Una plataforma de microfluidos para el procesamiento de precisión de pequeño volumen de la muestra y su uso para Tamaño partículas biológicas separadas con un Microdevice acústica

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Una ventaja importante de dispositivos de microfluidos es la capacidad de manipular pequeños volúmenes de muestra, reduciendo así los residuos de reactivos y la preservación de la muestra precioso. Sin embargo, para lograr la manipulación de la muestra robusto es necesario para hacer frente a la integración de dispositivos con el medio ambiente macroescala. Para llevar a cabo la separación de partículas repetible, sensible con los dispositivos de microfluidos, este protocolo presenta una plataforma de microfluidos automatizada e integrada completa que permite el procesamiento preciso de 0.15-1.5 ml muestras utilizando dispositivos de microfluidos. Los aspectos importantes de este sistema incluyen el diseño modular del dispositivo y los accesorios sólidos resultantes en el mundo fiable y flexible a chip conexiones, y manejo de fluidos totalmente automatizado que lleva a cabo la recogida de muestras de bucle cerrado, la limpieza del sistema de cebado y medidas para asegurar un funcionamiento repetible. Diferentes dispositivos de microfluidos pueden ser utilizados de forma intercambiable con esta arquitectura. Aquí incorporamos un dispositivo acoustofluidic, detalle su characterización, la optimización del rendimiento y demostrar su uso para el tamaño de la separación de las muestras biológicas. Mediante el uso de información en tiempo real durante los experimentos de separación, recogida de muestras está optimizado para conservar y concentrar la muestra. Aunque que requiere la integración de múltiples piezas de equipo, las ventajas de esta arquitectura incluyen la capacidad para procesar muestras desconocidas sin optimización adicional del sistema, la facilidad de sustitución del dispositivo, y preciso, robusto procesamiento de la muestra.

Introduction

La separación de la muestra y el fraccionamiento es una de las áreas más prometedoras de la aplicación de las tecnologías de microfluidos. Tales etapas de manipulación de la muestra son esenciales para el diagnóstico eficaces clínicos, desarrollo de la terapéutica, los esfuerzos de biovigilancia, y los avances en investigación y tecnología ciencias de la vida. Una miríada de estrategias de separación de microfluidos se han demostrado para partículas y coloides de líquido suspendidas, así como para las especies químicas y biológicas; varios exámenes proporcionan una visión general de los recientes avances y desarrollos en estos campos 1 - 9. Aunque muchas de estas tecnologías de separación de microfluidos (en adelante como "Dispositivos Core") se han caracterizado ampliamente, algunos informes han considerado el problema de la separación de la muestra a nivel de sistema. Los dispositivos básicos suelen ser los chips centímetro escala individual, interconectados con tubos de fluoropolímero, con fluido suministrado por una bomba de caudal o presión.Sin embargo, si la promesa de microfluidos - incluyendo una mayor automatización, fiabilidad y reducción de los volúmenes de muestra - es convertirse en realidad, al menos un esfuerzo equivalente debe dedicarse al diseño de un sistema de separación completa en la que se integra el Núcleo .

Además, un gran desafío para los enfoques de microfluidos a biodetección es la macro a lo micro interfaz. Esto se refiere no sólo a las conexiones físicas "del mundo a viruta" de un dispositivo de microfluidos para componentes macroescala, ya la falta de coincidencia entre los volúmenes típicos de la muestra clínica o analítica (~ 0,1-10 ml) y el volumen interno de chips de microfluidos (~ 0,01-10 l), sino también a las limitaciones de muestreo estadístico derivados de la reducción de estas escalas de tamaño. Estos aspectos contribuyen a la percepción de que la muestra de pre-procesamiento y la preparación son el "eslabón débil" de biodetección. 10 La plataforma descrita en este trabajo takes importantes pasos hacia la solución de esos problemas.

Desde una perspectiva a nivel de sistema, este protocolo se detalla el procesamiento fiable de los volúmenes de escala analítica precisamente-dosificadas (que van desde 0,15 a 1,5 ml) en ~ escalas de tiempo de 10 min. Esta es una operación de "un botón": una vez que el vial de origen que contiene la muestra y de destino viales para la recogida de fracciones se colocan en el sistema, el comando "ejecutar" inicia el procedimiento, y todos los pasos son controlados por computadora. Al final de una carrera, los viales de recogida pueden ser retirados del sistema para el análisis de aguas abajo de las fracciones separadas.

El dispositivo de Core en este sistema es un chip acoustophoresis que extrae partículas (5-20 mM) de células de mamífero de tamaño de la muestra. Separación Acoustophoretic se elige aquí principalmente porque es de alto rendimiento (hasta 100s de l / min), sin etiquetas y sin contacto, ofreciendo así ventajas en la separación de viru viableses a partir de células que pocas otras técnicas de microfluidos pueden igualar. La física de partículas acústica focalización se han descrito ampliamente, 11-13 y no son el foco de este protocolo, pero un breve resumen de los conceptos subyacentes de la siguiente manera para ayudar en la comprensión de la aplicación a la separación de microfluidos.

Ultrasonido ondas estacionarias resonantes en microcanales llenos de líquido producen campos de presión, que dan lugar a las fuerzas que impulsan las partículas hacia los nodos de baja presión. La magnitud de la fuerza depende del volumen de la partícula, y en un factor de contraste acústico derivado de las densidades relativas y compresibilidades de la partícula y el líquido de suspensión. 14 Como tal, centrándose acústica es ideal para la separación de células de tamaño (~ 7-15 m) a partir de (~ de 50-200 nm) partículas similares a virus de tamaño. Las partículas más grandes migran hacia un nodo de presión; sin embargo, ya que la magnitud de la fuerza es muy pequeña paralas partículas más pequeñas de 2-3 micras, estas pequeñas partículas o especies disueltas casi no se mueven en absoluto. Nuestra implementación específica de separación acústica, como se describe anteriormente, 15 incorpora una pared delgada para subdividir el canal de fluido y permite sintonizable, la colocación asimétrica de la posición de enfoque. Esto añade flexibilidad en el diseño de dispositivos y los beneficios, incluyendo aumento de la calidad de desempeño de separación y velocidad se describen con detalle en otro lugar. 16,17

Sin embargo, una ventaja importante del enfoque de diseño a nivel de sistema se describe en este trabajo es que es adaptable a una gran variedad de dispositivos de núcleo de microfluidos. Por ejemplo, la mayoría de los otros modos de separación de flujo continuo, incluyendo inercial, el flujo de campo de fraccionamiento, el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos), y varios tipos de dispositivos electrocinéticos se pueden incorporar fácilmente, con los ajustes apropiados hechos para tener en cuenta cambios en la configuración de entrada / salida , caudales,y volúmenes de muestra. Los dispositivos con varios tipos de campos en-chip (eléctrica, magnética) o gradientes (térmicos, químicos) pueden requerir conexiones adicionales al chip, o la integración de hardware adicional, que da cabida a esta plataforma.

Este protocolo proporciona los pasos necesarios para diseñar un dispositivo de separación de microfluidos, y para fabricar chips de silicio de cristal por una profunda grabado por iones reactivos (DRIE, un proceso de plasma de grabado disponible en muchas instalaciones de microfabricación, que utiliza ciclos de grabado y pasivación alterna para lograr profunda características con paredes laterales verticales 18). A continuación, se describe la caracterización del dispositivo acoustofluidic para determinar los parámetros de funcionamiento óptimas para la separación, y finalmente detalle el sistema de separación totalmente integrada y el procedimiento para el procesamiento de muestras biológicas. Resultados de la caracterización dispositivo típicos y procesamiento de datos de la muestra son luego presentados y discutidos, y de las ventajas clave de este aproada se destacan, incluyendo modularidad, robustez, precisión y automatización.

Protocol

1. Diseño de dispositivos Acoustophoretic y fotomáscara Layout

NOTA: Consideraciones generales y orientación para el diseño de procesos de microfabricación y el diseño de máscara se puede encontrar en los textos sobre la microfabricación y tutoriales de diseño fotomáscara 19 a 21.

  1. Coloque la máscara 1, la capa de neumático (parte frontal), el uso de software CAD apropiado. Elige una geometría que permite la inyección de la muestra y la separación apropiado para la aplicación deseada.
    1. Por acústica de enfoque, ajuste el ancho del canal de fluido w para proporcionar una frecuencia de resonancia f n mayor que 1 MHz de acuerdo con la ecuación f = n nc / 2w, donde c es la velocidad del sonido en el fluido relevante y n es el número de nodos de onda estacionaria (por ejemplo, para una amplia canal 900-m, la de dos resonancia nodo se espera en f 2 = 1,65 MHz).
      NOTA: Particles ocupando posiciones laterales distintas cerca del final del canal de separación, deberá salir de las tomas distintas. En este protocolo, las partículas se separan por tamaño, por lo que los enchufes se designan SPO y LPO, por partículas pequeñas y la salida a gran partícula, respectivamente, como se muestra en la Figura 1.
    2. Ajustar la longitud de canal de fluido para controlar la longitud de las partículas de tiempo están expuestos al campo de separación a una velocidad de flujo específica. Ya en el chip tiempo de residencia de las partículas a emigrar debido a las fuerzas de separación debe ser objeto de comercio fuera en contra de la mayor huella de chips requerida.
      NOTA: En nuestros dispositivos acústicos de enfoque, el canal de flujo hace tres pasa por el chip para aumento del tiempo de residencia (Figura 2a). A una tasa de flujo total típico de 200 l / min, las partículas fluyen a través de la sección transversal de 300 x 200 m, 117 mm de largo canal de separación gastar en promedio 2,1 seg en el campo acústico.
  2. Incluir puertos de fluidos en el Layo máscaraut para las conexiones a la tubería estándar dispuestas en una cuadrícula estandarizada (5 mm de paso). Incluir marcas de referencia adecuados para la alineación de máscaras entre sí durante la fabricación y cortar en cubitos de dispositivos individuales.
  3. Coloque la máscara 2, la capa de Via (parte posterior), que sólo incluye los puertos de fluidos. Incluir marcas de referencia para la alineación de la máscara 1.

Figura 1
Figura 1. Dispositivo Acoustofluidic. Bocetos esquemáticos de la arquitectura dispositivo acoustophoretic. (A) Vista superior, que muestra la configuración general de H-filtro (no a escala). (B) Esquema de la sección transversal del canal en la posición marcada por el negro línea discontinua en (a), que muestra el campo de presión (azul salpicado de líneas), y el sentido de las fuerzas acústicas principales de radiación (PRF) que impulsan las partículas hacia planos nodales (flechas rojas). La sección transversal del canales 900 × 200 m con una pared que separa unos 10 m de espesor de la principal (300 m de ancho) y canales de derivación. (C) la representación 3D de la separación de partículas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. para salas blancas de fabricación de chips de microfluidos para Acoustophoresis

  1. Patrón de los orificios de fluido de back-laterales utilizando Máscara 2 en un lado doble pulido de 0,5 mm de espesor, 100 mm de diámetro <100> oblea de silicio por la norma fotolitografía positivo resistir. Etch esta geometría por grabado iónico reactivo profundo (DRIE) a una profundidad de 350-400 micras de.
  2. Girar la oblea sobre, y la geometría de canal de fluido patrón el lado frontal por medio de la máscara 1 por la norma positiva-resistir fotolitografía sobre el otro lado del silicio. A continuación, montar la oblea dispositivo a un segundo (silicio blanco) oblea portadora utilizando fotoprotector.
  3. Etch los canales, también por DRIE, a una profundidad de 200 micras, a través de autograbado el silicio en las ubicaciones de los puertos (la oblea portadora protege la superficie de la herramienta DRIE). De montaje en la oblea dispositivo desde el blanco oblea de Si por inmersión en solución resistir-extracción.
  4. Limpiar la oblea dispositivo y un sin rasgos oblea de 0,5 mm de espesor de vidrio de borosilicato usando una solución Piranha (ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno en una proporción 3: 1).
  5. Sellar los canales de fluido mediante la unión de las obleas de vidrio anódicamente y silicio utilizando los siguientes parámetros: presión de la cámara a 3 mTorr, la presión del pistón en 1000 N, temperatura a 350 ° C, y aplicar 750 V hasta que la corriente cae por debajo de 0,2 mA.
  6. Cortar las fichas individuales de separación, con una cuchilla de diamante en una sierra de cortar en cubitos.

3. Dispositivo de ensamblaje final

  1. Piezo Transducer Adjunto
    NOTA: El ultrasonido se genera en el chip de microfluidos por un transductor piezocerámico unido al lado de silicio.
    1. De awo-componente del kit de epoxi de baja viscosidad, pésese la proporción recomendada de ambos componentes y mezclar a fondo.
    2. Dispensar la mezcla de epoxi con una pipeta y se extendió uniformemente a través de un titanato zirconato de plomo (PZT) piezocerámico para crear una, incluso en capa fina (aproximadamente 10 l de mezcla de epoxi para un piezo con unas dimensiones de 37,5 x 10 x 0,5 mm).
    3. Usando una plantilla o accesorio adecuado, alinear el lado epoxi de la piezocerámico con el chip de microfluidos, proporcionando una zona que sobresale en un lado para la fijación posterior de alambre (véase la figura 2a), y llevar a los dos componentes en contacto. Sujete el conjunto en un vicio, teniendo cuidado de no romper ninguno de los componentes, y curar a la temperatura y la duración recomendada por el fabricante epoxi.
    4. Después de que el epoxi se ha curado, adjunte de calibre fino alambre conduce a cada lado de la piezocerámico, por soldadura con un soldador de punta fina, haciendo el contacto más breve posible con el piezo para evitar thermally de-polarizar ella. También puede utilizar un adhesivo conductor para pegar los cables al piezoeléctrico.

Figura 2
Figura 2. neumático Breadboard, Chip de montaje, y World-a-Chip Interfaz. Fotos de (a) el chip de microfluidos acústica (dimensiones externas de 70 × 9 × 1 mm) con cables de alambre de transductor piezoeléctrico adjuntos, que muestra tres pases de la separación canal por el chip, (b) los atornillados de encargo de fluidos y componentes de tubos mecanizados para la interfaz de chip a mundo, (c) el chip montado en la parte inferior del tablero de fluidos utilizando accesorios de fijación, que abarca una abertura en el tablero para permitir refrigeración del ventilador, (d) una vista superior del tablero con conexiones de los tubos conectados y ventilador de refrigeración, y (e) un esquema de la sección transversal de los accesorios de los tornillos que la interfaz del Tubing con el chip de microfluidos montado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Dispositivo de montaje y World-To-Chip Interfaz
    1. Una el chip a la "breadboard fluídico" (una placa con una rejilla de regularmente espaciadas roscado a través de los orificios pasantes), utilizando los accesorios de sujeción. Adjuntar un ventilador de enfriamiento para el tablero para regular la temperatura durante los experimentos acústicos (ver Figura 2).
      NOTA: En funcionamiento sin el ventilador de refrigeración en los voltajes de unidad habituales eleva la temperatura del dispositivo de 70 a 80 ° C. Esto cambia significativamente la frecuencia de resonancia debido a la velocidad del sonido en el fluido alterado, y puede impactar negativamente en la viabilidad de las partículas biológicas que se están procesando.
    2. Tornillo en conectores de viruta a mundo, anteriormente descrito en otra parte 22 y se muestra en la Figura 2. Únete a éstos itubos nterface a tubos adicionales en las entradas y salidas utilizando estándar de ¼ "-28 sindicatos para 1/16" tubing.

4. Caracterización de Acústica Rendimiento Centrándose

NOTA: Los componentes del sistema necesarios para la acústica centrándose caracterización se agrupan en la Lista de materiales. Los pasos 4.1 y 4.2 a continuación se aplican a cualquier dispositivo Core se utiliza con esta plataforma, mientras que las etapas subsiguientes describen las operaciones específicas para el dispositivo acoustofluidic discutido aquí.

  1. Configuración del sistema
    1. Montar el chip de microfluidos mediante conexiones-mundo-a-chip en el tablero de fluido, tal como se describe en la Sección 3. Realice las conexiones utilizando tubos (como tubos de fluoropolímero 1/16 "diámetro exterior) a un fluido viales de la bomba y de colección. Montar el conjunto de tablero en el escenario de un microscopio capaz de imágenes de fluorescencia equipado con una cámara CCD.
    2. Conecte longitudes de pequeña diamete interiorr (ID) tubo (0,006 "se recomienda) inmediatamente después de la chip (véase la Figura 4) para servir como limitadores de flujo, que estabilizan el sistema y controlan la división del flujo entre las salidas de chips. Utilice tubos de identificación más grandes, tales como 0.01 "o 0.03", para todas las demás conexiones.
      1. Estimar el flujo hidrodinámico resistencia R h de cada trozo de tubo con una longitud L y el diámetro interior D usando la ecuación R = h 128 l / πD 4, donde μ es la viscosidad dinámica del fluido. La caída de presión Δ P debido a cada longitud de un tubo a un caudal dado Q está dada por P = Δ QR h.
      2. Elige una relación de longitudes de restricción para dividir el flujo entre los puntos de venta según sea apropiado para que se utiliza el método de separación. Separación óptima con los chips acústicas en este protocolo requiere una SPO: relación de flujo de LPO approximately 65: 35%.
      3. Elige la longitud de los limitadores de flujo de salida de tal manera que su resistencia fluídica es al menos 3-4 veces más grande que la resistencia total en el resto del sistema (apropiadamente resumió en serie o en paralelo). Para el dispositivo acoustophoresis utilizado en este trabajo, las longitudes de tubería de 35 y 65 cm para la LPO y SPO son adecuados.
        NOTA: La consideración cuidadosa se ​​debe dar a R h de cualquier núcleo de dispositivos de microfluidos. Para nuestro acústica centrándose chips en este trabajo, Rh es baja debido a sus dimensiones relativamente grandes de canal, por lo que las resistencias de tubos conectados fácilmente supere. Para los dispositivos con las dimensiones de los canales más pequeños, la resistencia del chip puede dominar al resto de la tubería del sistema, en el que el diseño de casos y controles de on-chip canal R h es una consideración adicional durante la Etapa 1 de este protocolo. Principios y directrices de diseño detallados están disponibles en la literatura. 23,24
  2. Verificación del Sistema
    1. Compruebe si hay fugas de verificar que el dispositivo de microfluidos no tiene defectos y todas las conexiones de los tubos están sellados. Prescindir de agua a través de los tubos de entrada según sea necesario con una jeringa y vigilar para cualquier fuga de fluido en el canal principal.
    2. Dispensar un volumen conocido a través del chip, y medir los volúmenes recogidos desde las salidas para asegurar que la relación de flujo es como se esperaba. Las desviaciones de la relación volumen esperado pueden indicar bloqueos en una de las salidas o conexiones con fugas.
      1. Para mantener la limpieza del sistema y evitar la obstrucción al ras de todo el sistema (tubo de fluido y el chip) con soluciones de limpieza adecuados (por ejemplo, lejía, etanol, agua) antes y después de ejecutar cualquier experimento.
      2. En caso de obstrucciones o bloqueos en uno de los puntos de venta, enjuague el sistema mientras enchufa la salida clara para eliminar la obstrucción. Si esto no tiene éxito, revertir la dirección del flujo durante el lavado,opcionalmente aplicar pulsos rápidos de flujo inverso (usando una jeringa de accionamiento manual). Por último, si el bloqueo aún no se puede eliminar, reemplazar el tubo o un chip, según sea necesario.
  3. Frecuencia Configuración de escaneo para Acústica Centrándose
    1. Llenar el canal de derivación (véase la figura 1) con líquido tal como agua desionizada, etanol o solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección manual con una jeringa. Tenga en cuenta que este fluido no entra en contacto con la muestra que se procesa. Los detalles de ajuste de posición de nodo utilizando diferentes fluidos de bypass se describen en otro 16,17. En resumen, si el nodo tiene que estar más cerca de la pared divisoria, usar un fluido de derivación de baja densidad, tal como el etanol; para la colocación nodo más cercano a la corriente de muestra de entrada, elegir un fluido más denso, tal como una solución de glicerol.
    2. Hacer una solución del grano de aproximadamente 0,01% (w / v) de 5-8 micras perlas de polímero fluorescentes suspendidos en un tampón tal como PBS con0,05% de Tween-20 y llene la jeringa de entrada de muestra con la solución de perlas. Llene la jeringa de entrada tampón con el mismo tampón (esto no tiene por qué ser el mismo fluido como en el canal de derivación). Tenga en cuenta que, en general, se elige el buffer para adaptarse a la aplicación (consulte el Paso 5.1).
    3. Con el tablero fluídico en la platina del microscopio, se centran aproximadamente a medio camino en la profundidad del canal en una región canal recto justo antes de la toma de corriente con ambos canales (de separación y de derivación) en el campo de visión. Un ángulo oblicuo fuente de luz externa adicional puede ser necesaria para hacer las paredes del canal visible, para el éxito de post-procesamiento de datos de imagen.
  4. Frecuencia automatizado de digitalización y captura de imagen
    1. Haga las conexiones eléctricas utilizando cables blindados (por ejemplo, RG-58 equipados con conectores BNC) a un generador de funciones con una frecuencia de radio (RF) Amplificador para entregar la señal de excitación al transductor piezoeléctrico. Opcionalmente, conecte un osciloscopio parala salida del generador de funciones para el control de la tensión real aplicada al transductor.
    2. Encienda el ventilador de refrigeración, y establecer el generador de funciones de tal manera que la salida del amplificador de RF al transductor piezoeléctrico está en el intervalo de 12 a 25 voltios pico a pico (V pp).
    3. Conjunto ambas jeringas a la misma velocidad de flujo entre 50 y 200 l / min. El uso de una sola bomba de jeringa para conducir ambas jeringas con el mismo motor se recomienda para reducir al mínimo las perturbaciones en el flujo.
    4. Realice un procedimiento de barrido de frecuencia mediante la especificación de las frecuencias de inicio y fin, el tamaño del paso entre los valores de frecuencia y el voltaje de accionamiento piezoeléctrico utilizando un kit de herramientas de automatización de laboratorio tales como LabVIEW de National Instruments.
    5. En cada paso de frecuencia, aplicar la tensión durante 15 segundos para permitir que el sistema se equilibre, luego capturar 10 imágenes de perlas que fluyen a través del chip para su posterior análisis (tiempos de exposición entre 10 y 100 mseg se recomiendan).
    6. Entre correoada aplica paso de frecuencia, apague la tensión durante aproximadamente 20 segundos para permitir que las cuentas redistribuir uniformemente a través del canal y eliminar el sesgo en centrarse en el paso de frecuencia aplicado anteriormente.
  5. Análisis de imagen para determinar la frecuencia de resonancia y de enfoque Posición
    1. Ejecutar una secuencia de comandos de análisis de imagen (como el guión AF_freqScanPlotter.m MATLAB proporcionado con el presente Protocolo) e introduzca la información requerida en las indicaciones: seleccione la lista de archivos de imagen generados en el paso 4.4, introduzca el principio de exploración y dejar de frecuencias y tamaño de paso, la anchura total del canal, la ubicación de la pared, y finalmente seleccionar la región de imagen para analizar, incluyendo tanto la separación y canales de derivación.
    2. Observar la media guión análisis de la serie de imágenes capturadas en cada paso de frecuencia, y el promedio de los valores de intensidad a lo largo de la dirección del flujo. Esto se traduce en una sección transversal de línea de exploración de la intensidad de fluorescencia.
      NOTA: La frecuencia correspondiente a la highe st intensidad se define como la frecuencia de resonancia (Figura 3, fila central), y la posición en el canal donde se produce la mayor intensidad es la posición de enfoque (Figura 3, fila inferior).

Figura 3
Figura 3. Scan Frecuencia Representante. Ejemplo de datos de escaneo de frecuencia para así acoplada (A) y escasamente acoplado (B) piezoeléctrico y chip. Fila superior: intensidad de fluorescencia de las perlas (rojo representa alto, y el azul representa baja intensidad). Fila central: máxima intensidad en cada frecuencia. Fila inferior: la ubicación de la máxima intensidad, donde la línea discontinua roja indica predijo posición de enfoque, y los diamantes rojos indican la frecuencia de resonancia determinada por la intensidad máxima.g "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. La separación automatizada

NOTA: El experimento de separación automatizado se ejecuta para separar partículas grandes de partículas pequeñas debido a las fuerzas acústicas centrándose dependientes del tamaño aplicados en el chip de microfluidos. Los componentes del sistema necesarios están agrupados en la Lista de materiales.

  1. Configuración del sistema y Preparación de la muestra
    1. Conectar el chip microfluídico a la bomba de jeringa, válvulas de selección de puertos múltiples controlados por ordenador, medidores de flujo de PC-interfaz, y el tubo, como se muestra en la Figura 4. Esta configuración permite automatizar el procesamiento de las muestras a través del chip de separación de microfluidos, así como automatizadas la limpieza de los pasos entre los experimentos para eliminar la contaminación cruzada y muestra de arrastre.
    2. Utilice un tampón de muestra adecuado para las células o partículas a separar, o de lo requerido por el ensayo de análisis paraser utilizado después de la separación. Como en el paso 4.3.2, el tampón de recuperación (pero no necesariamente el fluido bypass) deben coincidir con el fluido de muestra.
      NOTA: Cualquier tampones acuosos usados ​​típicamente con muestras biológicas (por ejemplo, PBS) tiene propiedades acústicas similares al agua y no cambiará apreciablemente el rendimiento del dispositivo acústico. El uso de fluidos de muestra con densidad y viscosidad significativamente diferente de agua es posible, pero sólo se recomienda para los operadores con experiencia acoustophoresis significativo.


Figura 4
Figura 4. Configuración del sistema acústico para experimentos automatizados separación. Las líneas azules conocer la vía de flujo principal a través del sistema. Todas las líneas verdes y negras son 0.03 "tubos de diámetro interior (ID), y todas las líneas azules y de color gris son 0.01" tubos ID, con el eXception de las bobinas que llevan a cabo, que son 0,03 "Id, y los limitadores de flujo, que son 0.006" ID. Las jeringas se llena con tampón, y las bobinas de retención tienen volumen suficiente (550 l) para evitar la absorción de las muestras o reactivos de limpieza en las jeringas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Procedimiento de separación
    1. Estado de Pre-ejecución. Antes de ejecutar la separación, garantizar que los depósitos de reactivos de limpieza (lejía, etanol, tampón) tienen suficiente líquido, los depósitos de residuos no están llenos, y las líneas de fluido están preparados (es decir, lleno de solución). Si esta última condición es incierto, o si el sistema se ejecuta por primera vez después de la marcha en vacío (por ejemplo, la primera vez en un día determinado), ejecuta un procedimiento de limpieza automático (consulte el Paso 5.3). Ajuste las válvulas 3 y 4 en los puntos de venta de chips para fluir a perder reservoirs inicialmente.
    2. Encienda el ventilador de refrigeración, y ajuste el generador de funciones a la frecuencia de resonancia para el chip acústica que se utiliza, según lo determinado en el paso 4.5. Ajuste el punto de ajuste de voltaje en el generador de funciones para que las salidas del amplificador de RF entre 12 y 25 V pp, según corresponda para la separación deseada.
    3. Conecte la entrada de la muestra Vial, Buffer Vial de entrada, y copas de recogida adecuados al sistema. Justo antes de conectar el vial de entrada de la muestra a su tubo de recogida, vórtice brevemente vial para volver a suspender las partículas que puedan se han asentado. Luego, coloque el vial e iniciar la rutina de separación sin demora.
      PRECAUCIÓN: Si la muestra para ser procesada contiene agentes potencialmente infecciosos, los viales deben ser de un tipo con tapa de rosca, para mantener un sistema de sellado y evitar que la muestra de aerosolización. Además, cuando se trabaja con materiales biopeligrosos, manejar todos los viales y tubos mientras lleva puesto el equipo de protección necesario y utilizando el reqcontroles de riesgo pedirá otra y procedimientos para el Grupo de Riesgo Biológico y Bioseguridad nivel adecuado al material. Consulte las políticas y protocolos institucionales en caso de cualquier incertidumbre.
    4. Utilice un programa en un conjunto de herramientas de automatización de laboratorio para controlar las válvulas, sensores de flujo y la bomba para llevar a cabo la rutina completamente automática de separación.
      NOTA: La rutina cambia las válvulas, acciona la retirada bomba de jeringa y la infusión, y monitores de flujo de datos de los sensores para la correcta sincronización de la colección de las fracciones de muestreo de salida. Los pasos principales se resumen a continuación en 5.2.4.1 a través 5.2.4.3, como si se lleva a cabo de forma manual.
      1. Cebe el tubo de recogida. Retirar aproximadamente 15 l de la entrada de frasco de la muestra para llenar completamente el tubo de conexión a la válvula 1. Simultáneamente, cebar el tubo que conecta el Vial de búfer de entrada a la válvula 2. De manera similar, el Primer la entrada de aire de la válvula 1 para asegurar que se no contiene fluido. Por último, cambiar las válvulas 1 y 2 para expulsar a perderel exceso de líquido o aire que ha entrado en la bobina de carga.
      2. Cargar la bobina de muestra, como se muestra en la Figura 5a. Una secuencia de carga típica para el procesamiento de una muestra de 250 l es retirar 25 l de aire a 50 l / min, a continuación 250 l de muestra en 200 l / min, seguido de 35 l de tampón líder en 200 l / min, y finalmente otros 25 l de aire a 50 l / min.
        NOTA: Todos los volúmenes y caudales son seleccionables por el usuario. Tenga en cuenta que esta secuencia de carga es en orden inverso de cómo los tapones de fluido fluirá a través del dispositivo de separación.
      3. Comience la infusión de la muestra. Establecer las bombas de jeringa para infundir los tapones de fluidos cargados a la velocidad deseada (típicamente 100 l / min). Supervisar las velocidades de flujo en el SPO y LPO con sensores de flujo para asegurar que el flujo es constante y en la relación determinada en el paso 4.1, y que no se ha producido la obstrucción.
      4. Reunir las fracciones separadas. Cuando los sensores de flujo detectan un aumento en la tasa de flujo, lo que indica passage de la primera cámara de aire, cambiar la válvula de salida correspondiente a partir de residuos (donde se inició en el paso 5.2.1) a un vial de recogida de muestras.
      5. Después del paso de la muestra desde el chip, observe el sensor de flujo detecta el segundo espacio de aire. En este punto, cambiar las válvulas de salida de regreso a la basura. Después se dispensa el volumen completo cargado desde el paso 5.2.4.2, detener la infusión de bomba de jeringa y terminar la rutina de automatización cuando el caudal alcanza el valor cero.
    5. Después del experimento de separación es completa, desconecte el SPO y LPO muestra viales de recolección y almacenar adecuadamente para su posterior análisis.
  2. Limpieza y Descontaminación Automatizado
    NOTA: Antes de procesar cada muestra, lavar y descontaminar todo el sistema de fluido con la siguiente rutina automatizada.
    1. Asegure la SPO y tubos de recogida de los viales de LPO, así como el tubo de recogida de muestras en frascos vacíos para recoger el exceso de soluciones de limpieza que se sonrojó through los tubos.
    2. Comience la rutina automatizada de la limpieza del sistema. Al igual que con el procedimiento de separación automatizada en el paso 5.2, el programa debe controlar las válvulas y bomba de jeringa secuencialmente cargar la bobina de retención con reactivos de limpieza y enjuague a través del sistema.
    3. Realice la siguiente rutina de limpieza: a ras de lejía al 10%, luego con 70% de etanol, y terminar con agua o un tampón salino apropiado (por ejemplo, 1x PBS o tampón utilizado para el procesamiento de la muestra). Utilice los siguientes volúmenes de descarga: 450 l durante lejía y etanol, y 1.000 mu l de agua / tampón.
    4. Durante los pasos lavado, enjuague cada reactivo en el SPO mientras que la válvula de salida LPO se establece en un puerto que está bloqueado, entonces viceversa, para eliminar cualquier obstrucción potenciales en los limitadores de flujo de salida. Mantener las tasas de abstinencia y de flujo de infusión de 300 a 500 l / min para minimizar la generación de burbujas en el tubo y contrapresión acumulación cuando cualquiera de las OEP o el LPO se bloquea.
    5. Discard las soluciones de lavado en exceso y los viales en que se recogieron siguiendo los procedimientos adecuados para el manejo de desechos biológicos o químicos.

Representative Results

Las principales características del diseño del dispositivo acústico de microfluidos se destacan en la Figura 1, y se describen completamente en otro lugar. 15 En resumen, de lado a lado el flujo de dos corrientes de fluido en un canal de separación, separado de un canal de derivación en paralelo por una pared delgada de silicio. Dado que la fuerza de radiación magnitud primaria escalas con el volumen de las partículas, las partículas grandes migran fuera de la corriente de entrada mixta de muestra hacia el nodo de presión acústica situado en la corriente de fluido de recuperación adyacente, mientras que las partículas pequeñas permanecen en el flujo original (Figura 1B, C). La arquitectura de dos canales subdividido mejora la separación de partículas 17 y permite el ajuste de la posición de nodo utilizando diferentes fluidos de canal de derivación. 16 El tablero de fluidos y accesorios proporciona una plataforma robusta para el mundo a chip conexiones, y el diseño modular permite el cambio rápido entre los chips de fluidos (Figura 2). Este configuration permite asimismo las conexiones de fluido reversibles, que sellan hasta 1.000 psi, a realizar de forma rápida y fiable (Figura 2B, E).

Los resonantes de frecuencia f res de un chip se puede estimar mediante cálculos analíticos 1D simples (consulte el paso 1.1.1). A partir de un modelo de elementos finitos en 2D más completa de nuestra sección transversal del dispositivo, 16 la posición de enfoque de resonancia esperada para 2-nodo es 225 m de la pared y la frecuencia esperada es 1,68 MHz. Sin embargo, res f de dispositivos reales pueden variar en ± 100 kHz, dependiendo de la temperatura de funcionamiento y el acoplamiento de las resonancias longitudinales y laterales. Por lo tanto, después del montaje del dispositivo, res f deben ser verificadas empíricamente a caudales relevantes y tensiones de accionamiento piezoeléctrico, tal como se describe en el paso 4 del protocolo. La Figura 3 muestra las exploraciones de frecuencia representante tomadas a 200 l / min, con agua en los principales canales y de derivación, y 20 V pp suministrada al piezo. Cuando el acoplamiento entre el piezo y dispositivo de microfluidos es bueno, las partículas se concentran fuertemente a la frecuencia resonante, lo que resulta en un pico claro en la intensidad de fluorescencia y la migración a la posición de enfoque se esperaba (Figura 3A). Por el contrario, cuando hay mal acoplamiento, partículas no se centran bien y los resultados del análisis de frecuencia serán similares a la figura 3B. En tales dispositivos, puede ser necesario volver a montar, si un adhesivo reversible se ha utilizado el transductor piezoeléctrico; de lo contrario, este dispositivo no es adecuado cuando se enfoca de alta calidad o de flujo rápido son críticos para la aplicación requerida. Los datos en la Figura 3 informan a la elección de la frecuencia de funcionamiento para los experimentos posteriores, y el voltaje y el flujo gama tarifa disponible para partículas separación eficiente.

archivos / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Figura 5. de tratamiento automatizado de la muestra. (A) Esquema de la muestra cargada en la bobina de la muestra. (B) perfil de flujo Representante de un experimento de la separación exitosa. (C) de flujo perfil de una separación ejecutar durante el cual la salida SPO obstruido aproximadamente a 220 seg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de identificar los chips que son separadores eficaces, que se incorporan en el sistema representado en la Figura 4. Sistema total volumen de barrido se reduce al mínimo mediante el uso de tubos con 0,01 "diámetro interior a lo largo de la trayectoria de flujo principal (líneas azules). La figura 5A ilustra el maquillaje de un tapón de muestra típica infundido a través del sistema. Se requiere una pequeña cantidad de "tampón líder" (~ 35 l) para precede la muestra en el flujo para eliminar las fluctuaciones de flujo mientras que la muestra se mueve a través del chip de separación. La Figura 5B muestra los datos de flujo resultantes de un exitoso experimento de separación acústica automatizado. Las principales características de una carrera exitosa incluyen: (1) un aumento transitorio en la tasa de flujo tanto en el LPO y SPO como se acumula presión y el fluido comienza a fluir a través del sistema, (2) un pico agudo que indica el paso de una burbuja de aire (la recuadro muestra un perfil ampliado de una sola burbuja), que debería llegar a la SPO antes de la LPO debido al flujo desigual de las dos salidas, (3) flujo estable a través de ambas salidas entre los dos burbujas de aire como la muestra se mueve a través del sistema, y (4) una disminución gradual en la velocidad de flujo en ambas salidas después de que el volumen de la muestra completa se entrega al sistema. Carreras problemáticas son inmediatamente evidentes a partir de perfiles de flujo similares a la figura 5C, donde aparece que la SPO se obstruyó después de aproximadamente 220 ​​segundos. En thi s caso, un procedimiento de limpieza similar a la descrita en el Paso 5.3 se debe ejecutar para destapar el canal.

Figura 6
Figura afinabilidad 6. Dispositivo: Tamaño de partículas y efectos de tensión. Porcentaje de microesferas de poliestireno extraídos en el LPO depende del tamaño de partícula y la tensión suministrada al piezocerámico. Cada línea corresponde a una tensión de servicio diferente a la frecuencia resonante, determinado como se describe en el Paso 4. caudal total a través del dispositivo es de 200 l / min, con frecuencias de accionamiento aplicada entre 1,62 y 1,64 MHz. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos tres experimentos separados. Reproducido y modificado con autorización de la Real Sociedad de Química de http://pubs.rsc.org / es / contenido / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 6 muestra los resultados de separación compilados utilizando diversos tamaños de partículas de poliestireno y piezoeléctricos conducir tensiones que demuestran los parámetros de funcionamiento necesarios para la separación eficiente. En general, se requieren voltajes más altos (es decir, fuerzas acústicas mayores) para extraer las partículas más pequeñas, como se esperaba. Voltajes del disco no se puede aumentar indefinidamente, sin embargo, debido a una mayor disipación de calor y el aumento de los efectos de la transmisión acústica. 13 El argumento sirve como una guía general para partículas tamaños separación de partículas que muestran significativamente diferente de recuperación a una tensión unidad específica (por ejemplo, 10- y las partículas de 2 micras, con 8,8 V pp) se separarán también. En general, las poblaciones de partículas con una diferencia de gran tamaño, tales como virus (~ 100 nm) y células (~ 10 m) se pueden separar rápida y eficazmente, al igual que las células de diffErent tamaños (por ejemplo, 6-8 micras eritrocitos discoidales y 8-15 micras leucocitos). Las condiciones específicas necesarias para trabajar con otros tipos de células tienen que ser determinado empíricamente, como la forma celular, la densidad y la compresibilidad afectar a su contraste acústico, además de tamaño de celda. Con este fin, los procedimientos en la Etapa 4 son útiles para determinar las condiciones de separación utilizables para cualquier nuevo tipo de célula o partícula, y no sólo para evaluar la calidad de un dispositivo acoustophoresis particular.

Figura 7
Figura 7. Separación de Eficiencia de Cell-Virus muestras adicionadas. Separación sea resultado de células Raji (A) con púas con el virus del dengue (DENV) y (B) células Raji y células de riñón de Boa pinchos con Virus Golden Gate (GGV). Los porcentajes recogidos se definen como la fracción de virus o células que salen de una específicala salida en comparación con la cantidad total que sale del chip. Las barras de error para (A) son la desviación estándar de 3 intentos, mientras que las muestras en (B) solamente se procesaron una vez debido a las bajas cantidades disponibles. 1x PBS se utilizó como fluido de tampón de muestra y la recuperación, con agua en el canal de derivación para todos los experimentos. Frecuencias de funcionamiento de viruta oscilaron entre 1,60 y 1,64 MHz, con tensiones de accionamiento entre 16 y 20 V pp. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para demostrar la utilidad de esta plataforma para la separación de partículas biológicas, lo primero que usamos para procesar muestras biológicas bien caracterizados: células Raji humanos (10 5 células / ml, diámetro promedio 8.10 m 25) marcado con el virus del dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diámetro aproximado de 50 nm 26). Figura 7A muestra el porcentaje de células Raji y DENV recogidos tanto en el SPO y LPO (definida como la fracción de cada tipo de partícula recogido de cada salida en comparación con la cantidad total de cada partícula recogido del chip). El experimento se repitió por triplicado, y las células Raji se cuantificaron usando un contador Coulter, mientras que DENV se cuantificó usando una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).

A continuación, el rendimiento del sistema se probó en un escenario que es más realista para el procesamiento de muestras clínicas, en las que las características físicas exactas de las partículas puede ser desconocida, y las cantidades de muestra disponibles son más bajos. Aquí, se evaluó la separación de la recientemente identificado virus puerta de oro (GGV), un patógeno serpiente que infectan células renales boa constrictor. 27 El tamaño de la partícula viral GGV aún no se ha medido, pero desde GGV pertenece a la familia Arenaviridae, que es probable de unatamaño similar, entre 100 y 150 nm. 28 Se procesaron muestras con GGV pinchos (10 4 pfu / ml) en células Raji humanos (no un objetivo infección para el virus), y células de riñón de boa (objetivo infección para GGV, tamaño aproximado 10 27 micras), con ambos tipos de células en 10 células / ml 4. Como estaban disponibles en cantidades bajas estas muestras, separación sea resultado de sólo una carrera experimental se presentan en este trabajo. Figura 7B muestra el porcentaje de células Raji, células Boa y GGV obtuvieron de la SPO y LPO. Las células fueron cuantificados en estos experimentos por contar con un hemocitómetro y los virus se cuantificaron por RT-qPCR.

Discussion

Este protocolo se presenta la integración a nivel de sistema de dispositivos de microfluidos para equipos macroescala para realizar el procesamiento de la muestra biológica automatizado. La modularidad de esta plataforma permite que sea adaptable a cualquier dispositivo de flujo continuo, y, como ejemplo, el protocolo presentado se centra en la caracterización y la optimización del rendimiento de un dispositivo de separación de partículas acoustofluidic. Tres ventajas principales de este protocolo se destacan: (i) la modularidad y chip a la interconexión mundial, (ii) la caracterización robusta del rendimiento del dispositivo, y (iii) el tratamiento automatizado de los volúmenes de las muestras medidas con precisión para la separación de partículas.

yo. Modularidad y chip a mundo interconexión

Como se muestra en la Figura 2, el chip de microfluidos está montado sobre un tablero a medida para adaptarse fácilmente a una platina del microscopio para la observación directa. El tablero contiene # 6-40 UNF agujeros roscados en una rejilla 5 mm de paso, enaBling el chip para ser asegurado, y las conexiones de fluido que se hará. Las conexiones de fluido se PEEK tubos con extremos mecanizados, que junta contra el chip fluídico con una cara de sellado de junta de goma y un collar de acero inoxidable. Este esquema de interfaz hace que para el reemplazo fácil chip y rápido rediseño dispositivo, que requieren pocos o ningún cambio en otros componentes del sistema, las huellas de chips suministrados cumplen con el formato de cuadrícula. Por ejemplo, hemos utilizado esta plataforma con chips de microfluidos para la electroforesis de flujo continuo, la lisis celular térmica, 29 mezclado rápido de los reactivos para la síntesis química, y la captura de una sola célula y el interrogatorio.

ii. Caracterización robusta del rendimiento del dispositivo

Con el fin de optimizar el rendimiento de cualquier dispositivo de separación de microfluidos, su funcionamiento primero debe caracterizarse completamente. El sistema descrito aquí apoya el desarrollo de protocolos rápidos y automatizados para hacer esto. Para el examp específicale de dispositivos acústicos de enfoque, la calidad centrándose, frecuencia de operación, y la posición de las partículas se centraron en el canal de microfluidos debe medirse para cada dispositivo individual. Estas medidas requieren barriendo a través de una gama de frecuencias de accionamiento piezocerámico, voltajes y velocidades de flujo, para identificar las combinaciones óptimas de los parámetros para la separación de alta calidad. El protocolo presentado varía automáticamente estos parámetros ajustables y captura la relevancia de datos, es decir, las imágenes fluorescentes de las partículas que fluyen en el canal que son post-procesado para generar las mediciones requeridas de partículas de enfoque de la calidad, la frecuencia y la posición (Figura 3).

Caracterización completa del rendimiento del dispositivo acústico requiere repetir los pasos 4.4 y 4.5, según sea necesario en diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, la posición de enfoque absoluta de un chip se encuentra mediante la ejecución del barrido de frecuencias a velocidades de flujo relativamente bajas y alto voltajes para asegurar la migración completa a la ubicación de nodos. Además, tales exploraciones de frecuencia pueden evaluar la calidad de montaje de dispositivo (cuando se ejecuta con perlas de poliestireno de tamaño conocido), o para determinar cómo un tipo de partícula previamente desconocido se comportará en el sistema (después de un chip se ha caracterizado con los granos). Un chip con buena transferencia de energía desde el piezocerámico al canal de microfluidos se traducirá en apretada centrándose a velocidades de flujo altas (> 1 ml / min) y los voltajes bajos (12-15 V PP), mientras que aquellos con transferencia de energía pobres no se centrará incluso a bajas velocidades de flujo (<100 l / min) y altos voltajes (> 20 V pp). Hemos encontrado que el contacto íntimo entre el chip microfluídico y el piezocerámico es crítico para la transferencia eficiente de la energía en el fluido. La investigación adicional del método óptimo de la unión del chip de microfluidos y el piezocerámico permitirá la producción fiable de dispositivos de alto rendimiento.

Por último, una completala imagen de la operación de un dispositivo de acoustophoretic se puede obtener mediante la combinación de las mediciones de barrido de frecuencia basados ​​en imágenes de la Etapa 4 (y en la Figura 3) con recuentos de partículas recogidas de la SPO y LPO como funciones de los parámetros de funcionamiento pertinentes, a partir de los experimentos de separación llevadas a cabo con microesferas , como se describe en el Paso 5. Como se muestra en la Figura 6, una serie de experimentos automatizados, puede caracterizar rápidamente el rendimiento y la capacidad de ajuste de un dispositivo individual, informando al usuario del espacio óptimo de parámetros para operar el dispositivo para la separación de partículas.

iii. Automatizado de procesamiento a pequeña muestra para la separación de partículas

Para el procesamiento de muestra basada en chip microfluídico éxito y exacta, es crítico para metro, la carga, entregar de forma fiable y precisa, y recoger los volúmenes de fluido a medida que pasan a través. Esta precisión es especialmente importante cuando el volumen de muestra es pequeño(~ 0,1-1 ml), que es común en entornos de laboratorio clínico o de investigación. 30 manipulación de la muestra precisa es un reto en los experimentos de microfluidos tradicionales que emplean la retirada manual de la muestra en una jeringa y la infusión en un dispositivo sin votaciones de cuando la muestra se ha separado y cuando se debe recoger. El protocolo presentado emplea automatizado muestra bobina de carga y despacho junto con información en tiempo real de sensores de flujo para permitir separaciones reproducibles de pequeños volúmenes de muestra.

La Figura 5 muestra los perfiles de flujo medido en la SPO y LPO de un experimento de separación típico. En primer lugar, tampón líder de al menos 35 l se carga para asegurar un flujo estable antes de la muestra alcanza el chip acústico. Los volúmenes de muestra de menos de 100 l no se recomiendan para esta configuración del sistema, debido a dilución de la muestra debido al tampón líder se hace excesiva. Un enchufe de aire se utiliza al principio de THe inyección antes de la memoria intermedia que conduce a separar el bloque de muestra del fluido que sigue, la prevención de la mezcla y dilución de la muestra y servir como un indicador para los sensores de flujo. Después de un transitorio inicial como el líquido comienza a moverse a través del sistema, las señales de punto sostenido en ambas salidas indican el paso de la primera burbuja de aire. Estos transitorios son seguidos por un largo período de flujo estable como la muestra fluye a través del sistema, y ​​luego otro pico cuando pasa la segunda burbuja de aire, y finalmente una disminución eventual de la tasa de flujo a cero después de la bomba se detiene jeringa.

El paso de los tapones de aire a través de los sensores de flujo se utiliza como puntos de activación para cambiar las válvulas para iniciar y detener la recogida de muestras, minimizando así la muestra perdido y la dilución por volúmenes de fluido no muestra. Medición de bucle cerrado de los volúmenes de muestra procesada elimina la necesidad de volver a programar estos valores antes del inicio del experimento cada vez que se cambia la muestra de entrada. Esta característica esparticularmente importante cuando el volumen de muestra es limitado, por ejemplo en el caso de muchas muestras clínicas. Monitoreo de flujo en tiempo real también ayuda en la solución de problemas; una mala racha (por ejemplo, la formación de una obstrucción en uno de los puntos de venta) es inmediatamente evidente a partir de los perfiles de flujo resultantes, como en la Figura 5b.

Para demostrar la flexibilidad y la eficacia de la separación acoustofluidic utilizando la arquitectura del sistema presentado, DENV purificado y reservas de virus GGV se clavó en acciones celulares y separados por el procesamiento a través del chip de microfluidos. Figura 7a muestra que las células Raji fueron bien separados, de los virus, como 97 % de las células Raji que salen del chip se encontró que en el LPO, dejando de ese modo una muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO. En comparación, la eficiencia de la separación DENV fue menor, con 70% de DENV que sale el chip se encuentra en la SPO. Esto se puede atribuir a una ligera mezcla convectiva inducida por las vueltas de la separatien el canal, pero más probable que algunas partículas DENV que migran junto con las células Raji en el LPO. Las células que migran lateralmente a través de líneas de corriente arrastra un poco de líquido con ellos, incluso a bajo número de Reynolds. Por este mecanismo, así como la adsorción superficial no específica, las partículas virales de transferencia en la LPO. Sin embargo, la muestra altamente enriquecido de DENV en el SPO es un beneficio significativo, por ejemplo, cuando se utiliza la secuenciación de novo para detectar e identificar virus.

La figura 7b muestra que en una carrera experimental, sólo alrededor del 70% de las células Boa que salen del chip se encontraron en la LPO, en comparación con casi el 100% de eficiencia de separación para células Raji. La diferencia en el rendimiento de separación entre los dos tipos de células puede ser atribuible a un tamaño medio menor o una menor densidad de células Boa comparación con las células Raji, por lo tanto, lo que resulta en fuerzas acústicas más pequeñas. Para confirmar o refutar estos supuestos, el tamaño, la densidad y morfología de Boacélulas en suspensión (que normalmente crecen adherente) de las células de la boa se deben medir con precisión, un esfuerzo para una mayor investigación. En los mismos experimentos, de manera similar a los experimentos con DENV, el grueso de la GGV recuperado salido del SPO, lo que indica un enriquecimiento de la fracción viral.

Los datos presentados ponen de relieve los desafíos inherentes a la ingeniería plataformas de amplia aplicación para el procesamiento de una variedad de muestras biológicas. Es importante destacar que las interacciones biológicas pueden empezar a jugar tan grande un papel como los efectos físicos y mecánicos. Sin embargo, estos experimentos preliminares demuestran también el poder y la promesa de utilizar esta arquitectura del sistema para el procesamiento de muestras en aplicaciones clínicas y de investigación. Como sistema de ingeniería robusta, bien caracterizado, esta plataforma ofrece la posibilidad de buscar respuestas a nuevas preguntas científicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats