Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אינטראקציות RNA / חלבון הן קריטיות למסלולים רגולטוריים שלאחר תעתיק. בין מחייב חלבוני RNA cytosolic המאופיין ביותר חלבונים רגולטוריים ברזל, IRP1 וIRP2 הם. הם נקשרים לגהץ אלמנטי תגובה (IRES) בתוך האזורים מתורגמים (UTRs) של כמה mRNAs היעד, ובכך לשלוט בתרגום mRNAs או יציבות. אינטראקציות IRE / IRP נחקרו בהרחבה על ידי Emsa. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול Emsa לניתוח פעילות IRE מחייב של IRP1 וIRP2, שניתן להכליל על מנת להעריך את פעילותם של חלבוני קושרי RNA אחרים גם כן. Lysate חלבון גולמי המכיל חלבון קושר RNA, או הכנה מטוהרת של חלבון זה, הוא מודגרות עם עודף של 32 בדיקה RNA שכותרתו P, המאפשר להיווצרות מורכבת. הפרין מתווסף מונע חלבון שאינו ספציפי לבדיקה מחייבת. בהמשך לכך, התערובת מנותחת על ידי אלקטרופורזה שאינו denaturing על ג'ל polyacrylamide. הבדיקה בחינםנודד במהירות, תוך תצוגות מורכבות RNA / חלבון ניידות מפגרת; לכן, ההליך המכונה גם "פיגור ג'ל" או assay "bandshift". לאחר השלמת אלקטרופורזה, ג'ל הוא מיובש ומתחמי RNA / חלבון, כמו גם בדיקה בחינם, מזוהים על ידי autoradiography. המטרה הכללית של הפרוטוקול היא לזהות ולכמת IRE / IRP ואינטראקציות RNA / חלבון אחרות. יתר על כן, Emsa יכול לשמש גם כדי לקבוע סגוליות, זיקה מחייבת, והרכב של האינטראקציה RNA / חלבון נחקרים.

Introduction

Emsa פותח במקור כדי ללמוד את הקשר בין חלבוני קושרי DNA עם רצפי DNA היעד 1,2. העיקרון דומה לאינטראקציות RNA / חלבון 3, המהווה את המוקד של מאמר זה. בקצרה, RNA טעון שלילי ויהגר להאנודה שבאינה denaturing אלקטרופורזה בpolyacrylamide (או agarose) ג'לי. הגירה בתוך ג'ל תלוי בגודל של RNA, באופן פרופורציונלי למטען שלה. ספציפי מחייב של חלבון לRNA משנה הניידות שלה, והפליטים המורכבים איטי יותר בהשוואה לRNA החופשי. זאת בעיקר כתוצאה מגידול במסה המולקולרית, אלא גם לשינויים בקונפורמציה תשלום ואולי. ניצול RNA שכותרתו בדיקה מאפשר ניטור קל של "פיגור ג'ל" או "bandshift". שימוש של 32 בדיקות RNA שכותרתו P הוא נפוץ מאוד ומציע רגישות גבוהה. ההגירה של RNA / קומפלקסי חלבונים ו- RNA החופשי מזוהותעל ידי autoradiography. חסרונות הם זמן מחצית החיים קצרים של 32 P (14.29 ימים), ההידרדרות ההדרגתית באיכות של החללית בשל radiolysis, דרישת רישיון רדיואקטיביות ותשתית לעבודת רדיואקטיביות, וחששות בטיחות ביולוגיים הפוטנציאליים של. לכן, שיטות לא-איזוטופי חלופיים לתיוג הבדיקה RNA פותחו, למשל עם fluorophores או ביוטין, המאפשר זיהוי על ידי ההדמיה ניאון או chemiluminescent 4,5. מגבלות של שיטות אלה הן העלות גבוהה יותר ולעתים קרובות רגישות מופחתת בהשוואה לתיוג איזוטופי, ואת הפוטנציאל של תוויות שאינן איזוטופים להתערב באינטראקצית RNA / החלבון. ג'לים polyacrylamide-denaturing ללא מתאים למרבית יישומי Emsa ומשמש בדרך כלל. בהזדמנות, ג'לים agarose עלול להוות חלופה לניתוח מתחמים גדולים.

היתרון העיקרי של Emsa הוא שהוא משלב פשטות, רגישות, וחוסן 4 </ Sup>. Assay יכול להסתיים בתוך כמה שעות ואינו דורש מכשור מתוחכם. ניתן לאתר אינטראקציות RNA / חלבון על ידי Emsa בריכוזים נמוכים כמו 0.1 ננומטר או פחות, ובתוך מגוון רחב של תנאים המחייבים (pH 4.0-9.5, ריכוז מלח חד ערכי 1-300 מ"מ, וטמפרטורה 0-60 מעלות צלזיוס).

היווצרות מורכבת RNA / חלבון גם ניתן ללמוד על ידי assay מחייב הסינון. זהו הליך פשוט, מהיר, וזול המבוסס על השימור של מתחמי RNA / חלבון במסנן nitrocellulose, תוך בדיקה RNA חופשית עוברת דרך 6. בהשוואה לEmsa, הוא מוגבל במקרים שבהם הבדיקה RNA מכילה אתרי קישור מרובים, או התמצית גולמי מכילה יותר מאחד מחייב חלבוני RNA אשר נקלטים על ידי הבדיקה באותו האתר. בעוד אינטראקציות RNA / חלבון מרובות להתחמק מזיהוי על ידי assay מחייב המסנן, הם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי Emsa. במקרים מסוימים, להדמיה היא ערבn אפשרי כאשר שני מתחמי RNA / חלבון שיתוף להגר (למשל, IRP1 / IRE אדם וIRP2 / מתחמי IRE), על ידי הוספת נוגדנים נגד אחד מחייב חלבוני RNA לתגובת Emsa, מניב פיגור נוסף על ג'ל ( "Supershift") 7.

Emsa כבר בשימוש נרחב ללמוד IRP1 וIRP2, שהם רגולטורים לאחר תעתיק של חילוף חומרים ברזל 8-10. הם פועלים על ידי קישור לIRES, מבני סיכה נשמרים פילוגנטית בתוך UTRs של כמה mRNAs 11. IRES התגלה לראשונה בmRNAs קידוד פריטין 12 וtransferrin קולט 1 (TfR1) 13, חלבונים של אחסון ברזל וספיגה, בהתאמה. בהמשך, IRES נמצא בsynthase aminolevulinate erythroid הספציפי (ALAS2) 14, aconitase המיטוכונדריה 15, ferroportin 16, טרנספורטר דו הערכי מתכת 1 (DMT1) 17, גורם עין מתנהל היפוקסיה 2 18, וmRNAs 19-21 אחר. H- אב הטיפוס וmRNAs L-פריטין להכיל IRE אחד ב 5 'UTR, בעוד TfR1 mRNA מכיל IRES מרובה בה 3' UTR. אינטראקציות IRE / IRP במיוחד מעכבות תרגום mRNA פריטין ידי sterically חסימת הקשר שלה של 43s מקטע ריבוזומלי; יתר על כן, הם לייצב TfR1 mRNA נגד מחשוף endonucleolytic. IRP1 ודמיון רצף נרחב נתח IRP2 ולהציג פעילות מחייב IRE גבוהה בתאים רעבי ברזל. בתאי ברזל גדוש, IRP1 מרכיב אשכול Fe-S cubane שממיר אותו לaconitase cytosolic על חשבון פעילות IRE מחייב שלה, בזמן שIRP2 עובר השפלה proteasomal. כך, אינטראקציות IRE / IRP תלוי במעמד הברזל הסלולרי, אלא גם מוסדרות על ידי אותות אחרים, כגון H 2 O 2, תחמוצת חנקן (NO) או היפוקסיה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול להערכת פעילות IRE-מחייבת מתמציות תא ורקמה גסים על ידי EMSA. אנחנו השתמשנו בדיקה 32 שכותרתו P H-פריטין IRE שנוצר על ידי שעתוק במבחנה מתבנית ה- DNA פלסמיד (I-12.CAT), שבו רצף IRE הוצג במקור באוריינטצית תחושה במורד הזרם של אתר פולימראז T7 RNA על ידי שיבוט של oligonucleotides הסינתטי המרותק 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוצדורות עם עכברים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת מקגיל (פרוטוקול 4966).

1. הכנת תמציות חלבון מתאים בתרבית

  1. שטוף תאים בתרבית פעמיים עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט קר כקרח (PBS).
  2. לגרד תאים חסיד עם או שוטר גומי או מגרד תא פלסטיק ב 1 מיליליטר של השעיה PBS, העברה קרה כקרח לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
  3. ספין בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 700 XG, 4 ° C. לשאוב PBS.
  4. הוספה של חיץ תמוגה cytoplasmic קר כקרח 100 μl (טבלת 1) לכל 10 7 תאים, ופיפטה למעלה ולמטה.
  5. דגירה על קרח למשך 20 דקות.
  6. ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge על 4 מעלות צלזיוס.
  7. גלולה מחק. העברת supernatant לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש ולשמור על קרח.
  8. Detריכוז חלבון סמור (בדרך כלל 1-10 מיקרוגרם / μl) באמצעות assay ברדפורד 23.
  9. תמציות Aliquot ותא לאחסן ב -80 ° C עד שימוש.

2. הכנת תמציות חלבון מעכבר כבד וטחול

  1. להרדים עכבר עם CO 2 שאיפה.
  2. הנח את החיה מורדמים על משטח נקי על לוח לנתח. פתח את הבטן עם מספריים.
  3. לנתח את הכבד והטחול באמצעות מספריים ומלקחיים, ולשטוף כל רקמה בPBS כ 50 מיליליטר קר כקרח.
  4. מייד לחתוך רקמות לחתיכות קטנות עם סכין מנתחים (לדוגמא: כ 1 - 2 מ"מ 3).
  5. ללא דיחוי, לשים חתיכות של רקמות בcryotube טרי ולאחר מכן הצמדתי את להקפיא אותם בחנקן נוזלי. חנות snap-קפוא aliquots רקמה ב -80 ° C עד שימוש.
  6. Homogenize פיסת הרקמה קפוא אחד (כ 1 - 2 מ"מ 3) ב0.25-0.5 מיליליטר שלקר כקרח חיץ תמוגה cytoplasmic (טבלה 1) עם homogenizer רקמות במשך 10 שניות.
  7. העבר את homogenate 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge ומקררים על קרח במשך 20 דקות.
  8. ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge על 4 מעלות צלזיוס.
  9. בטל גלולה וsupernatant העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש. שמור על קרח.
  10. קביעת ריכוז חלבון (בדרך כלל 1-10 מיקרוגרם / μl) באמצעות assay ברדפורד 23.
  11. תמציות Aliquot ותא לאחסן ב -80 ° C עד שימוש.

3. הכנת radiolabeled IRE-הבדיקה

  1. Linearize I-12.CAT פלסמיד IRE המכיל 22 על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם endonuclease הגבלת XbaI (U 1 לכל מיקרוגרם של פלסמיד), שדבק במורד הזרם של רצף IRE. פלסמיד לינארית, שישמש כתבנית לשעתוק במבחנה.
  2. הגדר אתn תגובת שעתוק במבחנה בנפח כולל של 20 μl. השתמש בפתרוני המניות שמוצגים בטבלה 2 ולהוסיף: 1 μl תבנית פלסמיד לינארית, חיץ שעתוק 4 μl; תמהיל 1 μl של ATP תערובת / CTP / GTP, -UTP 10 μl [α- 32 P], dithiothreitol 2 μl, מעכב RNase μl 1 וRNA פולימראז T7 μl 1. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה.
  3. לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 24.

4. טיהור של radiolabeled IRE-בדיקה

  1. לסיים תגובת שעתוק במבחנה על ידי הוספת 1 ​​μl של 0.5 M EDTA, pH 8. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה.
  2. הוסף 10 μl של 10 מ"ג / מיליליטר tRNA, כמוביל למשקעים טובים יותר. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה.
  3. להוסיף 82.5 μl של אמוניום אצטט 3 M. מערבבים על ידי vortexing.
  4. להוסיף 273 μl של אתנול. מערבבים על ידי vortexing.
  5. בואו נעמוד על RT במשך 5 דקות.
  6. ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge ב RT. supernatant מחק.
  7. לשטוף עם גלולה של 70% אתנול 100 μl.
  8. ספין במשך 10 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge ב RT. supernatant מחק.
  9. גלולה האוויר יבשה למשך 10 דקות.
  10. גלולה גלולה בשל מזוקק פעמיים 100 μl, autoclaved H 2 O. בעבר
  11. לכמת רדיואקטיביות במונה נצנץ נוזלי, בדיקה IRE radiolabeled aliquot ולאחסן ב -80 ° C עד שימוש. aliquots הקפוא יכול לשמש לתקופה של עד 3 שבועות.

5. הכנת ג'ל polyacrylamide מקורי עבור Emsa

  1. להרכיב את הג'ל (16 x 16 סנטימטרים) באמצעות 1.5 מ"מ מפרידי ומסרק.
  2. כדי להכין 6% ג'ל polyacrylamide ילידים, להשתמש בפתרוני המניות שמוצגים בטבלה 3. מערבבים acrylamide 7.5 מיליליטר של 40%:. Bisacrylamide, 5 מיליליטר של 5x TBE ו37.5 מיליליטרH מזוקק פעמיים 2 O.
  3. הוסף 0.5 מיליליטר של 10% persulfate מוכן טרי אמוניום (APS) ו -25 tetramethylethylenediamine μl (TEMED).
  4. מייד לשפוך את פתרון acrylamide לג'ל ולתת לו לפלמר. המתן כ 30 דקות.
  5. להרכיב את מנגנון אלקטרופורזה עם ג'ל, למלא את הטנקים עם TBE 0.5x ולהתחבר עם אספקת החשמל.

Assay Shift 6. Electrophoretic ניידות

  1. לדלל 25 מיקרוגרם של תמצית חלבון מהתאים או רקמות עם חיץ תמוגה cytoplasmic (טבלת 1) בהיקף כולל של 10 בμl (עשויים לשמש גם ריכוזי חלבון נמוכים יותר). שמור על קרח. במידת צורך, להוסיף 1 μl של 1: 4 בדילול 2-mercaptoethanol (2-ME) כדי להפעיל IRP1 הרדום (ריכוז סופי: 2%) 25.
  2. לדלל את הבדיקה IRE radiolabeled בH מזוקק פעמיים 2 O 200,000 עותקים לדקה / μl, לפגל חום על 95 מעלותC 1 דקות, ולהתקרר בRT במשך 5 דקות לפחות.
  3. הגדר את תגובת Emsa על ידי הוספת 1 μl של הבדיקה IRE radiolabeled לתמצית החלבון.
  4. דגירה של 20 דקות ב RT.
  5. הוסף 1 μl של 50 מ"ג / מיליליטר הפרין לתגובה (לעכב אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיות עם החללית 9) ולהמשיך את הדגירה לעוד 10 דקות. Aliquot פתרון המניות של הפרין (50 מ"ג / מיליליטר) ולאחסן ב -80 ° C.
  6. בעת שימוש בבדיקות ארוכות radiolabeled (> 60 נוקלאוטידים), להוסיף μl 1 RNase T1 (1 U / μl) ו דגירה של 10 דקות ב RT להפחית חלבון שאינו ספציפי מחייב הבדיקה, וכדי לאפשר הפרדה טובה יותר של RNA / החלבון מורכב באלקטרופורזה.
  7. הוסף 3 μl של חיץ טעינה (גליצרול 80% + bromophenol הכחול), לערבב ועומס על 6% ג'ל polyacrylamide שאינו denaturing.
  8. הפעל את ג'ל למשך 60 דקות ב 130 V (5 V / סנטימטר).
  9. Transfer ג'ל על נייר סינון גדול ויבש.
  10. לחשוף לסרט ולפתח autoradiography. זמן חשיפה עשוי לנוע בין 1 שעה (או פחות) עד O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדיקה IRE radiolabeled הוכנה, כפי שמתוארת בסעיפים 3 ו -4 לפרוטוקול. הרצף של החללית היה 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; נוקלאוטידים המודגשים מייצגים שאריות מזווגים C והלולאה, שהם תכונות IRE קריטיות. הרדיואקטיביות הספציפית של החללית הייתה 4.5 x 10 9 עותקים לדקה / מיקרוגרם של RNA.

כדי להעריך את ההשפעות של הפרעות ברזל על IRE מחייב פעילות, מקרופאגים RAW264.7 העכבריים נותרו ללא טיפול, או שטופלו במין (מקור ברזל) או desferrioxamine (chelator ברזל). Lysates הוכן ונותח על ידי Emsa עם חללית IRE (חלבון / מיקרוגרם 8,000 עותקים לדקה). נציגי נתונים המוצגים באיור 1, עם חשיפות קצרות יותר וארוכות יותר של autoradiograms על לוחות ימין ועל השמאל, בהתאמה. מתחמי IRE / IRP1 העכברי וIRE / IRP2 תערוכת ניידות שונה ושתי להקות שונותנראה במסלול 1, מתאים לתאים שלא טופלו. קלאציה ברזל עמוק מושרה פעילויות IRE מחייבות של שני IRP1 וIRP2 (מסלול 2), בעוד שמתן תוספת ברזל פחתה (מסלול 3). טיפול מקדים בIRP1 2% 2-ME יופעל באופן מלא (פנל תחתון), גם בתמציות של תאים שטופל בברזל. זה מוכיח כי הפרעות ברזל לא לפגוע ביציבות של IRP1 ומשמש גם כביקורת טעינה. בניגוד לכך הטיפול המקדים 2-ME בלם את פעילות IRE מחייבת של IRP2. הלהקות שאינן ספציפיות המהיר הנודדות אינן מושפעות מברזל.

בשלב הבא, נתחנו IRE מחייב פעילות בכבד מסוג פראי, Irp1 - / - וIrp2 - / - עכברים, האכילו בעבר במשך שבוע אחד עם סטנדרטי או דיאטה עשירת ברזל (איור 2). Irp1 - / - וIrp2 - / - עכברים נמסרו באדיבות על ידי ד"ר MW Hentze (EMBL, היידלברג). בתמציות כבד מסוג בר, IRP1 היווה החלק העיקרי של פעילות IRE מחייבת ומתחמים / IRP2 IRE היו כמעטגלויים (נתיבים 1, 2), בהסכם עם תצפיות קודמות 26. IRP2 הציג פעילות חזקה IRE-מחייב בתמציות כבד של Irp1 - / - עכברים (נתיבים 3, 4). בתנאים אלה, אין IRE / מתחמי IRP1 נצפו. כמו כן, אין מתחמי IRE / IRP2 נוצרו בתמציות כבד של Irp2 - / - עכברים (נתיבים 5, 6). האכלת עכברים עם תזונה עתיר ברזל ירידה בפעילות IRE-מחייבת כבד של שני IRP1 וIRP2; השפעה זו הייתה דרמטית יותר על IRP2 (נתיבים 7-12). שים לב שלאחר טיפול של סוג בר או Irp2 - / - תמציות כבד עם 2-ME, פעילות IRE מחייבת של IRP1 הייתה משופרת לנקודה שבה עברה כמעט כל הבדיקה IRE (זה ברור הוא ציין בחשיפה הקצרה של autoradiograms בפנל מהשמאל).

לבסוף, הערכנו את פעילות IRE-מחייבת בכבד וטחול של סוג בר וHjv - / - עכברים (איור 3). Hjv - / - עכברים נמסרו באדיבות על ידי ד"ר NC אנדרוז (אוניברסיטת דיוק, צפון קרוליינה). בעלי חיים אלה מייצגים מודלשל המוכרומטוזיס התורשתי 27, מחלה של עודף ברזל מערכתי, שבו ברזל מוגזם מצטבר בתאי parenchymal, בעוד מקרופאגים הרטיקולואנדותליאלית להישאר ברזל שחסר לי 28. כצפוי, כבדים של Hjv - / - עכברים (עם hepatocytes טעון ברזל) הציגו ירידת IRE מחייב פעילות בהשוואה לסוג בר (נתיבים 1-4). לעומת זאת, פעילות IRE מחייבת הייתה גבוהה יותר בטחולים של Hjv - / - עכברים (המכילים מקרופאגים ברזל לקוי; נתיבי 5-8). שוב כאן, טיפול 2-ME קידם משמרת של חללית IRE בתמציות כבד (ראה חשיפה קצרה של autoradiograms על הפנל מהשמאל) כמעט מוחלטת.

טבלת 1. מאגר תמוגה cytoplasmic.

1% Triton X100
25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4
40 מ"מ KCl
  1. הפתרון צריךלהיות autoclaved ומאוחסן ב RT.
  2. מעכבי פרוטאז, כגון 10 מיקרוגרם / מיליליטר leupeptin ו -0.1 פלואוריד phenylmethanesulfonyl מ"מ (PMSF) ניתן להוסיף לפני השימוש.
  3. תוספת של 1 מ"מ dithiotheritol הטרי המליצה לי לגילוי של פעילות IRP2.

פתרונות Stock טבלת 2. לתגובת שעתוק במבחנה.

1 מיקרוגרם / תבנית פלסמיד לינארית μl
חיץ שעתוק 5x (מסופק עם RNA פולימראז T7)
20 תמהיל מ"מ של ה- ATP, GTP CTP ו
3,000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 dithiothreitol מ"מ
10 U / מעכב RNase μl
RNA פולימראז / T7 μl 20 U


<פתרונות strong> לוח 3. בורסה לאי-denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide.

acrylamide 40%: bisacrylamide (37.5: 1)
TBE 5x (טריס / borate / EDTA)

להכנת 1 ליטר של 5x TBE, להשתמש 54 גרם של בסיס טריס, 27.5 גרם של חומצה בור, ו -20 מיליליטר של 0.5m EDTA (pH 8.0).

איור 1
תקנת 1. ברזל תלויה דמותו של IRE מחייב פעילות במקרופאגים RAW264.7. 10 7 תאים היו או שלא טופל או מטופלים O שמאל / N עם מין מיקרומטר 100 או desferrioxamine. lysates cytoplasmic הוכן ונותח על ידי Emsa עם בדיקה IRE שכותרתו P 32 בהעדר (למעלה) או הנוכחות של 2% 2-ME (תחתון). העמדות של IRE / IRP1 ומתחמי IRE / IRP2, ושל הבדיקה IRE חופשית מסומנות על ידי חצים. הכוכב עולה להקה שאינה ספציפית. חשיפות קצרות יותר וארוכות יותר של autoradiograms מוצגות בלוחות ימין ועל השמאל, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. ניתוח של IRE מחייב פעילות בכבד מהסוג בר (WT), Irp1 - / - וIrp2 - / -. עכברי עכברים ישנים 5 שבוע (n = 2 עבור כל גנוטיפ), כולם בC57BL / 6 רקע 29, הונחו על תקן או דיאטה עתירה-ברזל (המכיל 2% ברזל קרבוניל). לאחר שבוע אחד החיות היו מורדמים. תמציות חלבון כבד הוכנו ונותחו על ידי Emsa עם בדיקה IRE שכותרתו P 32בהעדר (למעלה) או הנוכחות של 2% 2-ME (למטה). העמדות של IRE / IRP1 ומתחמי IRE / IRP2, ושל הבדיקה IRE חופשית מסומנות על ידי חצים. הכוכב עולה להקה שאינה ספציפית. חשיפות קצרות יותר וארוכות יותר של autoradiograms מוצגות בלוחות ימין ועל השמאל, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ניתוח של IRE מחייב פעילות בכבד וטחול של סוג בר (WT) וHjv - / -. עכברי עכברים בן 10 בשבוע (n = 2 עבור כל גנוטיפ), כולם בC57BL / 6 רקע 30, היה מורדמים. כבד וטחול תמציות חלבון הוכנו ונותחו על ידי Emsa עם בדיקה IRE שכותרתו P 32 בהעדר (למעלה) או הנוכחות של2% 2-ME (למטה). העמדות של IRE / IRP1 ומתחמי IRE / IRP2, ושל הבדיקה IRE חופשית מסומנות על ידי חצים. הכוכב עולה להקה שאינה ספציפית. חשיפות קצרות יותר וארוכות יותר של autoradiograms מוצגות בלוחות ימין ועל השמאל, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בזאת, אנו מתארים פרוטוקול שפותחה כדי לחקור את פעילות IRE מחייבת של IRP1 וIRP2, ואנו מראים נתונים נציג. באמצעות בדיקות שונות, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ללימוד מחייב חלבוני RNA אחרים. שלב קריטי הוא בגודל של החללית. שימוש בבדיקות ארוכות, שהוא נפוץ כאשר אתר הקישור המדויק אינו ידוע, יכול לגרום למתחמי RNA / חלבון שאינו נודד באופן שונה מRNA החופשי. במקרה זה, מומלץ להסיר RNA מאוגד על ידי טיפול עם RNAse T1 (שלב 6.6). האיכות של החללית היא גם מאוד חשובה. התוצאות הטובות ביותר מושגות עם RNA רדיואקטיבי מוכן טרי. ג'ל לטיהור 10 היא לא הכרחית, אבל יכולה לשפר את המראה של Emsa אם תגובת השעתוק במבחנה להכנת בדיקה מניבה מוצרי סיום מוקדמים (ואם לא צעד עיכול RNAse T1 כלול). פועל מ 'מהר מדי ג'ל אלקטרופורזה ילידאיי לגרום להתחממות יתר, שעלולה להוביל לניתוק של RNA מתחמים / חלבון ולגרום ללהקות מטושטשות.

ניתן להשיג תוצאות כמותיות על ידי ניתוח עוצמת הלהקות מפגרות עם phosphorimaging. Quantifications תקף רק כאשר הבדיקה RNA נמצאת בעודף ולא מגבילה לRNA מחייב. הזיקה של האינטראקציה RNA / חלבון, המיוצגים על ידי ד K הקבוע דיסוציאציה שצמודה לo ΔG האנרגיה החופשית, ניתן להעריך בתנאי שיווי משקל על ידי titrating הפעילות מחייב RNA עם ירידה בכמויות של הבדיקה radiolabeled 3. האינטראקציה IRE / IRP1 התאפיינה בהרחבה physicochemically 9,31. ניסויי Emsa טיטרציה עם כמויות משתנות של חלבון קושר RNA ניתן לבצע כדי לחשב stoichiometry 3. סגוליות לכריכה יכולה להיות מאומת בקלות על ידי ניסויי תחרות עם עודף של comp "הקר" ללא תוויתetitor RNAs 3. רק מתחרים ספציפיים צריכים להפחית את עוצמת הלהקה רדיואקטיביים המפגרת. סגוליות יכול גם להיות במעקב על ידי כולל נוגדנים כנגד החלבון קושר RNA בתגובת Emsa, אשר יניב "supershift" 7. זה גם יכול להיות מנוצל כדי לקבוע את זהותו של החלבון קושר RNA. לא "supershift" יש לשים לב עם נוגדנים שאינם ספציפיים או בסרום לפני חיסון.

לסיכום, Emsa הוא שיטה רבת עוצמה לניתוח אינטראקציות RNA / חלבון. זה קל יחסית לביצוע ודורש תשתית מינימאלית. זה לא פשוט כמו assay מחייב המסנן, אבל יניב נתונים יותר אינפורמטיבי ומדויקים כאשר מחייב חלבוני RNA מרובים אינטראקציה ספציפית עם הבדיקה (כגון IRP1 וIRP2). יש לציין כי בניגוד למתחמים עכברי, IRE אדם / IRP1 וIRE / IRP2 שיתוף להעביר בEmsa. עם זאת, הם יכולים להיות מופרדים על ידי "supershifts̶1; עם נוגדנים ספציפיים 7. Emsa הוא לא בעל ערך למיפוי מפורט של אינטראקציות RNA / חלבון; טכניקות אחרות, כגון assay הגנת RNAse, toeprinting או cross-linking 32 מתאימות יותר. עם זאת Emsa הוא בחירה מצוינת לגילוי אינטראקציות RNA / חלבון חדשים, כפי שהיה במקרה עם IRPS 8, אלא גם לאימות הנתונים שהושגו עם גישות ניסיוניות תפוקה חישובית או גבוהה. יתר על כן, Emsa עדיף לניתוח מאפיינים ספציפיים וphysicochemical של אינטראקציות RNA / חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics