Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung

1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine
Chemistry

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Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

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Abstract

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind in fast allen biologischen Prozessen eng verbunden und werden in vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Daher gibt es eine große Anstrengung, um die PPI in Grundlagenforschung und in der pharmazeutischen Industrie zu zielen. Protein-Protein-Schnittstellen sind in der Regel groß, flach und häufig nicht über Taschen, Verkomplizierung der Entdeckung kleiner Moleküle, die solche Stellen zielen. Alternative Targeting Ansätze unter Verwendung von Antikörpern weisen Beschränkungen aufgrund der schlechten oralen Bioverfügbarkeit, niedriger Zelldurchlässigkeit, und die Produktion Ineffizienz.

Verwendung von Peptiden zur PPI-Schnittstellen Ziel hat mehrere Vorteile. Peptide haben eine höhere Konformations Flexibilität, erhöhte Selektivität und sind in der Regel teuer. Allerdings haben Peptide ihre eigenen Grenzen einschließlich schlechte Stabilität und Ineffizienz Kreuzung Zellmembranen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kann Peptidcyclisierung durchgeführt werden. Zyklisierung wurde gezeigt, dass Peptid-Selektivität zu verbessernMetabolische Stabilität und Bioverfügbarkeit. Die Vorhersage der bioaktiven Konformation eines zyklischen Peptids ist jedoch nicht trivial. Um diese Herausforderung zu meistern, um einen attraktiven Ansatz es Bildschirm eine fokussierte Bibliothek-Bildschirm, in dem alle Backbone zyklischen Peptide haben den gleichen Primärsequenz, unterscheiden sich aber in Parameter, die ihre Konformation beeinflussen, wie zum Beispiel Ring Größe und Position.

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Synthese einer Bibliothek von Backbone zyklischen Peptide auf bestimmte Parasiten EPI. Mit Hilfe eines rationalen Design-Ansatz entwickelten wir Peptide aus dem Gerüstprotein L eishmania Rezeptor für aktivierte C-Kinase (LACK) abgeleitet. Wir vermuten, dass Sequenzen in LACK in Parasiten konserviert sind, aber nicht in den Säugetierwirt homolog kann Interaktionsstellen für Proteine, die kritisch für den Parasiten Lebensfähigkeit darzustellen. Die zyklischen Peptide wurden unter Verwendung von Mikrowellenstrahlung, um die Reaktionszeiten zu reduzieren und die synthetisiertenEffizienz. Die Entwicklung einer Bibliothek von Backbone zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Ringgrößen ermöglicht eine systematische Bildschirm für die meisten biologischen aktiven Konformation. Dieses Verfahren stellt eine allgemeine, schnelle und einfache Art und Weise die Synthese cyclischer Peptide.

Introduction

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) spielen eine zentrale Rolle in den meisten biologischen Prozesse, von der intrazellulären Signaltransduktion, Zelltod 1. Daher Targeting PPI ist von grundlegender Bedeutung für die Grundlagenforschung und therapeutische Anwendungen. PPIs durch spezifische und stabile Antikörper reguliert werden, aber Antikörper sind teuer und schwierig herzustellen und haben eine schlechte Bioverfügbarkeit. Alternativ kann PPI durch kleine Moleküle ausgerichtet werden. Kleine Moleküle sind einfacher zu synthetisieren und preiswert im Vergleich zu Antikörpern; jedoch sind sie relativ weniger flexibel und passen besser, kleine Hohlräume als großes Protein-Protein-Grenzflächen 2,3. Diverse Untersuchungen haben gezeigt, dass Peptide, die einfacher und billiger als Antikörper und flexibler als die kleine Moleküle sind, können Protein-Grenzflächen zu binden und zu regulieren PPIs 4,5. Die globale therapeutische Peptidmarkt wurde um 15 Milliarden US-Dollar im Jahr 2013 geschätzt und wächst um 10,5% annually 6. Darüber hinaus gibt es mehr als 50 vertrieben Peptide, etwa 270-Peptide in verschiedenen Phasen der klinischen Prüfung, und etwa 400 Peptide in fortgeschrittenen präklinischen Phasen 7. Obwohl zahlreiche Peptide werden als Arzneimittel verwendet werden, Peptide stellen noch einige Herausforderungen, die ihre weitverbreitete Anwendung, einschließlich schlechte Bioverfügbarkeit und Stabilität, Ineffizienz im Kreuzungs Zellmembranen und Konformationsflexibilität 8,9 zu begrenzen. Eine Alternative, diese Nachteile zu überwinden, ist es, verschiedene Modifikationen wie lokale (D-Aminosäure und N-Alkylierung) oder global (Cyclisierung) 8,10-12 Einschränkungen gelten. Diese Modifikationen auch natürlich vorkommen. Beispielsweise Cyclosporin A, ein Immunsuppressivum cyclischen natürliches Peptid, enthält ein einzelnes D-Aminosäure und erfährt eine N-Alkylierung Modifikationen 13,14.

Modifikation der natürlichen Aminosäuren lokalen Beschränkungen, wie zum Beispiel D- und N-Alkylierung zu induzieren, oft auf die Peptid9; s biologische Aktivität. Jedoch Cyclisierung, bei der die Sequenz von Interesse gleich bleiben kann, wird eher die biologische Aktivität zu bewahren. Cyclisierung ist eine sehr attraktive Möglichkeit, Peptid Konformationsraum durch Verringerung das Gleichgewicht zwischen verschiedenen Konformationen zu beschränken. Sie erhöhen in der Regel der biologischen Aktivität und Selektivität durch die Beschränkung des Peptids an der aktiven Konformation, die nur eine Funktion vermittelt. Cyclisierung verbessert auch die Stabilität der Peptide, indem das Peptid in einer Konformation, die weniger durch abbauende Enzyme erkannt wird. Tatsächlich wurden zyklische Peptide gezeigt, metabolische Stabilität, Bioverfügbarkeit und die Selektivität verbessert werden im Vergleich zu ihren linearen Gegen 15-17 haben.

Jedoch kann die Cyclisierung ein zweischneidiges Schwert, da in einigen Fällen die Einschränkung können die Peptide von der Erreichung eines bioaktiven Konformation verhindern. Um diese Hürde zu überwinden, eine fokussierte Bibliothek, in der alle Peptide haben die gleiche Grund SequencE und demzufolge konstant Pharmakophore synthetisiert werden. Peptide in der Bibliothek unterschiedlich Parameter, deren Struktur zu beeinflussen, wie Ringgröße und der Position, um in der Folge Bildschirm für die meisten bioaktiven Konformation 9,18.

Peptide können in Lösung und durch eine Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) Ansatz, der jetzt die häufiger Peptidsyntheseansatz und wird weiter diskutiert werden, synthetisiert werden. SPPS ist ein Prozess, durch den chemischen Umwandlungen sind auf einem festen Träger über einen Linker durchgeführt, um eine breite Palette von synthetischen Verbindungen 19 vorzubereiten. SPPS ermöglicht Zusammenbauen Peptiden durch aufeinanderfolgende Kopplung der Aminosäuren in einer stufenweise vom C-Terminus, die an einen festen Träger gebunden ist, an den N-Terminus. Die N-α-Aminosäure-Seitenketten sind mit Schutzgruppen, die in den während Peptidelongation verwendeten Reaktionsbedingungen stabil sind, die Zugabe einer Aminosäure pro st sicherzustellen maskierendenep. Im letzten Schritt wird das Peptid vom Harz gelöst und die Seitenketten-Schutzgruppen werden gleichzeitig entfernt. Während das Peptid, das synthetisiert wird, können alle löslichen Reagenzien aus dem Peptid-feste Trägermatrix durch Filtration entfernt und weg am Ende jedes Kopplungsschritt gewaschen werden. Mit einem solchen System kann ein großer Überschuß an Reagenzien in hoher Konzentration Kupplungsreaktionen zum Abschluss zu bringen und alle Syntheseschritte können in demselben Behälter ohne Übertragung von Material 20 durchgeführt werden.

Obwohl SPPS hat einige Einschränkungen, wie beispielsweise der Herstellung von unvollständigen Reaktionen, Nebenreaktionen, unreinen Reagenzien, sowie Schwierigkeiten Überwachung der Reaktion 21, haben die Vorteile der SPPS es der "Goldstandard" für die Peptidsynthese hergestellt. Zu diesen Vorteilen gehören die Möglichkeit, nicht-natürliche Aminosäuren, Automatisierung, einfache Reinigung zu integrieren, minimiert physikalische Verluste und die Verwendung von überschüssigen Reagenzien, was zuhohe Erträge. SPPS ist gezeigt worden, sehr nützlich bei der Synthese von schwierigen Sequenzen 21,22 fluoreszierenden Modifikationen 23 und Peptidbibliotheken 24,25 sein. SPPS ist auch sehr nützlich für andere poly-Kettenanordnungen wie Oligonukleotide 26,27, 28,29 Oligosaccharide und Peptidnucleinsäuren 30,31. Interessanterweise ist in einigen Fällen gezeigt wurde SPPS zur Synthese kleiner Moleküle, die traditionell in der Lösung 32,33 bestehen vorteilhaft. SPPS wird sowohl im kleinen Maßstab für Forschung und Lehre 34,35 als auch im großen Maßstab in der Industrie 36-38 verwendet.

Zwei Synthesestrategien, die hauptsächlich in SPPS Methodik für die Synthese von Peptiden verwendet werden, sind Butyloxycarbonyl (Boc) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). Die für SPPS eingeführt ursprüngliche Strategie war Boc, die stark sauren Bedingungen erfordert, um Seitenketten aus dem R-Schutzgruppen zu entfernen und spalten das PeptidEsin. Fmoc-basierte Peptidsynthese verwendet jedoch mäßige Basiszustand und ist eine mildere Alternative zu dem säurelabilen Boc-Protokoll 39. Die Fmoc-Strategie nutzt orthogonalen t-Butyl (tBu) Seitenkettenschutz, der in der letzten Stufe der Synthese entfernt wird, während Abspaltung des Peptids vom Harz unter sauren Bedingungen.

Das allgemeine Prinzip für die Peptidsynthese am festen Träger ist in Figur 1 dargestellt. Die anfängliche Aminosäure, durch eine temporäre Schutzgruppe an dem N-α-Terminus maskiert wird an das Harz von dem C-Terminus geladen. Eine semi-permanente Schutzgruppe, um die Seitenkette zu maskieren ist auch, falls erforderlich (Figur 1, Schritt 1) verwendet wird. Die Synthese des Zielpeptides aus dem C-Terminus mit dem N-Terminus durch wiederholte Zyklen von Entschützen der N-α-temporären Schutzgruppe (1, Schritt 2) und Kopplung der nächsten geschützten Aminosäure (1 gebaut ong>, Schritt 3). Nach der letzten Aminosäure wird geladen (1, Schritt 4), wird das Peptid vom Harzträger abgespalten und die semi-permanente Schutzgruppen entfernt (Abbildung 1, Schritt 5).

Abbildung 1
Figur 1. Allgemeines Schema der Festphasenpeptidsynthese. Die N-α-geschützten Aminosäure unter Verwendung der Carboxylgruppe über einen Linker an dem Harz (Schritt 1) verankert ist. Das gewünschte Peptid in einer linearen Weise vom C-Terminus zum N-Terminus durch wiederholte Zyklen von Entschützen der temporären Schutzgruppe (TPG) von dem N-α (Schritt 2) und Aminosäurekupplung (Schritt 3) zusammengesetzt. Nach der Durchführung der Synthese (Schritt 4) werden die semi-permanenten Schutzgruppen (SPG) während der Peptidspaltung (Schritt 5) entschützt.bekommen = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach Montage der kompletten Peptidkette kann Cyclisierung durch mehrere Alternativen erreicht werden: (A) Kopf-Schwanz-Cyclisierung - dies ist ein bequemer Weg, aber begrenzt, da es nur eine Option für die Cyclisierung (2A), (B) Cyclisierung bietet Verwendung der Aminosäuren aus der Sequenz von Interesse, die biologisch aktive funktionelle Gruppen enthalten - jedoch die Verwendung dieser Aminosäuren können die biologische Aktivität (2B) und (C) die Cyclisierung durch Zusatz von Aminosäuren (oder anderen Bausteinen) ohne störenden Einfluss das bioaktive Sequenz. Einführung dieser Moleküle ist weit verbreitet, da es ermöglicht die Herstellung von konzentrierten Bibliotheken ohne Änderung der Sequenz von Interesse (2C).

Figur 2
FBBILDUNG 2. Alternative Peptidcyclisierung Strategien (A) Kopf-Schwanz-Cyclisierung, durch eine Peptidbindung zwischen dem C-Terminus und N-Terminus. (B) Cyclisierung zwischen funktionellen Gruppen, wie eine Disulfidbindung zwischen Cysteinresten (1) oder einer Amidbindung zwischen den Seitenketten von Lysin Asparaginsäure / Glutaminsäure (2) oder der Seitenkette in N- oder C-Terminus (3 -4); (C) Cyclisierung durch das Hinzufügen zusätzlicher Aminosäuren oder Aminosäurederivate oder kleine Moleküle, beispielsweise vor (R0) und nach (R7) die bioaktive Sequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Mikrowellen-unterstützte Synthese nutzt Mikrowellenbestrahlung, um Reaktionen zu erwärmen, und beschleunigt so organische chemische Umwandlungen 40,41. Mikrowellenchemie basiert auf der Fähigkeit des Reagens / Lösemittel zum absorbieren basierendMikrowellenenergie und wandeln sie in Wärme um 42. Bevor die Technologie verbreitet wurde, hatte gravierende Nachteile zu überwinden, einschließlich der Steuerbarkeit und Reproduzierbarkeit der Syntheseprotokolle und der Mangel an geeigneter Systeme zur Temperatur- und Drucksteuerungen 43,44. Der erste Bericht über die mikrowellenunterstützte Peptidsynthese wurde unter Verwendung eines Küchenmikrowellen mehrere kurze Peptide zu synthetisieren (7-10 Aminosäuren) mit signifikanten Verbesserung der Kopplungseffizienz und die Reinheit 45 getan. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mikrowellenenergie Kettenaggregation zu verringern, reduzieren Nebenreaktionen, Racemisierung zu beschränken, und zur Verbesserung der Kopplungsraten, die alle entscheidend für die schwierige und lange Sequenzen von 46 bis 53 sind.

Gegenwärtig ist die Verwendung von Mikrowellenstrahlung für die Synthese von Peptiden oder verwandten Verbindungen auf einem festen Träger ist umfangreich, einschließlich (A) Synthese in Wasser anstelle des organischen Lösungsmittels 54; (B) Synthese von Peptiden mitgemeinsame posttranslationale Modifikationen wie Glycopeptide 55-58 oder 59-61 Phosphopeptide, dessen Synthese ist in der Regel schwierig, aufgrund der geringen Kopplungseffizienz von sterisch gehinderten Aminosäurederivate; (C) Synthese von Peptiden mit einer Modifikation in der Hauptkette, wie Azapeptiden, die durch den Austausch der C (α) eines Aminosäurerests mit einem Stickstoffatom 62 oder Peptoide, dessen Seitenkette ist mit der gebildet werden kann, Amidstickstoff anstelle des C & alpha Atom 63,64; (D) Synthese von cyclischen Peptiden 65-71; und (E) Synthese von kombinatorischen Bibliotheken 51,72. In zahlreichen Fällen die Autoren berichteten höheren Wirkungsgrad und geringere Synthesezeit unter Mikrowellenbestrahlung im Vergleich mit dem herkömmlichen Protokoll.

Mit Hilfe eines rationalen Design 73-75, Anti-Parasiten-Peptide, die vom Gerüst L eishmania des Rezeptors fo abgeleitet wurden, entwickelten wirr aktiviert C-Kinase (LACK). LACK spielt eine wichtige Rolle in der frühen Phase der Infektion mit Leishmanien 76. Parasiten ausdrücken unteren Ebenen der LACK nicht einmal, auch immungeschwächten Mäusen parasitieren 77 als LACK ist in wesentlichen Parasiten Signalprozessen und Proteinsynthese 78 beteiligt. Daher ist LACK ein Schlüsselgerüstprotein 79 und ein wertvolles Medikament Ziel. Sich auf Sequenzen in LACK, die in den Parasiten konserviert sind, aber nicht in der Wirts Säugerhomolog RACK, identifizierten wir eine 8-Aminosäuren-Peptid (RNGQCQRK), welche Leishmania sp. Lebensfähigkeit in Kultur verringert.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von cyclischem Gerüst Peptide aus dem oben beschriebenen LACK Proteinsequenz abgeleitet. Die Peptide wurden auf einem festen Träger unter Verwendung von Mikrowellenheizung durch SPPS Methodik mit Fmoc / tBu-Protokolls synthetisiert. Peptide wurden in einen TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) Trägerpeptid über eine Amidbindung als konjugiertesTeil der SPPS. TAT-basierten Transport einer Vielzahl von Ladungen in die Zellen ist seit über 15 Jahren verwendet, und die Lieferung der Ladung in subzellulären Organellen wurde bestätigt, 80. Vier verschiedenen Linkern, Bernstein- und Glutarsäureanhydrid sowie Adipin- und Pimelinsäure, wurden verwendet, um die Cyclisierung durchzuführen, um Carbonsäure-Linker von zwei bis fünf Kohlenstoffatomen zu erzeugen. Zyklisierung wurde unter Verwendung von Mikrowellenenergie durchgeführt, und die abschließende Abspaltung und Seitenketten-Gruppenoperationen manuell ohne Mikrowellenenergie erfolgt. Die Verwendung eines automatischen Mikrowellen-Synthesizer verbessert die Produktreinheit, erhöht die Produktausbeute und verringert die Dauer der Synthese. Dieses allgemeine Protokoll kann zu anderen Studien, die Peptide zu verwenden, um wichtige molekulare Mechanismus in vitro und in vivo zu verstehen und weiterzuentwickeln potentielle Arzneimittel für menschliche Krankheiten verwendet werden.

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Protocol

1. Geräte und Reagenzien Vorbereitung

  1. Vorbereiten der Geräte
    1. Führen Sie alle Schritte innerhalb einer Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
    2. Chemisch synthetisieren Peptide auf einem festen Träger unter Verwendung einer Mikrowelle Peptide Synthesizer mit einem zusätzlichen Modul Discover mit einem faseroptischen Temperaturfühler ausgestattet zur Steuerung der Mikrowellenleistungsabgabe in einem Teflon-Reaktionsgefäß (30 ml, mit einer Glasfritte) oder in einem Einweg-Polypropylen Patrone (12 ml, mit einer groben Fritte).
    3. Für die richtige Mischung, schließen Stickstoffzufuhr in den Reaktionsbehälter oder alternativ zu versiegeln die beiden Enden des Polypropylen-Kassette, und legen Sie auf einem Rotationsschüttler.
    4. Um Reaktionsgemische oder Waschungen Drain, an den Hausvakuum zu verbinden über ein Siphon.
    5. Platzieren der faseroptischen Sonde in das Reaktionsgefäß.
  2. Vorbereiten Reagenzien
    1. Bereiten Sie das Harz durch Wiegen Rink-Amid AM Harz 100-200 mesh (0,204 mg), 5 ml 1: 1-Mischung von N, N-Dimethylformamid (DMF) / Dichlormethan (DCM) in das Reaktionsgefäß / Polypropylen-Patrone, um das Harz nach unten zu waschen, schütteln Sie für 2-4 Stunden, um richtig anschwellen, und abtropfen lassen.
    2. Vorbereitung 0,2 M 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) amino-Säure-Lösungen durch Auflösen der entsprechenden Fmoc-Aminosäure in DMF und Vortex der Mischung, bis die Aminosäuren, gelöst (Tabelle 1).
    3. Vorzubereiten 0,45 M Aktivatorlösung Mischung durch Lösen von 18.96 g O - (Benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) in 100 ml DMF und Verwirbeln der Mischung, bis der Feststoff gelöst ist (Tabelle 1).
    4. Vorzubereiten 2 M Aktivator Basenlösung Gemisch durch Kombinieren 34,8 ml N, N-Diisopropylethylamin (DIEA) mit 65.2 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP) (Tabelle 1).
    5. Vorbereitung 0,1 M Lösung Entschützung Mischung durch Lösen von 3,37 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)in 250 ml einer 20% v / v Lösung von Piperidin in DMF und Verwirbeln der Mischung, bis der Feststoff gelöst ist (Tabelle 1).

2. Fmoc-geschützten Aminosäure Kupplung

  1. Aminosäure-Kopplung
    1. In Aminosäure (2,5 ml) / Aktivator (1 ml) / Aktivator-Basis (0,5 ml) zum Reaktionsgefäß / Polypropylen-Kassette und ließ die Reaktion ablaufen zu 300 Sekunden (25 W, 75 ° C, Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
    2. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, RT) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
  2. Fmoc-Abspaltung
    1. 7 ml 20% Piperidin in DMF mit 0,1 M HOBt Reaktionsgefß / Polypropylen-Patrone und Inkubation für 30 sec (45 W, 75 ° C, Tabelle 2).
    2. Lassen Sie das Reaktionsgemisch.
    3. In 7 ml 20% Piperidin in DMF mit 0,1 M HOBt, um Reaktionsgefäß / Polypropylen-Kassette und Inkubation für 180 Sekunden (45 W75 ° C, Tabelle 2).
    4. Lassen Sie das Reaktionsgemisch.
    5. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
      Hinweis: Optional können Sie hier den Vorgang unterbrechen und wieder zu einem späteren Zeitpunkt.
  3. Nach Aminosäure Kopplungsschritt das Harz mit DCM und Speicher für mindestens mehrere Tage bei 4 ° C (für eine längere Zeitspeicher des Harzes bei - 20 ° C).
    1. Bewegen des Harzes aus dem Reaktionsgefäß auf eine Polypropylenkartusche.
    2. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    3. Verschließen Sie den Polypropylenkartusche fest mit einem oberen Deckel und Hahn.
    4. Vor dem Start einer neuen Synthese, schwellen des Harzes für 3-4 h in DMF (7 ml).
  4. Überwachung der Synthese
    1. Verwenden Sie den Kaiser (Ninhydrin-Test) oder Chloranil-Test, um den Fortschritt der schnell festzustellen,Synthese. Optional führen eine kleine Spaltreaktion, um die Reinheit und die Masse der synthetisierten Peptids zu bestimmen. Siehe Abschnitt 9.
      Hinweis: Weitere Hinweise zur Fehlerbehebung finden Sie in Tabelle 3.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2, wie gewünscht, um gezielte Peptid zu synthetisieren: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Anhydrid / Säure-Kopplung

  1. Anhydrid-Kopplung
    1. Das Harz mit NMP. In NMP zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    2. Auflösen 10 Äquivalenten des entsprechenden Anhydrids in NMP (5 ml) wird mit 1 Äquivalent 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 10 Äquivalenten DIEA in die Lösung (Tabelle 1).
    3. Fügen Sie einen 10: 1: 10-Gemisch von Anhydrid / DMAP / DIEA zum Harz und Inkubation für 300 Sekunden (25W, 75 ° C, Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
    4. Das Harz mit NMP. In NMP zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
  2. Säurekupplungs
    1. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
    2. Auflösen 10 Äquivalenten der entsprechenden Dicarbonsäure in DMF (5 ml). 1 Äquivalent DMAP und 10 Äquivalente N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) zu der Lösung (Tabelle 1).
    3. Pre-Aktivierung der Mischung durch Mischen für 30 min.
    4. Fügen Sie die Mischung auf dem Harz und Inkubation für 300 Sekunden (25 W, 75 ° C, Tabelle 2) und lassen Sie das Lösung.
    5. Waschen des Harzes mit DMF. In DMF zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und Drain-Lösung. Wiederholen Sie Schritt dreimal.

4. N-Methyltrityl (MTT) Schutzgruppe entschützenIon

Hinweis: Der Lysin-Seitenkette mit N-Methyltrityl (Mtt) 81, eine Schutzgruppe, die selektiv unter sauren Bedingungen labil 82,83 entschützt werden können, geschützt. Entschützen Mtt Schutzgruppe manuell auf einem Schüttler ohne Mikrowellenenergie.

  1. Übertragen Sie das Harz auf eine Polypropylen-Kassette mit Deckel Stecker und Hahn ausgestattet.
  2. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.
  3. Hinzufügen 15-25 ml einer Mischung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA), 5% Triisopropylsilan (TIS) und 94% DCM in der Polypropylenkartusche pro Gramm Harz.
    Anmerkung: TFA ist eine starke Säure und korrosiven und ist äußerst reizend für die Haut, Augen und Lungengewebe.
    1. Halten konzentrierten Lösungen von TFA in der Haube zu allen Zeiten.
    2. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe) und die Arbeit in einem gut belüfteten Haube. Handschuhe wechseln promptwenn sie in Kontakt mit TFA und unmittelbar Rein Verschüttetes. Wenn Haut oder Augen in Kontakt mit der Säure die betroffenen Stellen sofort mit Wasser und waschen Sie für weitere 15 Minuten.
  4. Setzen Sie den Polypropylenkartusche auf einem Schüttler und schütteln für 5 min bei RT.
  5. Abfluss der Lösung aus dem Polypropylenkartusche durch Anlegen von Vakuum.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5, dreimal.
  7. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.

5. Die Cyclisierung des linearen Peptids

  1. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie fünfmal.
  2. In einem 50 ml-Polypropylenröhrchen, aufzulösen 5 Äquivalenten Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) in Dibrommethan (DBM, 5 ml) und füge 10 Äquivalenten DIEA in die Lösung (Tabelle 1).
  3. Tabelle 2). Entleeren Sie die Lösung.
  4. Das Harz mit DCM. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie dreimal.

6. Abspaltung und Entschützung der Seitenkettengruppen

  1. Mit DCM und Diethylether Waschen des Harzes.
    1. Fügen Sie DCM zum Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, rt) und lassen Sie das Lösung. Wiederholen Sie zweimal.
    2. Zugabe von Diethylether zu dem Harz für 120 sec (7 ml, 0 W, RT) und Drain die Lösung. Wiederholen Sie zweimal.
  2. Trocknen des Harzes im Vakuumtrockenschrank bei RT für mindestens 3 h über Kaliumhydroxid (KOH, 1-10 g).
  3. Wiegen Sie das getrocknete Harz und überträgt es auf einem Polypropylen-Patrone.
  4. 10 ml einer vorgekühlten Trifluoressigsäure (TFA) Spaltungscocktails (zB 90% TFA, 2,5% Wasser, 2,5% TIS und 5% Phenol) zu jedem Gramm Harz.
  5. Schütteln 3 hbei RT.
  6. Sammeln des TFA Spaltungslösung durch Filtrieren des Harzes in einem 50 ml Polypropylenröhrchen. Für die Filtration, verwenden Sie die Fritte, die in der 12 ml-Polypropylen-Kassette.
  7. Mit kaltem Diethylether (35 ml) zu dem Rohr.
  8. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1.207 × g bei 4 ° C.
  9. Dekantiert man die Ether-Schicht.
  10. Wiederholen Sie Schritt 6,7 bis 6,9, fünf Mal.

7. Trocknen der Backbone zyklische Peptid

  1. Halten Sie das ausgefällte Peptid in derselben Röhre und trocknen Sie sie in einer Haube für 30 min.
  2. Auflösen des Peptids in einem 1: 1 Gemisch aus Wasser und Acetonitril (ACN).
  3. Frieren Sie das Endprodukt-Lösung in flüssigem Stickstoff.
  4. Lyophilisieren Endprodukts.

8. Charakterisierung der Backbone zyklische Peptid

  1. Aufzulösen eine kleine Probe (1 mg) des Produkts in Wasser (400 ul).
  2. Spritzen Sie die gelöste Peptid (10-200 ul) auf eine Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-chromatography (RP-HPLC-System), um die Reinheit des Peptids 34 zu testen.
  3. Überprüfen Sie die Masse des Peptids unter Verwendung von Massenspektrometrie matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation (MALDI-MS) 84.
    1. Mix 1 & mgr; l (100 & mgr; M) -Peptid in einer 1: 1 (v / v) Gemisches aus Acetonitril: Wasser mit 1 & mgr; l Matrix (5 mg / ml, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) in einem 1: 1 (v / v) Mischung aus Acetonitril: Wasser mit TFA (0,1%).
    2. Spot 1 & mgr; l auf der MS-MALDI-Platte.
    3. Trocknen Sie die Probe und legen Sie sie in das Massenspektrometer.
  4. Wiegen Sie das Peptid und berechnen Sie die prozentuale Ausbeute.
  5. Lagerung bei -20 ° C.

9. Überwachung der Synthese

  1. Kaiser (Ninhydrin-Test) 85
    1. Bereiten Sie die Reagenzienlösungen.
      1. Vorbereitung der Lösung A durch Auflösen von 16,5 mg Kaliumcyanid (KCN) in 25 ml destilliertem Wasser. Verdünnen von 1 ml der obigen Lösung und mit 49 ml Pyridin.
      2. Bereiten Lösung Bdurch Auflösen von 1 g Ninhydrin in 20 ml Ethanol.
      3. Vorbereitung der Lösung C durch Lösen von 40 g Phenol in 20 ml Ethanol gelöst.
    2. Verwenden Sie die Kaiser-Test, um die Fertigstellung der Aminosäurekupplung oder die Abspaltung der Schutzgruppe zu überprüfen.
      1. Bringen Sie ein paar Perlen aus dem Harz in ein Reagenzglas.
      2. In drei Tropfen (~ 100 & mgr; l) jeder Lösung (A, B und C) und mischen.
      3. Erhitzen das Reagenzglas auf einem Heizblock bei 110 ° C für 5 min.
        Hinweis: Blau farbigen Perlen (positives Ergebnis) zeigen unvollständige Kopplungsreaktion oder Entschützung der Fmoc-Schutzgruppe.
  2. Chloranil-Test 86
    1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien frisch für jeden Test.
      1. Bereiten Sie eine Lösung von 2% Chloranil in DMF-Lösung A.
      2. Es wird eine Lösung von 2% Acetaldehyd in DMF Lösung B.
    2. Führen Sie die Chloranil-Test, um die Fertigstellung der Aminosäurekupplung oder t zu überprüfener Abspaltung der Schutzgruppe.
      1. Mischungs 100 ul Lösung A mit 100 ul der Lösung B in einem 1,5-ml-Röhrchen.
      2. Lassen Sie die Perlen in und schütteln für 5 min.
        Hinweis: Dunkelbraun farbigen Perlen (positives Ergebnis) zeigen Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe oder eine unvollständige Kupplung.
  3. Kleinen Maßstab Spaltungsreaktion
    1. Entfernen Sie eine kleine Menge des Harzes auf eine 3 ml-Polypropylen-Kassette mit Deckel Stecker und Hahn ausgestattet.
    2. Behandlung mit einer 2 ml-Gemisch von 95% TFA, 2,5% Wasser und 2,5% TIS.
    3. Schüttelt das Gemisch 30 min bei RT.
    4. Entfernen des Harzes durch Filtration mit der Fritte des Polypropylenkartusche und die Lösungsmittel werden verdampft durch einen Strom von Stickstoff.
    5. Der Rückstand wird in Wasser und Analyse des Produkts mittels HPLC und / oder MS.

10. Leishmania donovani-Promastigoten Lebensfähigkeit in Kultur Assay

    <li> Leishmania donovani (L. donovani) Wachstum und Behandlungsbedingungen
    1. Kultur L. donovani-Promastigoten in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l Glucose, L-Glutamin und Natriumpyruvat bei 26 ° C.
    2. Behandeln Sie die L. donovani-Promastigoten mit cyclischen Peptiden (100 & mgr; M) für 24 Stunden bei 26 ° C.
  1. Leishmania donovani (L. donovani) Lebensfähigkeitstest
    1. Beurteilen Parasiten Lebensfähigkeit mit 20 ul alamarBlue nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Bestimmen alamarBlue Reduktion durch Messung der Fluoreszenz (bei 570 nm Anregung und 590 nm Emission). Höhere Fluoreszenz-Werte zeigen höhere Stoffwechselaktivität und erhöhte Parasitenlebensfähigkeit.

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Representative Results

Hier beschreiben wir die Entwicklung einer fokussierten kleine Bibliothek von Backbone zyklische Peptide, die speziell auf lebenswichtige PPIs des Leishmania Parasiten und fungieren als Antiparasitika (für einen Überblick über Peptide, die PPI als Antiparasitika 87 Ziel). Durch die Synthese neuartiger Rückgrat zyklischen Peptide sind Pharmakophore in einem Gerüst von ausfahrbaren Größe konserviert. Die Stärke der fokussierten Bibliothek hier vorgeschlagen wird, ist die Fähigkeit, Peptidgerüst Größen variieren und ermöglicht einen eingeschränkten Grad der Konformationsfreiheit durch Cyclisierung. Die gesamte Synthese der Backbone zyklischen Peptide wurde unter Verwendung eines automatisierten Mikrowellen-Synthesizer auf einem festen Träger durchgeführt, nach der Fmoc / tBu-Protokoll. Cyclisierung wurde durch die Schaffung einer Amidbindung zwischen dem Linker Anhydrid / Säure und der Seitenketten-Amin von Lysin durchgeführt wird. Die endgültige Spaltung und Seitenketten-Schutzgruppenentfernung wurden von Hand ohne Mikrowellenenergie durchgeführt (für Syntheseschema und final Produkte Struktur siehe Abbildung 3). Das Produkt wurde durch präparative HPLC analysiert, um 25 mg weißes Pulver bei -20 ° C gelagert zu ergeben. Eine Probe des Produkts wurde mittels MS (Figur 4) überprüft, und der Grad der Reinheit wurde mittels analytischer HPLC (Figur 5) bestimmt. Eine Probe von jedem zyklischen Peptids wurde für biologische Screening gesendet. Einer der vier zyklischen Peptide (PL1) gegen Leishmania donovani (L. donovani), einen Parasiten verursacht viszeraler Leishmaniose, die schwerste Leishmaniase in Menschen aktiv. Peptid pL1 reduziert Parasiten Lebensfähigkeit um 75%, verglichen mit der Kontrollbehandlung (Tabelle 4).

Figur 3
Abbildung 3. Synthese-Schema und Struktur des Rückgrats zyklisches Peptid in dieser Studie synthetisiert Reagentien und Bedingungen:. (I) Aminosäurekupplung: 300 sec, 25 W, 75 ° C,mit 1,1: 1: 2,2 Aminosäure / Aktivator / Aktivator-Basis. (ii) Fmoc-Entschützung: 30 sec und 180 sec sowohl bei 45 W, 75 ° C, unter Verwendung von 20% Piperidin in DMF + 0,1 M HOBt. (iii) Anhydrid-Kopplung: 300 sec, 25 W, 75 ° C, unter Verwendung von 10: 10: 1 Anhydrid / DIEA / DMAP in NMP. (iv) Entschützen Mtt: 3 * (300 sec, 0 W, RT) unter Verwendung von 1: 5: 94 TFA / TIS / DCM. (v) Cyclisierung: 300 sec, 25 W, 75 ° C, unter Verwendung von 5.10 PyBOP / DIEA in dBm. (vi) Spaltung und Entschützung: 3 h, 0 W, RT, unter Verwendung von 90: 2,5: 2,5: 5 TFA / TIS / H 2 O / Phenol. Die Peptide wurden auf eine TAT 47-57 (Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) Trägerpeptid durch eine Amidbindung als Teil des Festphasensynthese konjugiert. Bitte klicken Sie hier, um vergrößern Version dieser Figur.

Figur 4
Abbildung 4. MALDI-TOF Massenspektroskopie SpurVertreter Rückgrat zyklisches Peptid. Die beobachtete Masse 2853.456 ist in guter Übereinstimmung mit dem berechneten Masse, 2854,271. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Figur 5. Analytische Umkehrphasen-HPLC-Spur repräsentativ Rückgrat zyklischen Peptids. Die analytischen HPLC Spuren der rohen (A) und gereinigt (B) mit cyclischem Gerüst Peptid gezeigt. Die verwendeten Lösungsmittelsysteme waren (H 2 O mit 0,1% TFA) und B (CH 3 CN mit 0,1% TFA). Ein linearer Gradient von 5-50% B bei 1 ml / min in 15 Minuten bei 40 ° C mit einer C18, 5 & mgr; m, wurden 150 mm-Säule aufgebracht, und die Detektion erfolgte bei 215 nm. Hier klickenum eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Lösung Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volumen (ml) Konzentration (M) Gesamtanzahl
- Aminosäurelösung - Alanin-Aminosäure 311,34 0,2 6,23 g
0,2 M Aminosäure in DMF DMF 100 100 ml
Ein Beispiel für eine Aminosäure Alanin, aber die gleiche Berechnung sollte für jede Aminosäure durchgeführt werden, mit dem entsprechenden MW. So bereiten Sie eine 100 ml Aminosäurelösung lösen sich 6,23 g der Aminosäure Alanin in 100 ml DMF. Lagerung bei 4 ° C.
- Die Schutzaufhebung Lösung- HOBt 135,1 0.1 3,37 g
20% v / v Lösung von Piperidin in DMF mit 0,1 M HOBt Piperidin 50 50 ml
DMF 200 200 ml
Entschützen zur Entfernung der Fmoc-N α verwendet - Schutzgruppe. So bereiten Sie eine 250 ml Entschützung Lösung aufzulösen 3,37 g HOBt in 200 ml DMF und 50 ml Piperidin. Lagerung bei 4 ° C.
- Aktivator-Lösung - HBTU 379,24 0,45 18.96 g
0,45 M HBTU in DMF DMF 100 100 ml
Aktivatormit dem Aktivator Basis verwendet, um die Aminosäure vor der Kopplungsreaktion zu aktivieren. So bereiten Sie eine 100 ml Aktivator Lösung aufzulösen 18,96 g HBTU in 100 ml DMF. Lagerung bei 4 ° C.
- Activator Basislösung - DIEA 129,24 0,742 2 34.80 ml
2 M DIEA in NMP NMP 65.20 ml
Aktivator Basis mit dem Aktivator verwendet, um die Aminosäure vor der Kopplungsreaktion zu aktivieren. In einen 100 ml Aktivator Basislösung Mix vorzubereiten 34,8 ml DIEA und 65,2 ml NMP. Lagerung bei 4 ° C.
Lösung Reagens MW (g / mol) d (g / ml) Volumen (ml) Gl Gesamtanzahl
Anhydrid-Lösung - 10: 1: 10 Anhydrid / DMAP / DIEA in NMP Glutarsäure / Bernsteinsäureanhydrid 114,1 / 100,07 10 0,11 / 0,10 g
DMAP 122,2 1 0,01 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
NMP 5 5 ml
Aufzulösen 0,11 / 0,10 g Glutarsäure / Bernsteinsäureanhydrid in 5 ml NMP, fügen 0,01 g DMAP und 0,09 ml DIEA zur Lösung. Eine frische Lösung.
Säurelösung - 10: 1: 10-Säure / DMAP / DIC in DMF Adipinsäure / Pimelinsäure 146,14 / 160,17 10 0,15 / 0,16 g
DMAP </ td> 122,2 1 0,01 g
DIC 126,2 0,806 10 0,16 ml
DMF 5 5 ml
Man löst 0,15 / 0,16 g Adipinsäure / Pimelinsäure in 5 ml DMF, fügen 0,01 g DMAP und 0,16 ml DIC zur Lösung. Eine frische Lösung.
Cyclisierung Lösung - 05.10 PyBOP / DIEA in DBM PyBOP 520,3 5 0,26 g
DIEA 129,24 0,742 10 0,09 ml
DBM 5 ml 5 ml
Aufzulösen 0,26 g PyBOP in 5 ml DBM und füge 0,09 ml DIEA zur Lösung. Bereiten Sie einfrische Lösung.

Tabelle 1. Reagenzien und Lösungen für das Rückgrat cyclischen Peptidsynthese. Liste der Lösungen und Reagenzien, die für die Synthese zur Verfügung.

Mikrowelle Zyklus Leistung (W) Temp (° C) Zeit (s)
1 Kupplung Aminosäuren 25 75 300
2 Entschützung der Fmoc-Schutzgruppe (a) Anfangs Entschützung 45 75 30
(b) die komplette Entfernung der Schutzgruppe 45 75 180


Tabelle 2. Mikrowelle Zyklen zum Kuppeln und Entfernen der Schutzgruppe. Mikrowelle ZyklenAminosäure-Kopplung und Fmoc-Schutzgruppenabspaltung. (1) Kupplung von Aminosäuren. (A) ersten und (b) vollständige Entfernung der Schutzgruppen: (2) Die Abspaltung der Fmoc Maskierungsgruppe wird in zwei Schritten durchgeführt.

Problem Mögliche Ursache Lösung
Kaiser oder Chloranil Tests positiv sind nach Aminosäure Kupplungs Die Aminosäurekupplungs unvollständig Wiederholen Sie den Kupplungsschritt
Peptide nicht effizient aus dem Überstand abgetrennt Überschüssige Menge an TFA Verdampfen der Probe unter Verwendung eines Stickstoffstroms
Vorhandensein Deletionssequenzen im Produkt Fmoc-Entfernung ist unvollständig Überwachen Sie die Entfernung der Schutzgruppe von Kaiser oder Chloranil Tests und / oder kleinen Maßstab Spaltung, falls der Fmoc-Entfernung ist unvollständig Wiederholung der Schritt
Aminosäure coupling ist unvollständig Überwachen Sie die Kopplung von Kaiser oder Chloranil Tests und / oder kleinen Maßstab Spaltung, falls die Aminosäure Kopplung unvollständig wiederholen Sie den Schritt und / oder verwenden längere Reaktionszeit

Tabelle 3. Fehlersuche Ratschläge Liste der Lösungen für die häufigsten synthetische Herausforderungen ist.

Peptid Sequenz n FR. Cal. MS Obs. HPLC Ausbeute Parasite Lebensfähigkeit
pL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98% 86% 25%
pL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98% 87% 100%
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96% 89% 97%
pL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97% 85% 98%

Tabelle 4. Charakterisierung und Bioaktivität der Peptide in dieser Studie. N bezieht sich auf die Anzahl der Methylengruppen in der Alkyl-Spacer (siehe 3 für die Struktur). MS wurde unter Verwendung von MALDI-Technik durchgeführt, und die Reinheit wurde durch analytische HPLC bestimmt. Peptide wurden an Leishmania donovani-Promastigoten zugegeben und die Lebensfähigkeit des Parasiten wurde bewertet und als Prozent Überleben relativ zu Kulturen in Abwesenheit des Peptids inkubiert Kontrolle ausgedrückt. Nur pL1 hatte hohe Leishmanicidal Aktivität. Der Beobachterwurde den Versuchsbedingungen geblendet. Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

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Discussion

Die Synthese einer fokussierten Bibliothek Rückgrat aus dem Mangel Protein der Leishmania-Parasiten mit einem vollständig automatisierten Mikrowellen-Synthesizer abgeleitet cyclische Peptide beschrieben. Ein fokussierter Bibliothek zyklischer Peptide wurde mit konservierten Pharmakophore und verschiedene Linker entwickelt. Zugabe verschiedener Linker wie Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Adipinsäure, Pimelinsäure, Lysin, Ornithin und andere Bausteine ​​verwendet werden, um die Vielfalt einer der Konformationen der zyklischen Peptide zu erhöhen. Die Synthese eines fokussierten Bibliothek zyklischer Peptide können Forscher die optimale Konformationsraum screenen. Da die Konformation des cyclischen Peptiden hängt von Parametern wie der Ringgröße und der Position variiert, können diverse Analoga mit unterschiedlichen Konformationen erzeugt werden, was nützlich in biologischen Struktur-Aktivitäts-Beziehung sein können, untersucht 88.

Ein Hauptproblem in SPPS wird die Diagnose des synthetic Fortschritt und Problemlösung, da keine Zwischenprodukte werden isoliert. Daher können mehrere kolorimetrische Tests verwendet, um die Reaktion, wie jene, die freien Amine Identifizierung von Kaiser und Chloranil-Tests zu überwachen. Wenn die Kaiser oder Chloranil Tests sind kein Hinweis (zB Prolin und Hydroxy-Prolin nicht mit Ninhydrin auf die gleiche Weise reagieren, wie die anderen Aminosäuren, weil ihre Alpha-Amino-Gruppe ist Teil eines fünfgliedrigen Ring), einem kleinen Spaltungsreaktion und Massenspektrometrie-Analyse angewendet werden kann, um die Synthese Fortschritt zu überwachen.

Spaltungszeit und die Spaltungscocktail kann auf der Grundlage der chemischen Eigenschaften und der Anzahl der verwendeten Schutzgruppen modifiziert werden. Es wird empfohlen, dass eine anfängliche Studie Spaltung unter Verwendung einer kleinen Menge des Harzes (1-10 mg) durchgeführt, um die richtigen Bedingungen zu überprüfen. King et al. Haben getestet verschiedenen Spaltungscocktails für verschiedene Peptide und deren detaillierte Richtlinien können verwendet werden, um reactio optimierenn Bedingungen 89. Für Backbone zyklischen Peptide, wird die Inkubation für mindestens 3 h als Default für vollständige Spaltung empfohlen. Jedoch Peptide, die eine hohe Anzahl von Schutzgruppen oder schwer Schutzgruppen (zB t-butylester oder Pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl) sollte für eine längere Zeit, um eine vollständige Schutzgruppenabspaltung zu gewährleisten inkubiert werden. Hier haben wir nicht systematisch die optimale Spaltzeit oder Cocktail sucht. Gleichwohl haben wir festgestellt, daß eine kurze Spaltzeit (weniger als 2 h) zu einer unvollständigen Spaltung einiger Schutzgruppen.

Die Standard-Mikrowellenpeptidsynthese-Protokoll ist ein allgemein anwendbares Verfahren zur Synthese einer Vielzahl von Peptiden. In den meisten Fällen ist die Verwendung einer automatischen Mikrowellen-Synthesizer reduziert die Synthesedauer und erhöht die Ausbeute und Reinheit der Produkte. Darüber hinaus verringert sie Nebenreaktionen wie Racemisierung Aspartimid Bildung. Obwohl wir nicht getan haben,eine Seite-an-Seite-Vergleich von Mikrowellen- und konventionellen Synthese in dieser Studie basiert auf unserer Erfahrung und anderen Labors "wurde gezeigt, dass die Verwendung von Mikrowellen-unterstützte Synthese überlegen ist dem herkömmlichen Protokoll 61,70. Fast alle Aktivatoren und Harze können effektiv in Mikrowellen SPPS verwendet werden, und das allgemeine Verfahren kann auch auf die Synthese einer Vielzahl von modifizierten Peptiden, wie Glycopeptiden Phosphopeptiden Azapeptiden, Peptoide und cyclische Peptide 90 aufgebracht werden.

Cyclisierung ist ein bequemer Weg, um die Potenz und die Stabilität der linearen Vorstufen verbessern. Zyklische Peptide können eine wünschenswerte eingeschränkten Konformation, die dazu beitragen können, um die Bindungsaffinität und Selektivität erhöht zu erhalten. Weiterhin können lineare Peptide modifiziert werden, um mehrere cyclische Schleifen enthalten, wodurch sie möglicherweise Ziel mehr endogenen Proteinbindungsgrenzflächen 91. Jedoch ist es wichtig zu beachten, dass die Cyclisierung nicht necessarily zu Verbesserungen in allen oder manchmal eine dieser Eigenschaften führen. Bestimmte zyklische Peptide können in Konformationen, die nicht durch gezielte Rezeptoren erkannt werden zur Folge haben (zB 92,93) Folglich ist eine fokussierte Bibliothek zyklischer Peptide notwendig, um Bildschirm für die Bioaktivität. Abschließend synthetischen cyclischen Peptiden wünschenswerte pharmakologische Eigenschaften, sind klein genug, um die Zellmembran zu passieren, und groß genug, um eine hohe Selektivität haben. Hohe Wirksamkeit, Spezifität und sicheren Profil tragen zum Versprechen zyklischer Peptide "als Wirkstoffkandidaten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang und Daria Mochly-Rosen für hilfreiche Diskussionen. Die Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) unterstützt, um NQ Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Erstellung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

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