hayvan Modeli ve kanülasyonu

Hayvan tümör modeli ve kuyruk ven kanülasyonu hazırlanması da bu işlemin çok önemli yönleri vardır. Ameliyat sırasında, araçlar / tezgah fareler yaralamak veya öldürmek olabilecek potansiyel enfeksiyonu önlemek için temiz ve steril tutulmalıdır. Enjeksiyon öncesi ve sonrası fareyi hareket önlemek içintion, mouse kuyruk ven cannulate gereklidir. , Kanülasyon için hazırlayın kateter göbeğinden bir 30 gauge iğne kırmak ve 1.0 m uzunluğunda bir boru içine kör uç takın ve% 1 heparinize tuzlu su ile yüklü bir şırıngaya Hortumun diğer ucunu bağlamak için. Tüp doldurmak için şırınga itin. Sıcak su (~ 105 ° F) ile kuyruk dilate edin. Damar içine iğne takın. Tüp içine kan akış kateterin başarılı ekleme gösterir. İğne ven olduğunu doğrulamak için, hafifçe şırınga itme ve tuzlu düzgün damar tuzlu su küçük bir miktar enjeksiyonu ile temizlenir, enjekte edilebilir. Tarayıcıya fareyi geçmeden önce bant ile yerde kateter sabitleyin.

Sınırlamalar ve Olası Değişiklikler

Bazı sınırlamalar mevcut çalışmada bulunmaktadır. İlk olarak, ön sonuçlarından biz sh rağmen CLT1 hedefleme sitesinden çok çabuk yıkar farkOWS tümöre bağlama mükemmel. in vivo proteolitik bozulma olasılığı CLT1 ve kararsızlığa sebep olur. Proteolitik bozulmaya karşı korumak için CLT1 modifikasyonu stabilitesini geliştirmek ve in vivo wash-out süresini uzatmak gerekmektedir. Doğal L-tipi amino asitlerin yerine D-tipi amino asitleri, bu hedefe ulaşmak için potansiyel bir stratejidir. İkincisi, mevcut çalışma CLT1 peptid bağlar pıhtılaşmış plazma proteinlerine hangi tam bileşenleri açıklamak değil. Son olarak, özellikle nispeten düşük bir verim ve yüksek maliyet ile katı faz sentezi kullanılarak kontrast ajanları sentez. Bir sıvı faz sentez yöntemi geliştirmek veriminin arttırılması ve maliyeti daha düşük olmalıdır.

Uygulamalar

Biz kontrastlı MRG ile küçük malign tümörlerin doğru tespiti için teknikler geliştirmektedir. Hedef madde ile MRI kanser, moleküler görüntüleme için daha etkili ve daha güvenli bir alternatif sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği GRA Bahar 09 Doktora Sonrası Bursu (09POST2250268) ve NIH R01 CA097465 tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz çok tümör implantasyonu üzerine ona yardım için Dr Wen Li ve Dr Vikas Gulani MRG protokolü test ve kurulum için, ve Bayan Yvonne Parker teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Fmoc protected amino acids EMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu) TCI America
PyBOP, HOBt, HBTU Nova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS Sigma-Aldrich Corp.
Texas Red, succinimidyl ester, single isomer Invitrogen T20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 HPLC system Agilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column Agilent
ICP-–S Optima 3100XL Perkin-Elmer
MALDI-TOF mass spectrometer Bruker AutoflexTM Speed
Maestro FLEX In Vivo Imaging System Cambridge Research Instrumentation, Inc.
Biospec 7T MRI scanner Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
  2. Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
  3. Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
  4. Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
  5. Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
  6. Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
  7. Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
  9. Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
  10. Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
  11. Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
  12. Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
  13. McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3, (3), 193-198 (1996).
  14. Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335, (1), 168-170 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics