Levande cell imaging av Primär Rat Neonatal Cardiomyocytes Efter Adenoviral och Lentiviral Transduction Använda Konfokal Spinning Disk mikroskopi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Primär råtta neonatal cardiomyocytes är användbara i grundläggande in vitro kardiovaskulär forskning, eftersom de lätt kan isoleras i stort antal i ett enda förfarande. På grund av framsteg inom mikroskopteknik är det relativt enkelt att fånga levande cellbilder i syfte att undersöka cellulära händelser i realtid med minimal oro angående fototoxicitet till cellerna. Detta protokoll beskriver hur man tar levande cell Timelapse bilder av primär råtta neonatal cardiomyocytes med hjälp av en konfokala spinning disk mikroskop efter lentiviral och adenoviral transduktion för att modulera egenskaper i cellen. Tillämpningen av två olika typer av virus gör det lättare att uppnå en lämplig transduktion ränta och uttrycksnivåer för två olika gener. Väl fokuserade levande cellbilder kan erhållas med hjälp av mikroskop s autofokussystem, som upprätthåller stabil fokus under långa tidsperioder. Att tillämpa denna metod, funktioner exogent ingenjöred proteiner som uttrycks i odlade primära cellerna kan analyseras. Dessutom kan detta system användas för att undersöka funktionen av gener genom användning av siRNA liksom av kemiska modulatorer.

Introduction

Primära råttneonatala hjärtmuskelceller har länge använts för att undersöka cardiomyocyte funktion in vitro 1. De är lätta att isolera från råttungar av flera väl etablerade metoder 2-4. Den vanligaste metoden använder kollagenas eller trypsin för att smälta bindväv av hjärtat före cellisolering. Forskare har också utvecklat metoder för att isolera hjärtmuskelceller från vuxna gnagare 5-8 samt neonatala möss 9,10.

Detta protokoll beskriver en metod för isolering av kardiomyocyter från neonatala råttungar, som utnyttjar en två-stegs enzymdigere procedur. Trypsin används först O / N vid 4 ° C, och sedan renade kollagenas vid 37 ° C. Inkubation av hjärtvävnad med trypsin O / N vid 4 ° C reducerar nödvändiga åtgärder för att skörda celler jämfört med metoder som använder sekventiella inkubationer i en varm enzymlösning 2. Dessutom, genom användning av renat collagenase snarare än råa enzymer, kan mycket-till-lot variation elimineras, vilket ger förbättrad reproducerbarhet.

Funktionella studier av ett särskilt protein har man ofta en proteinexpressionssystem med användning av ett adenovirus 11 till 13 och / eller ett lentivirus 14-16. [Varnande anmärkning] Den virala produktion och manipulation bör utföras enligt NIH riktlinjer.

Adenovirus integrerar inte in i värdgenomet. Den har en mycket hög effektivitet av transduktion i de flesta celltyper, inklusive delande celler och icke-delande celler, såväl som primära celler och etablerade cell-linjer. Detta gör adenovirus en tillförlitlig vektor för genuttryck. Höga nivåer av det protein som kodas av adenovirusvektorn utvecklas inom 48 timmar efter transduktion, och de kan pågå i flera veckor 17. Men en nackdel med att använda ett adenovirus för proteinexpression är att utvecklingen av en rekombinant adenovirus är både komplicerat och tidskrävande. Denna nackdel förklarar delvis varför många forskare har vänt sig till lentiviruses för rekombinant genuttryck. Till skillnad adenovirala konstruktioner, genererar en lentiviral konstruktion är snabbt och enkelt. Även lentiviruses har generellt lägre effektivitet på transduktion än adenovirus, både delande och icke-delande celler, de integreras i värdgenomet. Följaktligen är uttryck för den omvandlade genen stabilare för lentiviruses än för adenovirus.

På grund av tekniska framsteg inom området mikroskopi, är det mycket lättare att fånga levande cell bilder av celler som uttrycker rekombinanta proteiner. Detta gäller även vid videohastighet hastigheter på förvärv. Detta möjliggör för forskaren att bestämma hur vissa förändringar i proteinet av intresse funktionellt påverka cellen i realtid. Den konfokala spinning disk mikroskop har flera viktiga funktioner som gör det en optimal teknik för live cell imaging 18,19. Den Yokogawa snurrande skiva möjliggör en mycket snabbare bildtagning, medan samtidigt utnyttjar mycket mindre lasereffekt än punkt scanning konfokala mikroskop. Båda dessa särdrag är på grund av den roterande skiva, som innehåller ett flertal konfokala hål genom vilket lasern passerar samtidigt till proverna. Vid förvärv, själva disken snurrar snabbt och kontinuerligt 18-20. Genom att använda autofokussystemet i mikroskopet, är stabil fokus bibehålls under långa tidsperioder. Detta gör det möjligt för forskare att ta väl fokuserade levande cellbilder. Förvärvade bilderna spelas upp som en filmfil. Bilderna analyseras med hjälp av bildanalys program som ImageJ 21,22, FIJI 23, eller annan kommersiellt tillgänglig programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering av råtta neonatal cardiomyocytes

  1. Använd Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med fetalt bovint serum (FBS) och penicillin / streptomycin (P / S) som odlingsmedium. Lägg bromodeoxiuridin (BrdU) till mediet för att förhindra tillväxt av fibroblaster för de första två dagarna efter isoleringen.
Basmedium FBS BrdU (mM) P / S-(U / ml)
val DMEM 10% 0 20
Den första dagen DMEM 10% 0,1 10
Nästa dag DMEM / MEM 5% 0,1 10
Ytterligare kultur DMEM / MEM 5% 0 10

Tabell 1:. Medium för råtta neonatal cardiomyocytes Använd detta medium för odling av råttneonatalhjärtmuskelceller. DMEM / MEM är 01:01 blandning av DMEM och MEM-medium.

  1. Cardiomyocyte isolering, dag 1 (Beräknad krävs tid, ca 1 tim)
    OBS: För arbete med neonatal gnagare, se lokala riktlinjer för universitets och regler som fastställts av djurvårdsprogram, och hålla sig till institutionellt godkända djurprotokoll. Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén för Yale Animal Resource Center.
    1. Förbered reagens och verktyg: kalcium-och magnesium-fri Hanks balanserade saltlösning (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, på is; 1 mg trypsin, beredning med 2 ml av CMF HBSS, på is; autoklaveras verktyg; 70% etanol (EtOH) i 250 ml bägare; fyra steriliserade 10 cm plastskålar, tre för isolering av hjärtan och en för trypsinization.
    2. Order 1 litter av 1-till-2-dagar gamla råttungar (ca 10 valpar) med sin mor från ett försöksdjur distributören.
    3. Dag 1, Ta valpar för liten bur och avliva dammen med en ketamin / xylazin cocktail (ketamin, 200ml/10g och xylazin 20ml/10g) överdos.
    4. Ta en valp och sterilisera hela sin kropp med 70% EtOH. Halshugga valpen med välskötta vassa kirurgiska sax på en steriliserad 10 cm plastskål på en plats isolerade från andra valpar.
      OBS: För att så snabbt som möjligt samla in prover, är det bäst att använda en så snabb och effektiv metod för att avsluta livet av gnagare. Halshuggning vid korrekt användning av skickliga yrkesmän med välskött utrustning kan leda till mindre rädsla och oro för djuret och bli snabbare och mer praktiskt än andra former av dödshjälp. Det är i linje med rekommendationerna från American Veterinary Medical Association Riktlinjer för eutanasi av djur.
    5. Avlägsna slå hankonst med steriliserade verktyg, och satte hjärtat i 30 ml is kyld CMF HBSS i 50 ml koniska rör. OBS: Ta hjärtan så fort som möjligt och sätta dem på is omedelbart. Efter avlägsnande av hjärtan från kroppen, bör alla förfaranden göras på is.
    6. Samla 5 hjärtan i 30 ml is kylda CMF HBSS och de återstående 5 hjärtan i ytterligare 30 ml is kylda CMF HBSS. Snurra röret att skölja hjärtan. OBS: Efter detta steg, utföra alla procedurer i ett laminärt flöde huva.
    7. Avlägsna supernatanten och överför de hjärtan för en ny steriliserad 10 cm plastskål på is. OBS: Var noga med att inte aspirera hjärtan med sug.
    8. Ta bort stora kärl och / eller oönskade vävnader. Tillsätt 10 ml is kylda CMF HBSS till skålen för att skölja hjärtan.
    9. Överför alla hjärtan för en ny steriliserad 10 cm plastskål på is. Finhacka hjärtan med sax till mindre än 1 mm 3 på is.
    10. Lägg till 9 ml kyld CMF HBSS. Tillsätt 1 ml kyld trypsin upplösningstats med CMF HBSS (slutlig 50 ug / ml).
    11. Förslut skålen med parafilm och täcker den med aluminiumfolie och sedan placera den i kylrum (4 ˚ C) över natten.
  2. Cardiomyocyte isolering, Dag 2 (Beräknad krävs tid, ca 4 tim)
    1. Förbered reagenser och verktyg: 50 ml koniskt rör x 2; 2 mg trypsin inhibitor, rekonstitueras med 1 ml CMF HBSS, på is; 1500 enheter kollagenas, rekonstitueras med 5 ml av Leibovitz L-15, vid rumstemperatur (RT); Leibovitz L-15, rekonstitueras med 1 liter steriliserat vatten och filtrera genom ett 0,22 mikron filter, 8 ml vid RT; 10 mg / ml (32,6 mM) BrdU i vatten; P / S; DMEM + 10% FBS; MEM; två 10 cm plastcellodlingsskålar; 3,5 cm glas botten rätter.
    2. Dag2, Förbereda gelatinbelagda rätter. Tillsätt 1 ml 0,1% gelatinlösning för att belägga en 3,5 cm glas nedre skålen för ett avbildningsexperiment. Inkubera skålar vid 37 ˚ C under flera timmar, sedan aspirera och kasta gelatinlösning före användning.
      NEJTE: En 3,5 cm glas nedre skålen är lämplig för en avbildningsexperiment med hjälp av en fluorescerande mikroskop. För att extrahera proteiner från primära cardiomyocytes att upptäcka proteinuttryck genom Western blotting (WB), kan 0,1% gelatin belagda plastcellodlingsskålar användas.
    3. Överför alla hjärtvävnad ned av trypsin natten med buffert till en 50 ml koniskt rör på is i steriliserade huva. Tillsätt 1 ml trypsin inhibitor i CMF HBSS (sista 182 ug / ml). Stäng locket på 50 ml koniskt rör tätt för att förhindra förorening.
    4. Inkubera röret under cirka 30 min i en 37 ˚ C inkubator för att värma vävnad och buffert till 30-37 ˚ C. Tillsätt 5 ml kollagenas i Leibovitz L-15 (slutlig 94 enhet / ml). Inkubera vid 37 ˚ C i 45 minuter med försiktig skakning (170-200 rpm shaker i 37 ˚ C inkubator).
      OBS: Detta steg kan göras utanför laminärt flöde huva. Alla efterföljande steg bör göras vid RT.
    5. Desinfektion av utsidan av ett 50 ml koniskt rör med 70% EtOH och sättaden i den steriliserade huva.
    6. Finfördela vävnader med hjälp av automatisk pipett med pipettering på 3 ml / sek i hastighet för 20 gånger. Låt vävnadsrester för att nöja sig med 3 min och filtrera supernatanten med en 70 um cell sil.
      OBS: En vanlig storlek 10 ml pipett kan användas för finfördelning.
    7. Tillsätt 5 ml av Leibovitz L-15 till de återstående vävnadsklumpar och finfördela och filtrera supernatanten igen. Tvätta cell sil med 2 ml av L-15 Leibovitz.
    8. Placera filtrerade cell lösning i en huv i 20 - 60 min för att låta kollagenas att smälta den delvis nedbruten kollagen.
    9. Sediment cellerna vid 100 x g under 5 min. Återsuspendera cellerna i 20 ml av DMEM innehållande 10% FBS och hög koncentration P / S (20 U / ml).
    10. Pre-platta celler på två 10 cm plastcellodlingsskålar för 1 timme i CO2 inkubator vid 37 ˚ C för cardiomyocyte val. OBS: Fibroblaster fäster lättare till botten av skålen än hjärtmuskelceller.
    11. While väntar, förbereda DMEM innehållande 10% FBS, P / S (10 U / ml) och 0,1 mM BrdU. Tillsätt 1 ml 10 mg / ml BrdU till 325 ml DMEM innehållande 10% FBS och P / S.
    12. Snurra rätter försiktigt och samla in cardiomyocyte innehåller supernatanten från två 10 cm rätter.
      OBS: De flesta hjärtmuskelceller kommer fortfarande vara flytande i det överstående efter 1 timme av inkubation. För att undvika kontaminering med fibroblaster som lätt är kopplade till skålen, inte samla in supernatanten genom pipettering.
    13. Tillval> Räkna celler i supernatanten med och utan 0,2% trypanblått för att kontrollera cellens livskraft.
    14. Sediment cellerna vid 100 x g under 5 min. Återsuspendera cellerna i DMEM innehållande 10% FBS, P / S (10 U / ml) och 0,1 mM BrdU. Plate celler vid 2 x 10 5 celler / skål i gelatinbelagda 3,5 cm glas botten rätter för observation med hjälp av mikroskop. OBS: Inte störa celler efter bordläggning under minst 24 timmar i CO2 inkubator vid 37 ˚ C.
    15. Dag 3, ChaNGE medel 24 timmar efter plätering med DMEM / MEM innehållande 5% FBS, P / S och 0,1 mM BrdU.
    16. Dag 4, Ändra medel 48 timmar efter bordläggning till DMEM / MEM innehållande 5% FBS och P / S.
      OBS: Byt medel var 2-3 dagar med DMEM / MEM innehållande 5% FBS och P / S.

2. Lentiviral transduktion

  1. Förpackningar av lentivirala plasmider
    OBS: Se andra källor för ytterligare fördjupad information om detta ämne 24-26. Det tar ca 3 dagar att förbereda lentiviral lösningen. Det är bäst att använda färsk lentiviral lösning för att uppnå högre effektivitet transduktion. Starta förpackning av lentivirala plasmider och isolering av råtta neonatal cardiomyocytes parallellt. I stället för användning av polyetylenimin (PEI) 27 för förpackning av lentivirala plasmider, kan användas ett kommersiellt tillgängligt transfektionsreagens. Följ tillverkarens instruktioner.
    1. Förbered reagenser och verktyg; HEK293T-celler, 10 cm plastcellkulturskålar, lentivirala plasmid lösningar (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral transfer vector, 1,0 mg / ml vardera), 1 g / l PEI, serumfritt medium, 20 mM klorokin i vatten, 10% blekmedel, 1% SDS i 70% EtOH
    2. Dag 0, Plate 2-2,5 x 10 6 HEK 293T celler per 10 cm skålen dagen innan transfektion.
      OBS: 30-60% sammanflödet vid transfektion är optimal.
    3. Dag 1, Förbereda PEI transfektion lösning. Tillsätt 30 ul av 1 g / l PEI till 960 ul serumfritt medium i ett 1,5 ml rör. Lägg fyra plasmider in i PEI transfektion lösning i 1,5 ml rör, och blanda med gängning.
    Namn av plasmid Obs Storlek (kbp) volym tillsatt (ml) Slutliga beloppet i 10 cm skål (mg) Slutlig koncentration i 10 cm skål (pM)
    Lentiviral överföringsvektor kodar för genen som skall förpackas 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE uttrycker HIV-1 gag / pol 8,8 1,76 1,76 30
    pRSV-Rev uttrycker HIV-1 Rev 4,1 0,82 0,82 30
    pMD2.G uttrycker VSV-G 5,8 1,16 1,16 30

    Tabell 2:. Mängden plasmider för lentiviral förpackning Använd dessa plasmid uppgår för transfektion HEK293-celler i 10 cm rätter. Slutlig mängd lentiviral överföringsvektor per fat kan variera beroende på dess storlek, underhålla slutkoncentration per fat på 60 pM. Den genomsnittliga molekylvikten av ett baspar av dubbelsträngad DNA är 660 dalton.

    1. Kasta gammalt mediumfrån 10 cm skål av HEK 293T celler, och försiktigt till 9 ml nytt medium (DMEM + 10% FBS, utan P / S).
    2. Lägg PEI-DNA-blandningen försiktigt droppvis på plattan och snurra försiktigt för att blanda med medium. Tillsätt 10 ul av 20 mM klorokin (slutlig 20 uM) till 10 ml medium. OBSERVERA: Klorokin tros minska nedbrytningen av plasmidinnehållande transfektion komplexen genom partiell neutralisering av pH inom lysosomala fack 28.
    3. Inkubera i CO2 inkubator vid 37 ˚ C i 6 timmar. Ta sedan bort medium innehållande PEI-DNA-blandningen och tillsätt 10 ml nytt medium (DMEM + 10% FBS + 20 mM 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), pH 7,4 + P / S) . NOTERA: Efter inkubation viruset kommer att produceras i mediet. Aspire Pasteur pipetter och / eller tips måste dekontamineras med 10% blekmedel. Sanera alltid biologisk säkerhet skåp yta och potentiellt kontaminerad utrustning med 70% EtOH oavsett om supernatant har spilltseller inte. Om spill har inträffat, som är nödvändigt för grundlig dekontaminering med 1% SDS i 70% EtOH.
    4. Dag 2-3, Inkubera i CO2 inkubator vid 37 ˚ C under 48-72 timmar. Dag 4, samla lentiviral lösning (fortsättningsvis avsnitt 2.2).
      OBSERVERA: Medel kan ändras när som 48 timmar efter transfektion. Samla virussupernatant 48 timmar och 72 timmar två gånger kan åstadkomma för att få högre titer virus lösningar.
  2. Insamling av lentiviral lösning och transduktion
    1. Förbered reagens och verktyg: 15 ml koniska rör, 1 M HEPES, pH 7,4 (0,22 um filtrerat)
    2. Dag 4, Samla supernatanten innehållande lentivirus partiklar (lentiviral lösning) med 10 ml sterilt Luer-Lok spruta och filtrera supernatanten genom 0,45 um filtrera in i en 15 ml koniska rör. Lägg 1/100 volym av 1 M HEPES pH 7,4 till filtrerades Lentiviral lösning (slutlig 10 mM).
      OBS: För filtrering, endast använda cellulosa esstate eller polyetersulfon (PES) (låg proteinbindning) filter. Använd inte nitrocellulosafilter. Nitrocellulosa binder ytproteiner på lentiviral kuvertet och förstör viruset.
    3. Ta bort mediet från 3,5 cm rätter av råtta neonatal hjärtmuskelceller, som erhållits vid det sista steget i Avsnitt 1.2, tillsätt 1 ml filtrerad lentiviral lösning på 3,5 cm skålen.
    4. <Optional> Lägg hexadimetrinbromid (slutlig koncentration 4-6 ug / ml).
      OBSERVERA: hexadimetrinbromid kan förhöja Lentiviral transduktion effektivitet. Koncentration av hexadimetrinbromid bör optimeras.
    5. Inkubera skålen för 6 timmar i CO2 inkubator vid 37 ˚ C för lentiviral transduktion, sedan byta medium till ny DMEM / MEM innehållande 5% FBS och P / S. Inkubera skålen i CO2 inkubator vid 37 ˚ C under 3 dagar.
      OBS: Integrering av den exogena genen i värdgenomet genom lentivirus anses vara avslutad 72 timmar.
    6. Dag 7, använder celler från steg 2.2.5 för nästa steg. OBS: Protein expression från Lentiviral plasmiden kan bekräftas genom WB eller immunocytokemi (ICH) efter 48 till 72 timmar efter transduktion, för att bestämma den relativa expressionsnivån (fig 1a och 1b).
  3. Koncentration av lentiviral lösning
    OBS: Det är bäst att använda färsk lentiviral lösning för att uppnå högsta transduktion effektivitet, ifall lentiviral lösningen titer inte är tillräckligt hög, den lentiviral lösningen kan koncentreras genom polyetylenglykol (PEG) 29.
    1. Framställning av 4x PEG-lösning (32% PEG6000, 400 mM natriumklorid (NaCl), 40 mM HEPES pH 7,4)
      1. För 125 ml 4x PEG-lösning, väger 40 g PEG6000, sedan lösa upp den i 60 ml vatten.
        NOTE: NOTE: (. Dvs medelmolekylvikt av PEG6000 är 6000) Siffran efter PEG är den genomsnittliga molekylvikten
        OBS: 2.3.1.2) långsamt 10 mlav 5 M NaCl. Långsamt 5 ml 1 M HEPES pH 7,4. Justera pH till 7,4 med användning av 2 M natriumhydroxid.
        OBSERVERA: 2.3.1.3) Tillsätt vatten till 125 ml. Sterilisera 4x PEG-lösning genom membranfiltrering med en 0,22 um filter och förvara den vid 4 ˚ C.
    2. Lentivirus koncentration
      1. Filter lentiviral transducerad supernatanten i ny 50 ml tub med hjälp av en 0,45 um filter.
        NOTERA: 2.3.2.2) Lägg till 4x PEG-lösning 1:03 ratio (PEG-lösning: supernatant = 1:3). Förvara vid 4 ˚ C i 16-48 timmar.
        NOTERA: 2.3.2.3) Centrifugera vid 2600 x g vid 4 ˚ C i 30 min. Kasta bort supernatanten och centrifugera vid 2600 x g vid 4 ˚ C under 5 min.
        OBS: 2.3.2.4) Kassera supernatanten försiktigt för att undvika att störa pelleten. Återsuspendera pelleten i serumfritt medium med användning av 1/2 till 1/25 volym av den ursprungliga supernatanten volym.
        OBS: 2.3.2.5) Använd direkt eller frysa med flytande kväve och förvara vid -80 ˚ C

3. Adenoviral transduktion

OBS: Se andra källor om metoder för tillverkning och spridning av adenovirala konstruktioner 13. Aspire Pasteur pipetter och / eller tips måste dekontamineras med 10% blekmedel. Sanera alltid biologisk säkerhet skåp yta och potentiellt kontaminerad utrustning med 70% EtOH oavsett om supernatant har spillts. Om spill har inträffat, som är nödvändigt för grundlig dekontaminering med 1% SDS i 70% EtOH.

  1. Adenoviral titrering med 50% vävnadskultur smittsam dos (TCID50)
    OBS: Före transduktion, är det nödvändigt att titrera det adenovirala förrådslösning. TCID 50 är en av de bästa metoderna för att titrera viruslösningen. Eftersom metoden utvärderar en titer av en smittsam förmåga att HEK 293T celler, beräknat TCID50 speglar faktiska infectability av adenovirus lagret. PFU (plaque-forming units) är proportionell mot den TCID 50 med en faktor av cirka 0,56 30.
    1. Förbered celler och verktyg: HEK 293T celler, 10 cm cellodlingsskålar, 96 brunnar flatbottnade cellodlingsplatta, 8-kanals multi pipett
    2. Förbered 70-90% sammanflytande HEK 293T celler i en 10 cm skål.
    3. Utför en utspädning av 1/10 4 av viruset lager. Addera 50 pl DMEM + 10% FBS till varje brunn i en 96-brunnars flatbottnade cellodlingsplatta. Tillsätt 25 ul av pre-utspädda virusstam in i den första raden, från A till H.
    4. Blanda väl och överför 25 ul från den första raden av brunnar till den andra raden med en 8-kanals multi pipett. Upprepa 1/3 utspädning av viral lösning till varje rad av brunnar till och med den 11: e raden och kassera sista 25 ul.
    5. Finfördela HEK-293T-celler i 10 ml DMEM + 10% FBS. Addera 50 pl av cellösningen i varje brunn från raderna 1 till och med 12.
    6. Inkubera cellerna vid 37 ˚ C i CO2 inkubator för 11-13 dagar. Addera 50 pl DMEM + 10% FBS efter 4-5 dagar och 7-8 dagar efter plätering.
    7. Mät de cytopatiska effekterna i varje brunn vid 11 till 13 dagar efter infektion.
    lane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Rad A d d d d d d d d d
    Rad B d d d d d d d d d
    Rad C d d d d d d d d d
    Rad D d d d d d d d
    Rad E d d d d d d d d d d d
    Rad F d d d d d d d
    Rad G d d d d d d d d
    Rad H d d d d d d d d d d d
    antalet positiva brunnar per rad 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    förhållandet av positiva brunnar per rad 1 1 1 1 1 1 1 0,75 0,63 0,25 0,25 0
    d Visar över 50% cytopatiska effekter
    Visar under 50% eller inga cytopatiska effekter

    Lane 1, utspädning 3 1 x10 4; bana 2, utspädning 3 2 x 10 4; ...; bana 11, utspädning 3 2 x10 11; lane 12, kontroll.
    S = summan av förhållandena av positiva brunnar per rad
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +0,75 +0,63 +0,25 +0,25 +0 = 8,875
    TCID50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875 till 0,5) = 2,97 x 10 8
    TCID50 / ml = 5,94 x 10 9

    Tabell 3: Exempel på en infekterad 96 väl-plattan efter 10 dagars inkubation Mät cytopatiska effekter i varje brunn och sammanfatta förhållandet mellan positiva brunnar per rad..

    1. Beräkna titern enligt Kaerber formel
    2. TCID 50 = (utspädning av första körfält) x (utspädning) (S-0.5)
    3. S = summan av förhållandena av positiva brunnar per rad
      OBS: För detta protokoll, TCID50 = (30000) x (3) (S-0.5). Eftersom 50 ul av viral lösning används i detta protokoll, dividera TCID 50 av 0,05 för att beräkna TCID 50 / ml.
  2. Adenoviral transduction
    1. Beräkna erforderliga mängden adenoviral lösning från dess titer (PFU / ml, viral partikel / ml eller TCID 50 / ml). Använd formeln för att beräkna MOI (mångfald av infektion).
    2. em> [Boat Tabell 4 här]
    3. Lägg beräknade mängden viruslösningen till serumfritt medium (se tabell 5). Blanda väl och inkubera under 20 min vid rumstemperatur.
    4. em> [Boat Tabell 5 här]
    5. Dag7, Ta skålen erhållits i sista steget i Avsnitt 2.2, och byt medium med 750 ul av ny DMEM / MEM innehållande 5% FBS och P / S.
      OBS: Minskning av medelvolymvid transduktion till omkring 50% av den ursprungliga volymen är kritisk för höga transduktion effektivitet.
    6. Lägg utspädd virus lösning på skålen. Inkubera skålen för 4-8 timmar i CO2 inkubator vid 37 ˚ C. Sedan ersätta med nytt medium.
    7. Inkubera skålen för 24-48 timmar i CO2 inkubator vid 37 ˚ C. På dag 8-9, använder celler för live-cell imaging experiment. OBS: Protein expression från den adenovirala plasmiden kan bekräftas genom WB eller ICH efter 24 till 48 timmar efter transduktion, för att bestämma den relativa proteinexpressionsnivån (figur 1c och 1d).

4. Levande cell imaging

  1. Bild förvärv med hjälp av en konfokala spinning disk mikroskop med en temperaturkontrollerad kammare och ett CO2 miljösystem (tillval)
    1. Vrid temperaturregleringen på minst 1 timme före förvärv, så att alla enheter jämvikt till 37 ˚ C före starten av förvärvet. Slå på confocal spinning disk mikroskopsystem (PC för drift, mikroskop, spinning diskenhet, CCD-kamera, laser, fluorescerande ljuskälla, normal ljuskälla, motoriserade skede, och automatiska fönsterluckor).
      OBS: Mer än 1 timme är nödvändigt för att uppnå fullständig temperatur utjämning av alla enheter.
    2. Ändra medium i 3,5 cm glas botten rätter till önskat medium för förvärvet, om det behövs. Placera skålen på scenen av konfokala spinning disk mikroskop i en temperaturkontrollerad kammare.
      OBS: På grund av sfärisk aberration för optimal observation genom mikroskopi användning av en 3,5 cm glas botten skålen med nr 1,5 täckglas (ca 0,16-0,19 mm tjocklek) är perfekt. Om målet som används har en korrigering krage, kan bilder som erhållits med täckglas tjockare än 0,17 mm korrigeras. Dessutom har Fenol red en svag fluorescens. Ibland är det föredraget att använda ett fenolrött-fritt medium, såsom DMEM utan fenolrött. Om det inte finns någon enhet för att styra CO 2-oberoende medium eller medium buffrat med HEPES för långsiktig time-lapse avbildning.
    3. Välj ljusvägen till okularen.
    4. Vrid slutaren i den ljusfält ljuskälla på. Justera fokus till cellerna under mikroskop genom okularen. Stäng luckan för ljusfält ljuskälla av.
    5. Stäng luckan för fluorescerande ljuskälla på. Hitta celler som uttrycker fluorescerande proteiner under mikroskop genom okularen. Stäng luckan för fluorescerande ljuskälla av.
    6. Tillval> Tryck på aktiveringsknappen för perfekt fokus systemet framför mikroskopet för att slå den perfekta fokussystemet på för att hålla fokus stadigt under time-lapse förvärvet.
    7. Ändra ljus sökvägen till snurrande skiva konfokalmikroskop. Justera inställningar för förvärv på lämpligt sätt med hjälp av operatörsprogrammet, kolla bilder displaYED på skärmen. (T.ex. Focus, laser makt, exponeringstid, CCD-kamera vinst och off-set)
    8. Ange inställningar för fluorescerande bilden förvärvet med hjälp av operativprogrammet. Exempel: Välj "Byt kanaler med hjälp av ljusvägar" och "Kanal 1: EGFP" att förvärva fluorescerande signal från EGFP för kanal ett.
    9. Ställ in frekvensen mellan tidpunkter genom att konfigurera tidsförlopp inställningar för att ta time-lapse bilder med hjälp av operatörsprogrammet. Exempel: För att få en tid-punkt var 5 minuter, välj "Minuter per tid-punkten" från rullgardinsmenyn och skriv in 5 i textfältet.
      OBS: Välj "Max hastighet" för att göra en film på faktiska hastigheten. Om uttryck av det fluorescerande proteinet är låg kan fluorescens bleka snabbt under time-lapse förvärvet. I detta fall är det bättre att minska antalet anskaffnings tidpunkter.
    10. Starta tidsförlopp förvärv genom att klicka på "start "för att skaffa sig en bildsekvens.
      OBS: Det är bättre att inte använda flera punkter anskaffningsfunktion. Det kan leda till förlust av fokus eller förflyttning av bildfältet under time-lapse avbildning.
  2. Analys av förvärvade bilder
    OBS: Förvärvade bilder kan spelas upp som en filmfil och analyseras med hjälp av analysprogram.
    1. Välj de förvärvade bilder som ska ingå i en film. Om det behövs, grödor områden av intresse från bilder och välja intressanta tidpunkter för att minska filstorleken av filmen med hjälp av operativsystem.
    2. Exportera bilder som en filmfil i AVI eller MOV-format. Välj ett filmformat från "Format" i rullgardinsmenyn och timingen som krävs för den färdiga filmen, klicka på "Exportera". OBS: Time-lapse bilder som förvärvats på en gång-punkt var 5 minuter kan spelas upp som en film på 10 bilder per sekund, vilket är 3.000 gånger snabbare än den verkliga hastigheten.
  3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att illustrera tekniken, ett lentivirus kodning EGFP (förbättrat grönt fluorescerande protein)-tagged Cx43 (Connexin43) eller en muterad Cx43 32 användes för att uttrycka EGFP-taggade proteiner i celler, och ett adenovirus kodande FGFR1DN (fibroblast growth factor receptor 1 dominant negativ ) användes för att stänga av FGF-signalering i cellen 33-35. Tre dagar efter isolering av hjärtmuskelceller, var de isolerade cardiomyocytes omvandlas med lentivirus för att uttrycka EGFP-taggade proteiner i cellerna. Sen efter 3 dagars lentiviral transduktion, var de isolerade cardiomyocytes vidare omvandlas med ett adenovirus kodning FGFR1DN att eliminera FGF signalering i cellerna. Efter att ha tillåtit tillräcklig tid för cellerna att uttrycka de transducerade exogena gener ades ett konfokalt spinnskivan mikroskop används för att fånga levande cellbilder. Förvärvade bilderna spelas upp som en filmfil och analyseras med hjälp av bildanalys programvara. För mer detaljerad representationtiva resultat se Sakurai et al 32.

Uttrycket av EGFP taggade proteiner efter Lentiviral transduktion bekräftades av konfokal spinning disk mikroskopi 72 timmar efter Lentiviral transduktion figurerna 1A-B. Expressionen av FGFR1DN av adenoviral transduktion bekräftades med WB och ICC efter 24 h av adenoviral transduktion Figurerna 1C-D. Tiden för adenoviral utöver 3,5 cm skålar definierades som tiden 0 och tidsförlopp bilder förvärvades med ett 40x luft NA 0,9 objektivlinsen varje 5 min under 6 h med användning av en kammare som värmaren för att hålla temperaturen vid 37 ˚ C. Time-lapse bilder av EGFP-taggade proteiner i de primära kardiomyocyter tagits av konfokal spinning disk mikroskopi visas i Kompletterande Movies 1-2.

I de fall där temperaturen jämvikt var inte tillräcklig, eller flera förvärvsläget inte fungerar korrekt,bilder som tagits skulle kunna röra sig i xy-planet Supple film 1. Men när man arbetar på rätt autofokussystemet bibehålls stabilt fokus och detta skedde inte. Som framgår av Supple Movie 2, när temperaturen jämvikt var tillräcklig och endast en region av intresse förvärvades, de bilder som tagits är av mycket hög kvalitet.

Misshandeln av hjärtmuskelceller bedömdes efter långvarig tidsförlopp levande cell imaging för att bekräfta cellernas livskraft. Även efter 16 timmar av tidsförlopp imaging EGFP uttrycker cardiomyocytes underhålls sina funktionella egenskaper och slår rytmiskt Supple Movie 3.

Figur 1
Figur 1. Bekräftelse av proteinuttryck efter lentiviral eller adenoviral transduktion. (A) Isolerade råtta neonatala hjärtmuskelceller uttrycker Cx43-WT-EGFP transducerad med Ad-FGFR1DN 3 dagar efter transduktion. Se även Extra Film 1. (B) Isolerade råtta neonatala hjärtmuskelceller uttrycker Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP transducerad med Ad-FGFR1DN 3 dagar efter transduktion. Se även Kompletterande Movie 2. (C) Protein uttryck efter adenoviral transduktion upptäcks av ICC 24 timmar efter transduktion. Hemagglutinin (HA)-protein-tagged FGFR1DN detekterades med anti-HA-antikropp med användning av konventionella ICC-metoder, var alfa-actinin användas som en markör för kardiomyocyter. (D) Expression av FGFR1DN protein efter adenoviral transduktion detekteras av WB 24 timmar efter transduktion. HA-märkta FGFR1DN detekterades av anti-HA-antikroppar av WB, har beta-tubulin användes som lastkontroll.

Extra Film 1. Time-lapse avbildning av isolerade råtta neonatal bil diomyocytes uttrycker Cx43-WT-EGFP transducerad med Ad-FGFR1DN. De tidsförlopp bilder förvärvades med en 40x objektiv var 5 min under 6 timmar med en konfokala spinning disk mikroskop. Förvärvade bilderna spelades upp som en film på 10 bilder per sekund. Denna film har ändrats från Sakurai et al 32. Klicka här för att se filmen.

Kompletterande Movie 2. Time-lapse avbildning av isolerade råtta neonatal cardiomyocytes uttrycker Cx43-S325/328/330E-EGFP transducerad med Ad-FGFR1DN. De tidsförlopp bilder förvärvades med en 40x objektiv var 5 min under 6 timmar med en konfokal spinning disk mikroskop. Förvärvade bilderna spelades upp som en film på 10 bilder per sekund. Denna film har ändrats från Sakurai et al 32."Target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.

Kompletterande Movie 3. Time-lapse avbildning av isolerade råtta neonatal cardiomyocytes spelas upp med verklig hastighet. De tidsförlopp bilder av isolerad råttneonatala hjärtmuskelceller uttrycker Cx43-EGFP transducerad med Ad-FGFR1DN förvärvades med en 40x objektiv var 200 msek till 10 sek med en konfokala spinning disk mikroskop efter 16 timmar av tidsförlopp förvärvet. Förvärvade bilderna spelades upp som en film på 5 bilder per sekund vid faktisk hastighet. Klicka här för att se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Primära kardiomyocyter isolerade från neonatala råttor har länge använts för att studera cardiomyocyte funktioner in vitro. Detta protokoll beskriver en metod för isolering av neonatala hjärtmuskelceller från råttungar genom att använda en två-stegs enzymdigere metoden först digerering med trypsin O / N vid 4 ° C och därefter renat kollagenas. En fördel med användning av renat kollagenas steget är att samma grad av enzym används för alla isoleringar. Således är kvaliteten och mängden av isolerade celler konsekvent från experiment till experiment.

Med tanke på de högre överföringseffektivitet som är förknippade med adenovirus, om en hög effektivitet av transduktion av cellodlingen är nödvändig för ett givet experiment, är det bättre att använda ett adenovirus. Om emellertid höga nivåer av transduktion är inte nödvändigt, kan användas en lentivirusvektor. Att ha möjlighet att använda antingen adenovirala eller lentivirusvektorer gör det lättare att uppnå lämplig givareuktion och expressionsnivåer för olika typer av gener. Om fluorescensintensiteten upptäcks av live-cell imaging med hjälp av konfokala spinning disk mikroskop eller ICC är mycket låg efter Lentiviral transduktion, med hjälp av en annan lentiviral överföringsvektor som använder en annan promotor för att uttrycka genen av intresse kan lösa problemet. Med adenovirusvektorer, om bandet upptäcks av WB är svag efter adenoviral transduktion, detta kan tyda på en låg titer viral lager. I så fall är det bättre att förbereda en högre titer adenoviral lösning genom förökning i celler innan du fortsätter.

En begränsning med denna teknik är att utbytet av isolerade livskraftiga hjärtmuskelceller är inte mycket konsekvent från experiment till experiment, även när du använder renat kollagenas. För att kunna utföra reproducerbara imaging experiment är det bäst att räkna viabla celler efter val av isolerade kardiomyocyter i supernatanten i steg 1.2.13. i protokollet avsnittet. Sedan, se-ed cardiomyocytes på glas botten rätter på olika spädningar. När cellerna har fäst väljer rätter med lämplig cellkoncentrationen för experimentet planeras.

Det finns många fördelar med att använda neonatala hjärtmuskelceller, men det finns också vissa nackdelar. Den stora nackdelen är deras tydliga skillnad från vuxna hjärtmuskelceller. Fullt differentierade vuxna kardiomyocyter är stav-form och isolerade vuxna primära kardiomyocyter bibehålla sin stavformade morfologi, medan isolerade neonatal primära kardiomyocyter sprids i alla riktningar 36. De fenotypiska skillnader mellan isolerade vuxna och neonatala hjärtmuskelceller återspeglas också i deras mönster av genuttryck 37. Därför, för experiment där differentierade cardiomyocytes krävs, ett protokoll för isolering av vuxna hjärtmuskelceller behövs 4.

Anställa adenovirus och lentiviral transduktion av rekombinantproteiner i primära råtta neonatal cardiomyocytes i kombination med konfokal spinning disk mikroskopi tillåter oss att analysera funktioner av proteiner i odlade levande primära celler. Jämfört med befintliga metoder, vilka utnyttjar transfektion att införa genen av intresse in i celler, är en betydande fördel med detta protokoll som adenovirus och lentivirus är mycket effektivt tas upp av celler som resulterar i expressionen av genen av intresse i nästan alla celler i kulturen. Vidare användning av två olika typer av virus för genuttryck gör det lättare att uppnå lämpliga transduktion priser och uttrycksnivåer för flera gener. siRNA och kemiska agonister och antagonister kan också användas i detta system för att ytterligare störa och analysera funktionen av gener och proteiner som de kodar.

Beredning av hjärtan är ett oerhört viktigt steg i protokollet. Avlägsna de hjärtan från kroppen så snabbt som möjligt. Se till attlägga dem på is omedelbart för att hålla cellviabiliteten hög. Ett annat viktigt steg är att förbereda hög kvalitet, och titer, Lentiviral / adenoviralt lager. Om dålig kvalitet virala lagren tömts, kommer transduktion och uttrycksnivåer av genen av intresse vara låg. Därför kan de inte vara lämpliga för imaging studier.

En viktig framtida tillämpning av denna teknik kommer att vara dess "användning i mus cardiomyocytes. Pilotstudier testa om denna metod kan användas för isolering av mus neonatala hjärtmuskelceller har gett lovande resultat. På grund av den relativt begränsade storleken på mus hjärtan jämfört med dem av råttor, är mindre vävnad erhålls från början. Således är färre celler isolerade i ett enda förfarande genom att använda samma antal djur, men bara använda fler möss för isolering bör undanröja detta hinder. Förmågan att isolera mus cardiomyocytes tillåter forskare att undersöka funktionen hos celler som isolerats från genetiskt modifierade mis (transgen, knock-out, knock-in) som har framställts i syfte att studera en särskild form av den intressanta genen.

Ett av de största hindren i kardiovaskulär forskning har varit svårigheten i samband med utredningen av uttryck och funktion av en viss gen uttrycks i hjärtvävnad in vivo i realtid. Men förmågan att isolera funktionella beating cardiomyocytes, modulerar cellfunktioner med hjälp av viral transduktion, och sedan studera dem i realtid med hjälp av konfokala spinning disk mikroskop hjälper till att belysa rollen av hjärtmuskelceller in vivo och överbrygga denna klyfta. Denna metod tillhandahåller ett förenklat system för att förstå cardiomyocyte funktion på cellnivå. Det möjliggör realtidsanalys av hur störningar i genuttryck förändrar cardiomyocyte funktion. Levande cell imaging av hjärtmuskelceller kommer att ge ytterligare insikter i cardiomyocyte funktion. Sådana insikter kommer att leda till framsteg inom grundläggande cardiovascular forskning, vilket leder till nya terapier för behandling av hjärt-kärlsjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31, (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28, (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79, (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32, (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63, (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62, (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. 264-573 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics