Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Microglial fagocytos är avgörande för upprätthållandet av vävnad homeostas och otillräcklig fagocytos har varit inblandad i patologi. Men bedömningen mikroglia funktion in vivo är tekniskt utmanande. Vi har utvecklat en enkel men robust teknik för exakt övervakning och kvantifiering av fagocytiska potential mikroglia i en fysiologisk miljö.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Murinello, S., Moreno, S. K., Macauley, M. S., Sakimoto, S., Westenskow, P. D., Friedlander, M. Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay. J. Vis. Exp. (116), e54677, doi:10.3791/54677 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att noggrant bedöma och kvantifiera in vivo microglial fagocytos. Mikroglia är de vävnads residenta makrofager i det centrala nervsystemet (CNS). De utför en mängd olika funktioner för att säkerställa upprätthållandet av vävnad homeostas. Dessa inkluderar immunövervakning, utsöndring av neurotrofa faktorer och av central betydelse, fagocytos en. Microglial fagocytos är nyckeln i flera viktiga händelser under utvecklingen av hjärnan och näthinnan, såsom fagocytos av irrelevanta synapser (synaptiska beskärning) och borttagning av apoptotiska neuroner 2-4. Dessutom har microglial fagocytos av skadade eller apoptotiska neuroner, cellrester och invaderande mikroorganismer visat sig vara avgörande för att upprätthålla CNS homeostas genom vuxenlivet 5. Slutligen har microglial fagocytos varit inblandad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom och åldersrelateradmacular degeneration, där det har föreslagits att defekt eller otillräcklig fagocytisk kapacitet kan bidra till uppbyggnaden av amyloid-beta (Ap) plack och drusen respektive 6,7.

Microglial funktion är hårt reglerad av deras mikromiljö, i synnerhet genom lösliga faktorer såsom tumörtillväxtfaktor β eller cell-cell-interaktioner. Neuroner konstitutivt uttrycker flera cellytligander, såsom CD200 och CX3CL1, medan mikroglia uteslutande uttrycka respektive receptorer CD200R och CX3CR1. Dessa receptorer innehåller immunoreceptor tyrosin-baserad inhibitionsmotiv (ITIMs) i deras intracellulära del. Dessa inhibitor receptorer är kritiska för att förhindra överstimulering av mikroglia, som kan bidra till neuroinflammationen. Således, under normala fysiologiska förhållanden, interaktioner cell-cell mellan neuroner och mikroglia hålla mikroglia i ett vilotillstånd. Under vävnadsskada dock neuroner kan nedreglera expression av dessa ligander, ta bort deras hämmande effekt på mikroglia aktivering. Microglial funktion (inklusive fagocytos) är således tätt kopplat till deras mikro 8. Ändå hittills finns det inga standardiserade analyser för att studera mikroglia fagocytos i en fysiologisk sammanhang eller på ett sätt som till fullo replikerar deras CNS mikromiljö.

Flera analyser har utvecklats för att mäta fagocytisk aktivitet av mikroglia in vitro, där primära mikroglia eller mikroglia cellinjer odlas med målceller (t.ex. apoptotiska neuroner) eller fluorescerande pärlor. Target upptag sedan utvärderas med hjälp av fluorescerande avbildning mikroskopi eller flödescytometri 9-12. Dessa analyser medger testning av hur farmakologisk eller genetisk manipulation kan påverka microglial fagocytos och samtidigt informativt, inte helt replikera komplexet in vivo miljö. Indirekta metoder för att undersöka microglial fagocytosin vivo har rapporterats: dessa uppnås genom färgning av molekyler som tros vara inblandade i fagocytos (t.ex. CD68), bedöma fysisk närhet av mikroglia och mål för fagocytos (t.ex. nedsatt nervceller eller synaptiska element), eller genom immunhistokemisk detektion av fagocytisk mål inom mikrogliaceller (t.ex. AP) 13-17. Två studier har använt mer direkta metoder för att bedöma mikroglia fagocytos in vivo. Hughes och hans kollegor har använt avbildningstekniker för att mäta microglial upptag av pärlor som levereras via intrakraniell väg 18. Sierra et al. Utvecklat en förfinad metod för att kvantitativt bedöma mikroglia fagocytos av apoptotiska celler med användning av komplexa avbildningstekniker 4. Men dessa metoder involverar komplicerade protokoll för beredning vävnad, sektionering, bildframställning, och analys. Vi har tidigare använt flödescytometrisk analys för att bedöma fagocytos av fotoreceptor utER segment av retinala pigmenterade epitel (RPE) celler i odling 19. Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt bedöma upptag av fluorescerande partiklar av näthinnans mikroglia som ett kvantitativt mått på in vivo mikroglia fagocytos.

Protokollet beskriver vi här medger en tillförlitlig och kvantitativ mätning av retinal microglial fagocytos i knappt sex timmar i tre viktiga steg: (1) intravitreal leverans av fluorescerande partiklar, (2) skörd och beredning av retinal vävnad, och (3) flöde cytometrisk analys. Den metod vi har utvecklat är en robust metod för att bedöma microglial fagocytos i näthinnan, och det kan med fördel användas för att testa hur olika föreningar eller genmanipulation ändra denna nyckel microglial funktion i fysiologiska inställningar. Som ett specialiserat område av CNS, är näthinnan ett lättillgängligt modellsystem för att studera mikroglia funktionen 20. Även om denna metod har utvecklats i than öga, tror vi att det kan vara användbart för alla neuroforskare undersöker mikroglia fagocytos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samtliga djur behandlades i enlighet med de etiska riktlinjer som fastställts av Scripps Research Institute.

1. Beredning av material för injektion

  1. Sterilisera en 33 G-nål och spruta: isär och autoklav vid 115 ο C. Förbered nålar för injektion av stigande i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Tina fluorescensmärkta partiklar vid rumstemperatur under 5-10 min. Förbered partikelinjektionsvätska genom rekonstituering till en 50 mg / ml lösning i steril PBS med Ca2 + / Mg2 +.
    OBS: AF488-märkta partiklar av svampursprung som har validerats för fagocytos analyser används i detta protokoll 21-23. För optimal upptagning, förbereda partiklar färska och omedelbart före injektion.
    Not 2: Partikel koncentrationer kan optimeras för varje specifikt experiment.

2. intravitreal injektion av Bead Solution

Anmärkning Dubbel people krävs för att utföra injektionen, på ett sätt så att den person som utför injektionen kan hålla musen och bibehålla fokus på ögongloben, medan den andra personen passerar den laddade sprutan och skjuter kolven.

  1. Söva gnagaren genom intraperitoneal injektion av 100 mg / ml ketamin och 10 mg / ml xylazin i en dos av 20 | j, l / 10 g kroppsvikt. Före injektion, använder tå nypa för att bedöma graden av anestesi.
    OBS: Isofluran har en djupgående effekt på myeloid cellfunktion, alltså dess användning under denna analys bör undvikas 24,25.
  2. Belastning nål med 0,5 | j, l av fluorescensmärkt partikellösning.
  3. Lägga musen i sidled under ett operationsmikroskop (Figur 1A-B). Använd ett mjukt material, t.ex. en gel pack, för bättre positionering av musen. För unga möss där ögonen är ännu inte öppna, försiktigt öppna ögonlocken med hjälp av fina 45 o vinklade pincett genom att skapa en fissuåter längs slitsen som ögonlocken så småningom öppna.
    1. Med hjälp av fina 45 o vinklade pincett försiktigt applicera tryck runt ögonlocket, så att ögongloben dyker något ur vägguttaget. Hålla huvudet med två fingrar strax ovanför örat och genom dess käke och försiktigt sträcka huden parallellt med ögonlocken att hålla ögat något ur sockeln. Var noga med att inte förstå för nära halsen (Figur 1B).
  4. Punktera ögongloben, för in sprutans nål i hornhinnans limbus (där och sklera ansluta). Detta syns som en grå cirkel i pigmenterade möss. Dra in nålen något att utvisa en liten volym glasaktigt vätska och sedan injicera. Den person som utför injektionen bör försiktigt hålla musen med ena handen och nålen med den andra; den andra personen ska sakta driva kolven.
  5. Dra tillbaka sprutan långsamt. Applicera ögonfuktdroppar att hålla ögat hydrerad. </ Li>
  6. Låt gnagaren återhämta sig i en bur under en värmedyna och fortsätta att övervaka djuret. Om man arbetar med valpar, inte tillbaka djuret till en bur med andra djur varning tills den andas och kan spontan rörelse. Om man arbetar med vuxna, inte tillbaka gnagare till en bur med andra djur varning tills det återfår sternala bakåtlutad kroppsställning.

3. Skörd av näthinnevävnad

OBS: näthinnan vävnad från ögon inte injicerats med fluorescerande partiklar skall samlas som en kontroll för flödescytometrisk analys. Även om analysen kan utföras med hjälp av en enda näthinna, för bästa prestanda, två näthinnor bör slås samman.

  1. Samla retinal vävnad tre timmar efter intravitreal injektion av fluorescerande partiklar.
    OBS: Även om tiden efter injektion av partikellösningen kan optimeras för varje specifik experiment, fann vi att 3 timmar efter injektion, kan partikelupptag ses i hela flesta lager of näthinnan (Figur 1C-D).
  2. Offra möss genom cervikal dislokation.
  3. Samla ögonglober genom att försiktigt trycka mot ögonlocket med hjälp av fina 45 o vinklade pincett för att proptose ögongloben. Placera tången bakom ögongloben och dra.
  4. Dissekera näthinnan under ett dissektionsmikroskop. Överföra ögongloben till en petriskål med en liten mängd av PBS med Ca 2 + / Mg2 +. I ett torrt område av petriskålen, perforerar ögongloben i hornhinnans limbus med spetsen på superfina pincett.
  5. Håll ögongloben med hjälp av fina 45 o vinklade pincett och använda fjäder sax för att klippa runt hornhinnans limbus tills ungefär hälften av hornhinnans limbus omkrets skärs.
  6. Håll ögongloben med fina 45 o vinklade pincett och föra ögongloben i PBS. Med ett andra par av fina 45 o vinklade pincett riva kornea och sklera isär. Linsen och näthinnan kommer att komma ut intact.
  7. Separera linsen och näthinnan. Samla näthinnan och överför till en 5,4 ml polystyren provrör innehållande 2 ml PBS med Ca2 + / Mg2 +.

4. Förbered en enkelcellsuspension

  1. Förbered enkelcellsuspensioner med hjälp av en neuronal vävnad dissociation kit med smärre ändringar av tillverkarens anvisningar. Kortfattat, Mal sönder näthinnor genom pipettering upp och ned med en P1000 pipett och utför en enzymatisk digerering vid 37 ° C utan skakning.

5. Färgning Enkelcellsuspensioner för flödescytometrisk analys

  1. Resuspendera cellerna i 200 pl färgningsbuffert (Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning med 0,2% bovint serumalbumin (BSA) och 0,09% natriumazid) och överför till en U-bottnad 96-brunnsplatta. Centrifugera i 5 minuter vid 130 x g.
    OBS: Natriumazid är skadligt för människor och miljö. Använd lämplig personlig skyddsutrustning ennd kasta avfall i enlighet med lokala föreskrifter.
  2. Vänd plattan över ett handfat att kassera supernatanten. För att blockera Fc-receptorer, återsuspendera cellerna i 25 | il fläckbuffert innehållande 5 | j, g / ml av anti-mus CD16 / CD32-antikropp per brunn. Inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
  3. Tillsätt 25 | il färgningsbuffert innehållande 0,5 ^ g / ml av anti-mus Ly6C-APC-Cy7, 0,5 | j, g / ml av anti-mus Ly6G-Pe-Cy7 och 2,5 | j, g / ml av anti-mus-CD11b-AF650. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  4. Centrifugera i 5 minuter vid 130 x g. Vänd plattan kassera supernatanten. Tvätta genom återsuspendering celler i 200 pl färgningsbuffert.
  5. Centrifugera i 5 minuter vid 130 x g. Återsuspendera i 200 | il fläck buffert innehållande 0,5 | j, g / ml av propidiumjodid (PI). Överföring till 1,2 ml mikro-rör.
  6. Tvätta brunnarna med ytterligare 100 | il färgningsbuffert innehållande 0,5 ^ g / ml av PI och pool med de tidigare 200 ^ i1,2 ml mikro-rör. En total volym av 300 | il av färgade celler erhålls.

6. flödescytometrisk analys

  1. Med hjälp av en konventionell tre laser (violett, blått och röd laser), undvika PE, PerCP-Cy5.5, BV510 och PI färgämnen på grund av betydande spridningseffekter från de extremt ljusa fluorescerande AF488-partiklar. Använd fjärdedel (gul) laser för att optimera denna analys, eftersom det möjliggör en PE-märkta antikroppar och PI (i mCherry kanalen i stället för PerCP-Cy5.5 kanal) som ska användas (Figur 2).
    OBS: Om en gul laser är inte tillgänglig, använd en död cell uteslutning färgämne i en annan kanal.
  2. Gate på PI negativa celler (PI) för att utesluta döda celler (Figur 2B).
  3. Efter exklusive döda celler, gate på CD11b positiva celler (CD11b +), kommer detta att omfatta alla myeloidceller (figur 2C).
  4. Inom CD11b + befolkningen, grind på Ly6C - / Ly6G - att uteslutaneutrofiler (CD11b + / Ly6G +) och monocyter (CD11b + / Ly6C +; figur 2D). Efter gating på mikroglia (här definierat som CD11b + / Ly6C - / Ly6G - för enkelhets skull), bör två tydliga populationer vara synliga; en negativ och en positiv för fluorescerande partiklar. Fagocytiska celler kommer att ha tagit upp partiklar och är därför AF488 + (Figur 2E).
    OBS: Ly6C positiv eller Ly6G positiva populationer kan också analyseras för att mäta partikelupptag med hjälp av denna färgning metod. Procentandelen fagocytiska CD11b + celler korrelerar väl med andelen fagocytisk mikroglia (Figur 2F). För forskare utan flödescytometri erfarenhet, kan genomföras en enklare analys med CD11b färgning ensam, även om detta kommer att omfatta fagocytiska neutrofiler och monocyter samt mikroglia. Inom denna CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> befolkning, dessa celler är> 99% mikroglia såsom bedömdes genom färgning med markörerna F4 / 80 och CX3CR1; dessa markörer kan tillsättas men är inte nödvändig i våra händer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här beskriver vi en metod för att snabbt och tillförlitligt kvantifiera antalet fagocytiska näthinnans mikroglia i en fysiologisk miljö med hjälp av flödescytometrisk analys (Figur 2). Kan denna metod anpassas för att testa effekten av föreningar och / eller genetisk manipulation på fagocytiska kapacitet mikroglia (figurerna 3A, 3B). Den kan också användas i unga (10 - 20 dagar efter födsel) eller vuxna möss (figur 3C). Varierande doser av lipopolysackarid (LPS) administrerades intraperitonealt. 24 h efter LPS-utmaning, var det protokoll som beskrivs här används för att bedöma retinal mikroglia fagocytos (figur 3A). En dos av 1,42 mg / kg av LPS inducerade en statistiskt signifikant ökning i procentandelen av fagocytiska mikroglia i jämförelse med vehikelkontroll (figur 3B), vilket kunde förväntas 26.


Figur 1: intravitreal injektion Setup och representant retinal avsnitt visar fluorescerande partiklar i retinaskikt. (A) En gel pack är placerad under dissektionsmikroskop. (B) En gnagare hålls såsom visas för att positionera ögat för intravitreal injektion. (C) Tre timmar efter injektion fluorescensmärkta partiklar kan ses i hela mest retinaskikt. (D , E) CX3CR1 GFP / GFP möss och partiklar märkta med en röd fluorofor användes för att visualisera partikel upptag av mikroglia. Mikroglia i den djupare (D) och ytliga (E) skikten ta upp partiklar. Skala barer -. 20 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Gating strategi för att Välj fagocyterande mikroglia (A) Enstaka celler suspensioner från retinal vävnad från en p10 mus analyseras (B) Efter exklusive döda celler (PI +), (C) CD11b + celler selekteras (D) till... välj bara för mikroglia, CD11b + neutrofiler (Ly6G +) och monocyter (Ly6C +) är undantagna. (E) fagocyterande mikroglia kommer att ha tagit upp fluorescerande partiklar. (F) Antalet fagocytiska CD11b + celler är liknande den i mikroglia (CD11b + Ly6G - Ly6C -). n = 9, poolade från tre oberoende experiment; felstaplar representerar medelvärde ± SEM.rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Mikroglia fagocytos kan bedömas efter LPS Challenge och Pups och vuxna möss (A) Unga möss (P10) utmanades med intraperitoneala LPS vid varierande doser, 24 timmar innan bedömning fagocytos (B) Challenge med 1,42 mg /. kg resulterade i en signifikant ökad andel av fagocytisk retinal mikroglia jämfört med fordonskontroller (p = 0,0021). (C) Detta protokoll kan användas för att mäta retinal microglial fagocytos i pup och vuxna möss lika. Det är en betydligt mindre andel av fagocytisk mikroglia i vuxna möss jämfört med unga (P10) möss (p = 0,019) inte ifråga med LPS. n = 9 -12, poolade från tre till fyraoberoende test; felstaplar representerar medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns tre viktiga steg i denna metod: (1) intravitreal injektion av fluorescensmärkta partiklar; (2) skörd och beredning av retinal vävnad; och (3) flödescytometrisk analys. Vi rekommenderar att forskare öva intravitreala injektioner före utföra den metod vi presenterar här. Albinomöss (t.ex. BALB / c) och en färgad lösning (t.ex. fluorescensmärkta partiklar) kan användas för enkel visualisering av nålen och injicerade lösningen. Intravitreala injektioner är utmanande och om den inte utförs korrekt kommer att leda till snedvridna och varierande resultat. Vanliga problem som förknippas med dålig injektionsteknik är perforering av linsen och / eller skador på näthinnan, vilket kan resultera i blödning och inflammation. För att minimera risken för trauma för ögat, bör gnagaren vara i ett stabilt läge med minimal huvudrörelse. Att penetrera ögongloben, bör sprutan införas långsamt och inte pressas alltför långt för att undvika att slålinsen. En annan vanlig komplikation är återflöde av det insprutade materialet ut ur ögat. För att undvika detta bör kolven vara deprimerad långsamt och efter injektionen, bör ögongloben tillåtas att dra in i ögonhålan och sprutan ska dras tillbaka långsamt. De bästa intravitreala injektioner aktiverar mikroglia på låga nivåer, men tydliga skillnader mellan obehandlade och behandlade grupper kan mätas. Det är viktigt att lämpliga kontroller (t.ex. icke-utmanade möss) används i varje experiment för att fastställa baslinjen fagocytiska nivåer. En annan aspekt av denna metod som kräver praxis är det retinala dissekering. För att säkerställa jämförbara encelliga förberedelser över prover, måste retinal vävnad samlas snabbt och med minimal möjlig vävnad störningar. Utföra de sista stegen i dissektion i PBS (se 3,4-3,7) kommer att underlätta samlingen. Slutligen är det viktigt att förbereda näthinnevävnad för flödescytometri korrekt. Aktiverade mikroglia uppreglera Fcreceptorer och sålunda icke-specifik bindning till Fc-delen av antikroppar kan inträffa 7. En Fc-block måste utföras för att förhindra icke-specifik färgning. Val av lämpliga fluoroforer och ersättning inrättas är också viktigt 27.

Vi använder rutinmässigt möss åldern 10 till 20 postnatal dagar för dessa experiment. Dock kan detta protokoll också användas för att bedöma microglial fagocytos hos vuxna möss (Figur 3C). Notera, på grund av närvaron av den hyaloid kärl populationer av exogena myeloidceller (Ly6C + eller Ly6G +) är mer framträdande hos unga möss (ca 40 - 50% av alla CD11b + celler) än hos vuxna (cirka 5% av alla CD11b + -celler). Forskare bör fastställa åldern mest lämpliga för sina experiment. Protokollet presenteras här gör det möjligt för robust detektering av halterna av fagocytisk mikroglia i näthinnan. Vi rekommenderar dock att 3-4 biologiskal replikat användas i varje försök och att minst tre oberoende experiment utförs. Medan partiklarna som används i detta protokoll har validerats för fagocytiska analyser 21-23, om ytterligare verifiering krävs, kan utföras immunohistokemisk samlokalisering av partiklarna med specifika fagocytiska markörer.

En potentiell begränsning av denna metod är differentiell åtkomst av mikroglia till partiklarna. I normal näthinnan, mikroglia är bosatta i två lager, desto djupare yttre plexiformskiktet, och mer ytliga inre plexiform lager, vilket är närmare glaskroppen 7. Vid stimulering, eller under åldrande, mikroglia kan migrera genom alla retinaskikt. I denna metod, är fluorescensmärkta partiklar injiceras i glaskroppen. Tre timmar efter injektionen resulterar detta i partikelansamling i hela näthinnan och i synnerhet längs vitreal ytan. Forskare kan ytterligare optimera concentratipå partiklar eller tid efter injektion för sina experiment. Det är troligt att mikroglia i närmare närhet till glaskroppen kommer att ha lättare tillgång till partiklarna. Ändå visar vi att partiklarna sprids över näthinnan och tas upp av mikroglia i alla lager men inte i retinala pigmenterade epitel (RPE) -celler, förmodligen på grund av begränsad pärla tillgång (Figur 1C-E). Vi har ännu inte avgöra om subretinal mikroglia (som kan ackumuleras med åldern) skulle få tillgång till partiklarna. Om detta är viktigt för forskaren, kan detta protokoll utföras efter noggrann subretinal injicering av partiklarna. En annan viktig faktor är att det kan vara naturligt olika beteenden mellan retinal mikroglia och mikroglia i andra regioner i CNS. Det är väl känt att specifika delar av hjärnan har olika benägenhet till sjukdom. Till exempel, i Parkinsons sjukdom, neuroner i substantia nigra mest påverkas, medan i AlzHeimer sjukdom, är hippocampus neuroner främst påverkas 28. Således, när man studerar patologin för en specifik sjukdom, kommer sannolikt att vara en viktig faktor hjärnregion. Ett liknande protokoll till den som beskrivs här kan utföras efter intrakraniell injektion för att utforska potentiella skillnader i fagocytiska svar mellan näthinnan och hjärnans mikroglia. Näthinnan har många gemensamma drag med andra regioner i hjärnan, inklusive förekomsten av en blod retina-barriären 20. Retina mikroglia och hjärna mikroglia härstammar från samma gulesäcks stamceller och verkar mycket likt vad gäller morfologi och cellytan markör uttryck 7,29. Dessutom flera hjärnsjukdomar (t.ex. Alzheimers sjukdom, stroke och multipel skleros) har okulära manifestationer, vilket indikerar att näthinnan är också påverkas 20. Medan forskare bör vara medveten om potentiella regionala skillnader, vi tror att detta är en informativ modell föralla mikroglia forskning, och föreslår att alla neuroforskare som studerar microglial fagocytos kan använda detta protokoll.

En distinkt fördel att utföra denna analys i ögat är att multipla tekniker har utvecklats för att inducera olika neurogena påkänningar i näthinnan, och de stressreaktioner kan övervakas in vivo och kvantifieras med användning av standardiserade protokoll 30. Genom att framkalla neurogen stress och sedan utföra analysen som beskrivs här, kan forskarna analysera mikroglia funktion över ett brett spektrum av förolämpningar som varierar i svårighetsgrad. Slutligen, när de kombineras med flödescytometri sorteringstekniker, har detta protokoll den fördelen framför immunohistokemi att det kan möjliggöra fördjupad analys av fagocytisk mikroglia (t.ex. qPCR, cellkultur, proteomik).

Upptag av partiklar har tidigare använts för att mäta fagocytos, både i in vitro och in vivo-system. LAtter inblandade intrakraniell injektion av partiklar, skörd och frysning av hjärnvävnad, cryosectioning, immunfärgning, imaging och efter bildanalys 18. Protokollet presenteras här möjliggör en mycket snabbare kvantifiering av retinal mikroglia fagocytos. Det har den fördelen framför in vitro-system som de mycket känsliga mikroglia inte avlägsnas från deras mikromiljö, vilket möjliggör bedömning av fagocytos i en fysiologisk kontext. Specifikt bör den möjliggöra testning av hur defekter i andra celltyper (t.ex., genetiska ablation av gener i neuroner) påverkar mikroglia fagocytos. Det har också den fördelen framför tidigare in vivo-analyser att den använder flödescytometri, vilket möjliggör snabb, kvantitativ, och korrekt diagnos av fagocytiska cellpopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Nikon Discontinued
Hamilton syringe, 600 series Sigma 26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o Hamilton 7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific Z-23373 Prepare immediately before injection
DPBS Corning 21-030-CV
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Need two
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-10 Curved
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons Miltenyi Biotec 130-094-802
5 ml Polystyrene Round-bottom Tube Falcon 352054
96 well U-bottom plate Falcon 353077
Stain Buffer (BSA) BD Biosciences 554657
CD11b-BV650 Antibody BioLegend 101259
Ly6C-APC-Cy7 BioLegend 128025
Ly6G-PE-Cy7 BioLegend 127617
Propidium Iodide BD Biosciences 556463
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody BioLegend 101301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7, (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. 429501 (2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics