Mesures de sécurité et procédures d'exploitation dans un (A) de laboratoire BSL-4: 2. Pratiques générales

Immunology and Infection

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Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

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Abstract

Travailler dans un niveau de biosécurité 4 (BSL-4) laboratoire de confinement exige du temps et une grande attention aux détails. Le même travail qui est fait dans un laboratoire BSL-2 avec des agents pathogènes non-haute conséquence prendra beaucoup plus de temps dans un cadre BSL-4. Cette exigence de temps accrue est due à une multitude de facteurs qui visent à protéger le chercheur d'infections acquises au laboratoire, l'environnement de travail de la contamination potentielle et la communauté locale du possible la libération d'agents pathogènes à haut conséquence. A l'intérieur du laboratoire, le mouvement est restreint en raison de tuyaux d'air attachés aux combinaisons obligatoires de sécurité pour le corps. En outre, la désinfection de chaque élément qui est retiré des armoires de classe II de biosécurité (de GCS) est nécessaire. spécialistes de laboratoire doivent être formés dans les pratiques du laboratoire BSL-4 et doivent montrer haute compétence dans les compétences qu'ils exécutent. L'objectif de cet article est de décrire les procédures et les techniques pour assurer laboratoire b appropriéesiosafety et une précision expérimentale en utilisant un dosage de plaque virale classique comme un exemple de procédure. En particulier, les techniques appropriées pour travailler en toute sécurité dans un environnement BSL-4 lors de l'exécution d'une expérience sera soulignée visuellement. Ces techniques comprennent: la mise en place d'un BSC Classe II pour des expériences, nettoyage propre de la BSC Classe II lorsque vous avez terminé de travail, gestion des déchets et d'élimination sûre des déchets générée à l'intérieur d'un laboratoire de BSL-4, et le prélèvement d'échantillons inactivés à l'intérieur d'un BSL- 4 laboratoire au laboratoire BSL-2.

Introduction

Comme la sécurité du personnel de laboratoire manipulant des agents pathogènes à haut risque (existe pas prophylaxies d'infection, ni les options de traitement) est primordiale, le US Department of Health and Human Services a mis en place des lignes directrices pour la construction des installations et des meilleures pratiques pour la conduite en toute sécurité de travail avec les agents pathogènes dans biomédicale et les laboratoires cliniques d'une biosécurité perspective 1. Grâce à la législation et la réglementation, la plupart des pratiques et procédures sont devenues des exigences obligatoires qui doivent être suivies pour le travail avec ces agents pathogènes. Aux Etats-Unis, les agents pathogènes qui sont facilement transmis de personne à personne, conduire à des taux de létalité élevés, et / ou ont le potentiel d'impact en matière de santé publique et le bioterrorisme, sont classés comme l'Institut national de la santé / Institut national des allergies et infectieuses maladie (NIH / NIAID) priorité A pathogènes et ou Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism Catégorie A Agents 2. En outre, hpathogènes aute-conséquences sont classés comme Tier 1 Sélectionnez Agents si ces agents pathogènes sont des agents potentiels de bioterrorisme, ont un potentiel de pertes massives ou des effets dévastateurs sur l'économie, les infrastructures essentielles, ou la confiance du public 3.

BSL-4 opérations, y compris l'accès aux instituts avec BSL-4 laboratoires, sont plus fortement contrôlés que 2-BSL / 3 opérations. Par exemple, il est beaucoup plus difficile d'avoir accès à un laboratoire BSL-4 par rapport à un laboratoire BSL-2 ou BSL-3 en raison des exigences importantes de formation de costume, les exigences de mentorat étendues, et les conditions préalables à la biosécurité médicale supplémentaires. En outre, il existe généralement des barrières de sécurité plus physiques dans une installation par rapport à une installation BSL-2 ou BSL-4-6 mars BSL-4. Comme indiqué dans notre premier article sur les procédures BSL-4 entrée et de sortie, le personnel de laboratoire subissent une formation approfondie et une évaluation psychologique de se qualifier pour l' entrée dans le BSL-4 laboratoire 7. Wans le laboratoire BSL-4, le risque d'infection et les erreurs sont évitées ou atténuées en suivant les procédures établies. La recherche doit procéder soigneusement et délibérément, avec le multitâche ou distractions minimes. Penchée sur en maillot de pression positive est difficile, et l'écran facial peut limiter les procédures telles que la microscopie. des gants encombrants entravent l'exécution des tâches motrices fines, telles que la manipulation de petits objets ou l'étiquetage des tubes. Pour réduire au minimum le temps passé dans BSL-4 laboratoires, spécialistes de laboratoire devraient examiner les procédures de travail pour identifier les mesures qui peuvent être faites en avance dans un laboratoire BSL-2 et ensuite transporter ces matériaux dans le laboratoire BSL-4 pour l'achèvement de la tâche (s). Lors du retrait de matériaux pour un traitement ultérieur dans BSL-2 laboratoire, les matériaux sont fixés et retirés du laboratoire BSL-4 dans un récipient secondaire étanche. Des exemples d'échantillons qui pourraient devoir être supprimés incluent: des plaques ou des tubes de matériel infecté fixes qui seront analysés par immunosorbe lié à une enzymetest nt (ELISA), immunofluorescence (IFA), ou réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Outre l'élargissement des limitations physiques imposées par l'équipement de protection individuelle requis dans BSL-4 laboratoires par rapport à ceux de BSL-2 laboratoires, les procédures d'inactivation des agents pathogènes à haut conséquence dans des plaques de culture cellulaire et l'élimination des déchets sont plus strictes que celles qui sont nécessaires pour les virus moins pathogènes étudié dans un laboratoire BSL-2. Au minimum, ces méthodes doivent répondre à l'exigence CDC. Par exemple, la contamination des plaques de culture cellulaire et d'autres matières peuvent être inactivées par des réactifs chimiques, tels que la formaline neutre tamponnée. des plaques ou des tubes de culture de cellules traitées doivent être placés dans des sachets thermosoudables contenant du formol et retiré du laboratoire par l'intermédiaire d'une cuve d'immersion rempli d'un liquide désinfectant. seaux à déchets remplis de solutions désinfectantes et pulvérisation désinfectants sont utilisés pour recevoir temporairement les déchets générés lors de l'expérience et pour Disinfecting gants, le nettoyage des surfaces et des instruments de biosécurité cabinet, respectivement. solution d'ammonium quaternaire désinfectant à la concentration indiquée est considéré comme l'étalon-or pour tous les Etats-Unis BSL-4 laboratoires (Barr J, communication personnelle, 2015). Les déchets solides à partir d'un seau à déchets est autoclavée pour éliminer toute possibilité de contamination.

Dans un effort pour démontrer visuellement le flux de travail et les limites des généraux BSL-4 procédures, nous avons utilisé un essai de plaque virale norme comme un exemple d'une procédure virale couramment utilisée. Alors que la procédure d'analyse virale est décrite en général, nous insistons sur les procédures de biosécurité utilisées pour assurer la sécurité du personnel de laboratoire dans ce protocole. S'il vous plaît se référer à classiques précédentes visualisations de dosage de la plaque pour le fond supplémentaire sur la technique dosage de plaque 8,9.

Les procédures présentées ici suivent les spécifications définies par BMBL CDC 1. Cependant, les protocoles sont présentésspécifique à l'IRF-Frédéric. Chaque BSL-4 installation a différentes procédures d'utilisation normalisées (SOP) et les méthodes de fonctionnement qui influent sur l'exécution d'expériences au sein du laboratoire BSL-4. D'autres procédures pour la gestion des flux de déchets et l'exécution des essais de plaque peuvent varier en fonction de la gestion et l'exploitation de ces laboratoires. Néanmoins, une compréhension générale de la mise en place d'un laboratoire et des procédures pour effectuer des travaux de classe II armoires à l'intérieur de l'environnement BSL-4 BSL-4 costume aidera les scientifiques à comprendre les contraintes et les implications de sécurité au moment d'envisager des études d'agents pathogènes à haut risque. Sensibilisation accrue des collaborateurs extérieurs des difficultés de travail dans un laboratoire BSL-4 entourant peut conduire à des attentes ajustées et une plus grande facilité dans le développement de contre-mesures médicales dans le milieu de la recherche.

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Protocol

1. Laboratoire d'entrée

  1. Rassemblez toutes les fournitures provenant d' un laboratoire BSL-2 pour l'expérience (par exemple, les cellules, les médias, et consommables) avant d'entrer dans le laboratoire BSL-4.
  2. Terminez la procédure d'entrée BSL-4 (décrite en détail dans la référence 7).

2. Préparation d'un cabinet de biosécurité de classe II dans le laboratoire BSL-4

  1. Une fois à l' intérieur du laboratoire BSL-4, assurer la liste de contrôle interne quotidienne (Figure 1) a été achevée. Remplissez la liste de contrôle si la liste de contrôle n'a pas été préalablement rempli et indiquer quels virus seront utilisés. Si la liste de contrôle a déjà été réalisée, ajouter le nom et qui virus seront utilisés pour la liste.
  2. Nettoyer le BSC classe II par pulvérisation vers le bas l'ensemble à l' intérieur du BSC (y compris le châssis) avec 5% de solution désinfectante double d'ammonium quaternaire (par exemple, le n-alkyl diméthyl benzyl ammonium , le chlorure de n-alkyl diméthyl benzyl ammonium éthylle chlorure ou un autre désinfectant approprié pour l'agent utilisé) et essuyez avec du papier absorbant 10,11. Pulvériser la solution d'éthanol à 70% à l'intérieur de l'armoire et le châssis pour enlever la solution désinfectante collant.
  3. Si vous êtes assis, réglez la chaise en face de la BSC classe II à une hauteur confortable pour veiller à ce que l'arrière de l'armoire peut être atteint et que la face du spécialiste de laboratoire est situé au- dessus de l'ouverture avant (Figure 2) 11.
  4. Préparer un récipient pour l'armoire de biosécurité. Faire en sorte que la concentration finale de la solution duale d'ammonium quaternaire de désinfectant dans le réservoir de déchets est pas inférieur à 5%. Planifier en conséquence et faire une solution à 10% à laquelle les déchets seront ajoutés qui va diluer le désinfectant. En outre, placer un flacon pulvérisateur avec double solution ammonium désinfectant 5% quaternaire dans le BSC Classe II pour pulvériser tous les éléments avant le retrait et les mains gantées pendant et après l'achèvement de l'essai.
  5. <li> Placez les matériaux appropriés nécessaires à l'ensemble de l' expérience dans le BSC Classe II aussi loin dans l'armoire que possible afin d' éviter l' introduction de matières répétées dans le BSC Classe II et la perturbation de l'écoulement d'air 11.

3. Exemple: Plaque Assay

  1. Récupérer des échantillons contenant le virus et le contrôle du virus de l'emplacement de stockage à la main et de dégel des matériaux dans un incubateur à 37 ° C.
  2. Etiqueter les puits des plaques de 6 puits à utiliser en fonction des dilutions virales prévues. Marquez les couvercles et le corps des plaques pour assurer l'appariement réussi si les couvercles et le corps sont séparés.
  3. Apportez des matériaux à partir des étapes 3.1-3.2 dans le BSC de classe II. Placez tous les articles qui n'ont pas ou ne veulent pas entrer en contact avec le virus d'un côté (côté «propre») et des déchets de l'autre côté (côté «sale»). Si possible, gardez «éléments propres» au moins 30 cm de distance de "objets sales" au cours des activités générant des aérosols 11.
  4. Travailler comme à proximité du centre intérieur de la classe II BSC que possible, comme le centre intérieur est conçu pour être la position la plus efficace de se protéger 11.
  5. Retirer 50 pi de virus de l'échantillon et le contrôle du virus et la placer dans 450 pi de milieu d'Eagle modifié par Dulbecco avec du sérum de veau fœtal à 2%. Procéder à faire des dilutions en série aussi loin que nécessaire (figure 3A).
  6. Pendant les dilutions, mélanger les échantillons de virus au moins 5 fois avec une pointe de pipette lentement et avec précaution, tout en essayant de minimiser la génération de bulles d'air dans les échantillons. Changer les embouts de pipette après chaque addition à la prochaine dilution bien.
  7. Dans la dernière dilution, après mélange l'échantillon 5 fois, jeter 50 ul d'échantillon de virus dans un conteneur de déchets pour assurer des volumes égaux de dilutions.
  8. Lors de l'élimination de conseils, rincer chaque pointe avec une solution désinfectante dans le seau de déchets pour décontaminer l'intérieur et à l'extérieur de la pointe avant expulsering pointe dans le seau à déchets.
  9. Une fois les dilutions sont faites, définissez les puits de dilution de côté et commencer à aspirer les médias à partir des puits de plaques de culture cellulaire, laissant 500 pi de milieu dans chaque puits d'une plaque à 6 puits.
  10. Lorsque vous avez terminé avec la pointe de la pipette, la solution aspirée désinfectant dans le seau de déchets vers le haut de la pipette à l'aide d'un manuel, volume réglable, bouton-poussoir pipetage, pour assurer une bonne décontamination de l'intérieur de la pipette. Laissez la pointe dans le seau de déchets jusqu'à la fin de l'expérience.
  11. Une fois que les médias ont été retirés des plaques, ajouter 100 pi de l'échantillon correct dans le puits approprié dans les plaques pré-étiquetés en double exemplaire, en changeant conseils chacun pour chaque échantillon.
  12. À la fin des inoculations d'essai de plaque, pulvériser sur les mains gantées avec la solution de désinfectant et utiliser une serviette en papier imbibé d'une solution désinfectante pour essuyer l'extérieur de toutes les plaques avant de placer les plaques de nouveau dans l'incubateur à la main. Rétourbe ce processus jusqu'à ce que toutes les plaques sont de retour dans l'incubateur.
  13. Roche les plaques dans un mouvement figure-8 pour assurer une bonne dispersion de l'échantillon sur les cellules toutes les 15 minutes pendant 1 heure.
  14. A l'issue de plaques oscillantes, le retour des plaques dans la BSC de classe II avec un mélange de milieu essentiel minimal de 2 x Eagle 1,6% tragacanthe, un revêtement semi-solide qui est plus facile à manipuler que l'agarose, utilisée pour la superposition de l'essai de plaque.
  15. Ajouter 2 ml de mélange de recouvrement à chaque puits dans une plaque à 6 puits et de la roche une fois de plus dans un mouvement figure-8 pour la distribution égale de la superposition sur toute la surface du puits. Répétez ce processus jusqu'à ce que chaque puits utilisé est superposé avec le mélange de recouvrement.
  16. Assurez-vous que la pointe de la pipette sérologique ne touche pas de liquide dans les puits pour éviter la contamination croisée lors de l'exécution de la procédure de recouvrement.

4. Élimination des déchets et nettoyage des instruments et la biosécurité Cabinet

<ol>
  • Immerger complètement tous les déchets dans une solution désinfectante à 5% dans le seau à déchets pendant une durée d'au moins 10 min de contact. Désinfecter embouts de pipette, pipettes sérologiques et d'autres déchets tel que décrit ci-dessus. En outre, vaporiser le seau à déchets (intérieur et extérieur) avec une solution désinfectante à 5% laisser la solution rester en contact avec le seau à déchets pendant une durée de 10 min de contact.
  • En attendant que le temps de contact à écouler pour les déchets, faire tremper une serviette en papier avec une solution désinfectante de 5%, essuyer des instruments tels que micropipettes et les retirer de la BSC. Pulvériser sur les mains gantées avec une solution désinfectante de 5% avant de mettre les mains gantées de la BSC de classe II.
    1. Après avoir enlevé les micropipettes de la BSC, essuyez-les avec une serviette en papier séparée avec une solution d'éthanol à 70% pour éviter l'accumulation collante sur les instruments. Pulvériser tous les instruments qui ne peuvent pas être efficacement essuyées avec 5% de désinfectant et laisser en contact avec la solution dans le BSC pendant 10 min.
  • Après un temps de contact suffisant, enlever tous les éléments du BSC. Prenez les articles, y compris seau à déchets contenant des matières résiduelles, à l'évier. Rincer les articles qui peuvent être réutilisés pour éliminer les résidus de désinfectant. Retour tous les éléments à leurs emplacements de stockage.
  • Nettoyer la surface de travail de la BSC Classe II, les côtés de l' armoire et à l' arrière, l' intérieur du verre, et le châssis 1 avec une solution désinfectante de 5% suivie d' une solution d'éthanol à 70%.
  • Tirez et drainent les pipettes sérologiques du seau et de placer les déchets en surface désinfectée pipettes sérologiques en barquettes de pipettes séparées pour autoclavage (pipettes sérologiques peuvent présenter un danger pour les objets tranchants et peuvent déchirer le sac poubelle. Placez ces pipettes dans un récipient à parois rigides avant autoclavage).
  • Verser le contenu du seau à déchets dans une passoire placée dans le fond de l'évier.
  • Apportez un conteneur de déchets biologiques dangereux qui est doublé d'un sac biohazard rouge pour l'évier et vider le contenu de la strainer dans le sac biohazard rouge. Ne pas mettre dans la passoire pour enlever des conseils micropipette qui peuvent coller à l'intérieur de la crépine. Frappez le filtre le long de l'intérieur du conteneur de déchets jusqu'à ce que tous les conseils sont supprimés, ou utiliser une paire de pinces à épiler pour retirer des conseils de la crépine.
  • Rincer le seau et le lieu des déchets à sécher sur la grille à côté de l'évier.
  • Déchets 5. autoclavage

    1. Retirer le sac biohazard du récipient et lieu de déchets biologiques dangereux dans un bac à autoclave sur un chariot.
    2. Laissez sacs Biohazard ouverte et placez un morceau de ruban autoclave sur l'extérieur du sac, reliant les côtés du plateau de l'autoclave pour maintenir le sac fixé dans le bac.
    3. Placez deux morceaux de ruban autoclave sur le plateau de pointe de la pipette sérologique et l'étiqueter avec ses initiales et la date. Placez le plateau de pipette sérologique sur le chariot avec le plateau de l'autoclave.
    4. Ouvrez l'autoclave. Connectez l'autoclave fourni de chargement / déchargement cart à l'autoclave et faire sortir la plate-forme de l'autoclave rétractable pour reposer sur le chariot.
    5. Retirer la tige métallique de l'autoclave et ouvrir la partie supérieure. Placez un flacon d'indicateur biologique contenant des spores de Geobacillus stearothermophilus dans la tige de métal pour vérifier que le cycle de stérilisation en autoclave a été achevé avec succès.
    6. Placer la tige métallique dans le centre du sac de déchets dans le bac de l'autoclave, mais faire en sorte que la tige métallique est toujours facilement accessible.
    7. Placez bac autoclave rempli de déchets et le bac de pipette sérologique sur la plate-forme de l'autoclave rétractable et le repousser dans l'autoclave.
    8. Détachez l'autoclave de chargement / déchargement panier de l'autoclave et fermer la porte de l'autoclave.
    9. Démarrez l'autoclave.
    10. Ne laissez pas l'autoclave jusqu'à ce que le cycle a commencé. L'écran de fonctionnement de l'autoclave indiquera le temps restant pour cette course.
    11. Après l'exécution de l'autoclave est terminée, retirez l'ind biologiqueicator et évaluer la croissance par chauffage dans un incubateur spécifié. Si la croissance est détectée sur l'indicateur biologique, ré-exécuter la poubelle dans l'autoclave, et d'évaluer de nouveau l'indicateur. Si aucune croissance est détectée, enlever la poubelle de l'installation.

    6. Exemple: Fixation et coloration de la plaque Assays

    1. Après le nombre approprié de jours (qui dépend du virus utilisé) est passé, retourner dans le laboratoire et effectuer les étapes des sections 1 et 2 encore une fois.
    2. Retirez délicatement les plaques d'essai de la plaque de l'incubateur terminé à l'étape 3.1.2, et la placer dans la classe BSC II à la main.
    3. Pipeter la totalité de la matière de médias et de recouvrement et distribuer en désinfectant conteneur de solution et le remplacer par un mélange de 10% du formol tamponné neutre et 0,8% de violet cristallisé 12,13. Laisser le mélange restent sur les plaques pendant 30 minutes pour inactiver le virus sur les plaques.
    4. Après inactivation, retirez soigneusement le neutremélange violet formaline / cristal tamponnée et placer dans un conteneur à déchets séparé pour être neutralisés avant d'être éliminés.
    5. Pulvériser sur les mains gantées de désinfectant et essuyez l'extérieur des plaques avant de les transmettre sur le BSC de classe II comme décrit ci-dessus.
    6. Passez à l'évier, rincer les plaques pour éliminer l'excès de colorant, puis placer les plaques sur un chariot pour sécher.
    7. Une fois les plaques sont complètement sèches, utilisez une boîte à lumière pour compter les plaques. Enregistrez tous les chefs et calculer les titres de virus de l'équation standard (figure 3B).

    7. Retrait des échantillons du laboratoire BSL-4

    1. Inactiver tous les échantillons qui seront manipulés sous BSL-2 conditions de laboratoire. Suivez l' une des deux méthodes approuvées par le bureau de la biosécurité interne à l'IRF-Frédéric en utilisant 10% de formaline neutre tamponnée (FBN) ou Trizol LS (phénol, guanidine isothiocyanate, le thiocyanate d' ammonium, l' acétate de sodium, le glycérol) 1,14. Transfert samples à un nouveau tube ou une plaque propre à l'extérieur du BSC avant l'emballage pour l'enlèvement du laboratoire BSL-4.
    2. Thermofixer échantillons inactivés dans des tubes ou des plaques dans une poche scellée à chaud contenant suffisamment de 5% ou une solution de désinfectant fixatif pour désinfecter l'intérieur du sac et l'extérieur des tubes échantillons soumis à un transfert hors du laboratoire BSL-4. Placez cette poche dans une autre pochette suivant même procédure.
    3. Sceller la seconde poche et placer la pochette thermosoudée dans une cuve d'immersion contenant une solution désinfectante à 5% pendant au moins 10 minutes pour désinfecter l'extérieur du sachet thermoscellé.
    4. Remplissez un carnet de réservoir de dunk à l'intérieur du laboratoire en délimitant le nombre et la taille des tubes, le volume dans des tubes, agent utilisé, la méthode d'inactivation utilisé, et une salle à l'endroit où les échantillons seront transférés.
    5. Coordonner avec un collègue à l'extérieur du laboratoire BSL-4 pour récupérer la poche du réservoir de dunk et de prélever des échantillons au laboratoire BSL-2.

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    Representative Results

    Après les procédures appropriées au sein du laboratoire BSL-4 sont essentiels pour assurer la réalisation sûre et efficace des tests. En se référant à la liste de contrôle interne quotidien rempli (figure 1), le personnel de laboratoire veiller à ce que l' équipement est pleinement opérationnel. Positionnement du corps dans le centre du BSC assure que l'expérience est réalisée dans des conditions d'écoulement d'air optimales (figure 2). L'échantillon de virus est dilué en série pour obtenir des plaques ayant des plaques par plaque 30-300 (figure 3A) et pour déterminer le titre viral (figure 3B). Un certain nombre de facteurs influent sur la formation de plaques, y compris le tropisme du virus pour les lignes de la cellule hôte, technique d'inoculation, les conditions de croissance du virus, la gamme de dilution appropriée, et la sélection de recouvrement 8. Les déchets générés dans le BSC au cours de la procédure est correctement désinfecté avant le retrait du BSC et de nouveau par autoclavage avantquitter l'environnement BSL-4. En suivant ces procédures, aucune infection acquises au laboratoire ont été enregistrés au cours de BSL-4 recherche à l'IRF-Frédéric.

    Figure 1
    Figure 1:. Exemple liste quotidienne des systèmes internes achèvement quotidienne de cette liste de contrôle veille à ce que le personnel de laboratoire a vérifié l' équipement au sein du laboratoire (surtout le BSC) avant d'entamer le travail. Si le BSC se trouve à l'extérieur de la gamme calibrée, ce BSC ne doit pas être utilisé, et l'entretien doit être notifiée. Tous les GCS doivent être correctement calibrés et le fonctionnement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2:. Retour et vue de côté d'un échantillon spécialiste de laboratoire de pipetage dans une enceinte de sécurité biologique de classe II (A) seau à déchets contenant une solution désinfectante jaune et pipettes utilisées sont à la droite des plaques de puits (B), et la bouteille de désinfectant de pulvérisation est de le droit de la benne à déchets (a). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3: Calcul du titre viral de l' échantillon Titre viral est exprimée en unités formant des plaques (pfu) par ml.. Pour calculer le titre viral, compter le nombre de plages bien définies (pfu) et diviser par le produit du facteur de dilution (d) fois le volume de virus dilué ajouté au puits (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    Travailler dans un laboratoire BSL-4 nécessite beaucoup de temps et une plus grande attention aux détails. Tout type de travail dans cet environnement nécessite bien formé, approfondie, et les personnes de conscience. Le dosage de plaque virale standard fournit un modèle précis d'une procédure commune pour travailler avec des agents pathogènes à haut conséquence dans le laboratoire BSL-4, que le test implique plusieurs concepts majeurs dans lesquels les travailleurs de laboratoire doivent être formés.

    Le premier concept majeur est l'utilisation et l'application des pratiques sécuritaires appropriée dans la classe II BSC, qui fonctionne comme confinement primaire pour les agents pathogènes à haut conséquence. La compréhension de comment fonctionne la classe II BSC dicteront les pratiques qui limitent considérablement les risques d'exposition aux particuliers. Le flux de travail à partir d' une zone propre ( "côté propre") à une zone contaminée ( "côté sale") à travers la zone de travail dans la classe II BSC contribue également à éviter la contamination croisée 11. matériaux et Suppl propres et contaminéss doivent être séparés pour limiter le mouvement des objets contaminés sur les articles propres.

    Le deuxième concept majeur est la gestion physique et biologique des déchets. Des étapes appropriées pour éliminer les deux types de déchets sont essentiels pour garantir que les spécialistes de laboratoire reste en sécurité et l'environnement ne sont pas contaminés. Les étapes au cours d'une expérience sont conçus pour inactiver et détruire les agents pathogènes avant que les échantillons sont mis en évidence de BSL-4 laboratoire. Des exemples de ces étapes critiques: pipetage désinfectant dans chaque pointe, ce qui permet au moins un temps de contact de 10 min de matériaux potentiellement contaminés avec des désinfectants, des déchets d'autoclavage, et la validation de la stérilité au cours des cycles autoclave. Ces étapes sont conçus pour être redondants pour assurer la destruction des agents pathogènes à haut conséquence.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

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